conf5sb2

Доступен только на StudyGur

Скачиваний: 8
Страниц: 464
Опубликован:
ЧИТАЙТЕ ПОЛНЫЙ ТЕКСТ ДОКУМЕНТА

ПРЕДПРОСМОТР

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Воронежский государственный университет»
ПУТИ И ФОРМЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ.
ПОИСК НОВЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
МАТЕРИАЛЫ 4-й ВСЕРОССИЙСКОЙ
С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ
НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ
«ФАРМОБРАЗОВАНИЕ 2010»
Часть II.
Научные основы создания новых
лекарственных средств
20-22 апреля 2010 г.
Воронеж
Под общей редакцией С.А. Боевой
«ПУТИ И ФОРМЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО
ОБРАЗОВАНИЯ. ПОИСК НОВЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ» : материалы 4-й всероссийской с международным участием
научно-методической конференции «Фармобразование 2010». Часть II.
«Научные основы создания новых лекарственных средств». – Воронеж :
Воронежский государственный университет, 2010. – 462 с.
© Воронежский государственный
университет, 2010
2
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА РАЗРАБОТАННЫХ СУППОЗИТОРИЕВ
ПРОТИВОГРИБКОВОГО ДЕЙСТВИЯ
Автина Т.В. e-mail: [email protected]
Курский государственный медицинский университет
Для лечения вагинального кандидоза нами разработаны состав и
технология суппозиториев с антимикотиком флуконазолом.
Целью дальнейших исследований явилось проведение их стандартизации.
Для этого методом выливания было приготовлено несколько серий
суппозиториев и осуществлена оценка качества в соответствии с ОСТ
91500.05.001-00 по следующим критериям – описание, подлинность, средняя
масса и отклонения от нее, температура плавления, температура полной
деформации, размер частиц, количественное определение, микробиологическая
чистота и биоцидная активность.
По внешнему виду суппозитории имеют одинаковую торпедовидную
форму, однородные (определяли визуально на продольном срезе на отсутствие
вкраплений), белого цвета, с гладкой поверхностью.
Среднюю массу определяли взвешиванием двадцати суппозиториев с
точностью до 0,01 г. Отклонения в средней массе не превышают ± 5% и
находятся в пределах от 1,425 г до 1,575 г.
Температуру плавления суппозиториев определяли по методике ГФ XII
изд. (ОФС 42-0034-07). Данный показатель находится в пределах (35,5 –
36,5)°С.
Время полной деформации изучали по методике ГФ XI изд. Установлено,
что оно не превышает пятнадцати минут, что соответствует требованиям
нормативной документации.
Для определения значения рН готовили 10% водное извлечение из
суппозиториев с флуконазолом, измерение проводили потенциометрически на
потенциометре «Анион – 4100». Как показал проведенный анализ, результаты
значений рН составляют от 7,0 до 8,0.
При изучении таких показателей, как температура плавления, время
полной деформации и значение рН установлено, что введение
противогрибкового агента в основу не оказывает влияния на исходный
показатель основы, взятой для приготовления суппозиториев.
Как известно, биофармацевтическая доступность из суппозиториев во
многом определяется размером частиц дисперсной фазы. Результаты
дисперсионного анализа показали, что преобладают фракции частиц
флуконазола до 10 мкм (60%), в лекарственной форме присутствуют частицы с
размером до 30 мкм, что вполне соответствует требованиям, предъявляемым к
данной лекарственной форме.
Установление подлинности изучаемого противогрибкового средства
осуществляли
методами
УФ-спектрофотометрии
и
тонкослойной
хроматографии.
3
УФ-спектр активного компонента, полученный извлечением его из
суппозиториев 0,1М раствором хлористоводородной кислоты, идентичен
спектру поглощения стандартного раствора флуконазола в диапозоне волн от
200 до 400 нм и имеет одинаковые максимум при длине волны (261±1) нм.
Подлинность флуконазола подтверждали также методом тонкослойной
хроматографии. Для этого на линию старта микрошприцом наносили 0,01 мл
метанольной вытяжки из суппозиториев и помещали в камеру, насыщенную
смесью растворителей этилацетат : изопропиловый спирт : раствор аммиака
концентрированный (8:7:3). Детекцию зон адсорбции флуконазола проводили в
УФ-свете. На хроматограмме наблюдается пятно лекарственной субстанции.
Результаты количественного анализа противогрибкового средства,
полученные методом спектрофотометрии, показали, что его содержание
находится в пределах от 0,142 г до 0,158 г и укладывается в допустимые нормы
отклонения.
Используя метод мембранной фильтрации, описанный в ГФ XII изд,
изучали микробиологическую чистоту суппозиториев. Результаты показали,
что общее число аэробных бактерий и грибов не превышает допустимых
значений.
Методом диффузии в агар определена противогрибковая активность
суппозиториев в отношении грибов рода C. albicans.
Кроме указанных, нами предложен еще один показатель с
использованием прибора «Вращающаяся корзинка» – тест «Растворение». При
скорости вращения корзинки 100 оборотов в минуту и продолжительности
эксперимента 15 минут в акцепторной среде обнаруживается не менее 80%
флуконазола.
Таким образом, разработанные нами на жировой основе суппозитории с
флуконазолом по показателям качества соответствуют требованиям
нормативной документации.
4
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РАЗРАБОТАННЫХ СУППОЗИТОРИЕВ
С ФЛУКОНАЗОЛОМ ПО ПОКАЗАТЕЛЮ
«КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ»
Автина Т.В., Панкрушева Т.А., Покровский М.В.
e-mail: [email protected]
Курский государственный медицинский университет
За последние десятилетия клиническую значимость приобрела проблема
вагинального кандидоза, частота которого в последние годы возросла в два раза
и составляет, по данным разных авторов, от 26 до 45% в структуре
инфекционной патологии нижнего отдела половой системы [1]. Поэтому
становится
несомненной
актуальность
поиска
новых
субстанций
противогрибкового действия и создания на их основе терапевтически активных
лекарственных форм.
В последние годы достаточно надежными и эффективными
зарекомендовали себя антимикотики, относящиеся к группе триазольных
соединений. Среди них особое место занимает флуконазол, оказывающий
ингибирующее действие на грибковые ферменты [2].
Для лечения вагинального кандидоза нами были разработаны составы
суппозиториев, включающие в себя данную субстанцию. Суппозитории
готовили методом выливания с содержанием флуконазола из расчета 0,15 г на
один суппозиторий.
Одним из важных показателей оценки качества исследуемой
лекарственной формы является количественное содержание активного
компонента. В связи с чем, целью исследования явилась разработка методики
количественного определения флуконазола в суппозиториях.
Известны различные методы количественного определения флуконазола
в субстанции и в лекарственных формах. Так, в нормативной документации на
флуконазол предложен метод неводного титрования, который является весьма
сложным в исполнении [3].
При анализе количественного содержания противогрибкового средства в
капсулах используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии,
который требует на свою реализацию высоких материальных затрат. При
нормировании показателя «Однородность дозирования» этой же лекарственной
формы (капсулы) применяют метод спектрофотометрии в ультрафиолетовой
области [4]. Данная методика, как одна из доступных и простых в исполнении,
была нами модифицирована и применена в дальнейшем для количественного
определения противогрибкового средства в разработанных суппозиториях.
Учитывая свойства растворимости флуконазола (легко растворим в
метаноле, умеренно растворим в этаноле 96%, растворим в 0,1 М
хлористоводородной кислоте, мало растворим в воде), извлечение из
суппозиториев проводили 0,1 М хлористоводородной кислотой. Измерения
выполняли на фоне растворителя (0,1 М раствор соляной кислоты), так как
5
предварительные исследования показали, что компоненты основ не поглощают
в максимуме абсорбции флуконазола.
В качестве стандарта при разработке методики количественного
определения использовали флуконазол Eur Ph CRS.
Приготовление испытуемого раствора. В коническую колбу помещали
один суппозиторий массой 1,5 г (точная навеска), приливали 30 мл 0,1 М
раствора кислоты хлористоводородной, нагревали до 60°С и интенсивно
перемешивали добиваясь полного растворения основы и экстрагирования
флуконазола. Неохлажденный раствор фильтровали в мерную колбу
вместимостью 50 мл и доводили до метки 0,1 М раствором кислоты
хлористоводородной, при этом несколько раз промывая фильтр. Колбу с
содержимым охлаждали до комнатной температуры, доводили до метки 50 мл и
перемешивали.
1 мл полученного фильтрата помещали в мерную колбу вместимостью 25
мл, доводили до метки раствором 0,1 М кислоты хлористоводородной,
перемешивали, фильтровали через фильтр синяя лента, отбрасывая первые
порции фильтрата.
Приготовление раствора рабочего стандартного образца. В мерную
колбу вместимостью 50 мл помещали 0,15 г флуконазола (точная навеска),
прибавляли 30 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, перемешивали
до полного растворения вещества, доводили тем же растворителем до метки и
перемешивали.
1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25
мл, доводили до метки раствором 0,1 М кислоты хлористоводородной,
перемешивали, фильтровали через фильтр синяя лента, отбрасывая первые
порции фильтрата.
Оптическую плотность полученных растворов измеряли в максимуме
поглощения при длине волны 261 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм.
Содержание флуконазола рассчитывали в пересчете на среднюю массу
суппозитория, в граммах.
Проведенный
количественный
анализ
флуконазола
методом
спектрофотометрии позволил определить, что его содержание в суппозиториях
находится в пределах от 0,142 г до 0,158 г и укладывается в допустимые нормы
отклонений.
Таким образом, модифицированная нами методика количественного
определения флуконазола позволяет оценить качество разработанных
суппозиториев по одному из утвержденных нормативной документацией
показателю – «Количественное определение».
Литература
1 Мирзабалаева, А.К. Кандидоз гениталий и бактериальный вагиноз в
практике акушера-гинеколога / А.К. Мирзабалаева, Ю.В Долго-Сабурова //
Проблемы медицинской микологии. – Т.6. – №3. – 2004. – С.18-24.
6
2. Тихомиров, А.Л. Варианты терапии острого и хронического
рецидивирующего кандидозного вульвовагинита / А.Л. Тихомиров // Инфекции
в гинекологии. – Т.7. – №3. – 2005. С.23-28.
3. ФСП 42-10217-05.
4. ФСП 42-7685-07.
7
ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ
И ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
Агарков А.А., Попова Т.Н., Искусных И.Ю. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Известно, что большинство патологических процессов, в том числе и
токсический гепатит, протекает на фоне образования активных форм
кислорода. Образующиеся радикалы обладают высокой реакционной
активностью и способны эффективно взаимодействовать как с белками и
липидами, так и с нуклеиновыми кислотами, инициируя свободнорадикальное
окисление (СО) [1]. В ответ на это происходит активизация антиоксидантной
системы (АОС) клетки.
Токсический гепатит, развивается под действием многочисленных
чужеродных химических веществ. К числу ксенобиотиков с наиболее высокой
степенью избирательной гепатотоксичности относятся хлорированные
углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан.
[2].
Глутатионовая система принимает участие в реализации целого ряда
важнейших
физиологических
процессов.
Так,
глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является
важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма [3],
поддерживающим на стационарном уровне интенсивность протекания СО [4].
Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих
обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся
основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции
Фентона в присутствии ионов Fe2+ [5].
ГР (КФ 1.6.4.2) – распространенный флавиновый фермент,
катализирущий обратимое НАДФН-зависимое восстановление окисленного
глутатиона [6].
Учитывая, что большинство известных патологических состояний
сопровождаются усилением СО, повреждающим белковые структуры,
молекулы ДНК и липидов [7] и ослаблением активности АОС, весьма
актуальной представляется оценка состояния этих систем с целью ранней
диагностики и обоснованного лечения заболеваний.
Целью настоящей работы явилось исследование количественной
экспрессии ГР из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом
гепатите (ЭТГ).
В качестве объекта исследования использовались самцы белых
лабораторных крыс (Rattus rattus L.) массой 150-200г, содержащиеся на
стандартном режиме вивария. Для индукции токсического повреждения печени
использовали однократное пероральное введение 33% раствора ССl 4 в
вазелиновом масле из расчета 64 мкл на 100 г веса животного [8].
8
Изучение экспрессии гена ГР в печени крыс в норме и при ЭТГ
проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора
фирмы «Cинтол», содержащего интеркалирующий краситель SYBR Green I.
Эксперимент осуществляли в несколько этапов: экстракция тотальной РНК
тризоловым методом, процесс удаления примеси геномной ДНК из выделенной
тотальной РНК, обратная транскрипция и ПЦР- амплификация в режиме
реального времени на приборе АНК-32. Тотальную РНК выделяли с помощью
набора YellowSolve (фирма Клоноген, С.-Петербург). Полученный осадок РНК
растворяли в 50 мкл деионизованной DEPC-Н2О, содержащей 1 единицу
РНКазина. Раствор прогревали при 60оС 5 мин и использовали для
электрофореза в 1% агарозном геле в присутствии формальдегида. Выделенные
препараты тотальной РНК, обработанные ДНКазой I, использовали для синтеза
кДНК. В ходе реакции обратной транскрипции 5 мкг тотальной РНК отжигали
с 1мкл олиго(dТ)18 (0,5 мкг/мкл) при 70о С в течение 5 мин. После этого
пробирку помещали в лѐд и добавляли в следующем порядке: 4 мкл 5х-ОТ
буфер, 1 мкл RiboLock™ (20 мкл/мкл) и 2 мкл 10 мМ смеси дНТФ. Далее смесь
инкубировали при 37оС в течение 5 мин и добавляли 2 мкл M-MuLV обратной
транскриптазы (20 единиц/мкл) до конечного объѐма 20 мкл. Смесь
инкубировали при 37оС в течение 60 мин. По истечении времени реакцию
останавливали посредством нагревания при 70оС в течение 10 мин.
Полученную кДНК использовали для амплификации в режиме реального
времени. Параметры ПЦР реакции были следующие: 95о С – 5 мин, затем 40
циклов: 95оС – 30 c, 60оС – 50 c. Для определения уровня транскриптов гена ГР
и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГДФДГ; house-keeping gene)
использовали праймеры фирмы ―ДНК-синтез‖.
Оценка уровня экспрессии с гена глутатионредуктазы в норме и при
токсическом гепатите осуществлялась с помощью программы «qgene» [9].
Расчет разницы экспрессии с учетом порогового цикла для ГДФДГ и значений
эффективности амплификации показал, что при ЭТГ происходит увеличение
уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3,0 раза относительно нормы.
Согласно литературным данным показано, что в ответ на развитие
окислительного стресса в условиях гипероксии индукция синтеза ГР
наблюдается у дрозофилы [10], увеличивается экспрессия гена ГР Haynaldia
villosa и Xanthomonas campestris [11,12]. Этот факт может способствовать
продлению жизни особей в данных условиях, обеспечивая большую
резистентность к пероксиду водорода.
Очевидно, возрастание экспрессии ГР связано с еѐ участием в
поддержании
определенного
пула
GSH,
необходимого
как
для
непосредственного лимитирования образования СР, так и для более
интенсивного функционирования ГП-реакции в условиях окислительного
стресса.
9
Литература
1. Johnston D.E. Mechanism of early carbon tetrachloride toxicity in cultured
rat hepatocytes / D.E.Johnston, C. Kroening // Pharmacol. Toxicol. – 1998. – V.83,№
6. – P.231-239.
2. Balance between oxidative damage and proliferative potential in an
experimental rat model of CCl4 – induced cirrhosis: protective role of adenosine
administration / R. Hernandez-Vunoz [et al.] // Hepatology. – 1997. – V.26, №5. –
P.1100-1110.
3. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252с.
4. Шишкина Л.Н. Связь повреждения мембраны с процессом перекисного
окисления липидов при слабых воздействиях / Л.Н. Шишкина, М.А. Смотряева
// Биохимия. - 2000. - Т.45, №5. - С.844-852.
5. Skulachev V.P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation
/ V.P. Skulachev // Bioscience Reports. - 1997. - V.17. - P.347-366.
6. Карпищенко А.С. Медицинская технология и лабораторная
диагностика: Справочник в 2 т. Т.1. Медицинские и лабораторные технологии /
А.С. Карпищенкою - СПб: Интермедика, 1999. – 650 с.
7. Kowaltowski A.J. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative
stress / A.J. Kowaltowski, A.E. Vercesi // Free Radical Biology & Medicine. - 1999.
– V. 26. – P. 463-471.
8. Сидорова В.Ф. Регенерация печени у млекопитающих / В.Ф. Сидорова,
З.А. Рябинина, Е.М. Лейкина. - Л.: Медицина, Ленинградское отд-ние, 1966. 210 с.
9. Processing of Gene Expression Data Generated by Quantitative Real-Time
RT-PCR / P. Y. Muller [at al.] // BioTechniques. – 2002. – V. 32, №6. – Р.354-360.
10. Robin J. Mockett оverexpression of glutathione reductase extends survival
in transgenic Drosophila melanogaster under hyperoxia but not normoxia / J.R.
Mockett, S.S. Rajindar, C.O. William // The FASEB J. – 1999. – V. 13. - P. 17331742.
11. Plastidial glutathione reductase from Haynaldia villosa is an enhancer of
powdery mildew resistance in wheat (Triticum aestivum) / Ya-Ping Chen [et al.] //
Plant Cell Physiol. – V. 48, № 12. – 2007. – Р. 1702–1712.
12. The unique glutathione reductase from Xanthomonas campestris: gene
expression and enzyme characterization / S. Loprasert [et al.]. // Biochem. Biophys.
Res. Commun. – 2005. – V. 331. – P.1324–1330.]
10
ИСТОРИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛЬГОТНОГО
ЛЕКАРСТВЕННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ
Акиньшина Н.И., Махинова Е.Н., Акиньшина Е.А.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Лекарственное обеспечение рассматривается как составная часть
медицинской помощи и предоставляется на всех этапах оказания медицинской
помощи
(амбулаторной,
госпитальной,
скорой
медицинской
и
высокотехнологичной помощи). При этом учитываются интересы всех
категорий населения и в особенности наиболее социально незащищенных слоев
населения.
Цель: дать характеристику периодам и моделям льготного
лекарственного обеспечения населения, существующим в системе
государственных гарантий социальной защиты.
Проблемы льготного лекарственного обеспечения остро обозначились в
начале 90-х годов. Реформирование социально-экономической сферы в 90-е
годы кардинально изменили ситуацию, прежде всего, в социальной сфере.
Реформы изменили не только экономику, но и отношение человека к новой
реальности, которая привела к переоценке фундаментальных ценностей и смене
системы приоритетов. Прежде всего, это вызвало появление в жизни общества
двух феноменов: социальной агрессии и снижения социальной активности
населения. В такой ситуации, как оказалось, неизбежны социальные
конфликты, усиливающийся эмоциональный стресс, агрессия и страх,
разрушающие здоровье человека и демографический кризис.
В условиях постоянного недофинансирования сферы здравоохранения
наблюдается перекладывание расходов на медицинские нужды на население.
Легальная и теневая оплата медицинских услуг и приобретение лекарственных
средств (ЛС) населением составляла, по разным оценкам до 45,0% совокупных
расходов государства на здравоохранение. Как показали социологические
исследования, среди госпитальных больных 76,5% пациентов оплачивали в
больницах стоимость ЛС. В такой ситуации в начале 90-х годов, по данным
литературы около 44,0% населения нашей страны нуждались в
государственной поддержке при получении медицинских и фармацевтических
услуг, т.к. более 70,0% покупок в аптеке совершалось за счет личных средств и
без того небогатого российского потребителя [1]. В этих условиях развитие
системы социальной защиты в РФ было ориентировано главным образом на
смягчение негативных социально-экономических последствий, экономического
спада, высокой инфляции и безработицы. В этот период число категориальных
льгот установленных федеральным законодательством превысило 150 видов. С
учетом же льгот и выплат, установленных на территориальном уровне, общее
число социальных выплат превысило 1000, а численность лиц, претендующих
на их получение, приблизилась к 100 млн. чел. В силу сложного
11
экономического положения большинство этих выплат фактически не
производилось, и по существу являлись нереальными обязательствами
государства.
Таким
образом,
назрела
необходимость
пересмотра
государственных гарантий оказания медицинской помощи населению.
Сектор здравоохранения был самым не реформированным в системе
российской экономики и социальной сфере. Начиная с 1995 г. начинают
внедряться новые модели льготного лекарственного обеспечения.Первая
модель льготного лекарственного обеспечения просуществовала с ноября 1995
г. по июнь 1998 г. Лекарственное обеспечение льготных категорий населения
осуществлялось через аптечные организации с последующим возмещением
страховыми компаниями денежных средств за медикаменты, отпущенные по
бесплатным и льготным рецептам врачей. Основным недостатком данной
системы был крайне сложный механизм финансовых расчетов, который привел
к возникновению самовоспроизводящей системы долгов бюджета перед всеми
участниками эксперимента.
Вторая модель была организована только в г. Москве и представляла
собой переходную форму льготного лекарственного обеспечения, при которой
декретированные группы населения обеспечивались по двум направлениям:в
Северном административном округе – через аптечные пункты, расположенные
в лечебно-профилактических учреждениях, уполномоченной фармацевтической
компанией ЗАО «СИА Интернейшнл Лтд»; в остальных административных
округах – через аптеки, которые закупали ЛС, предназначенные для льготного
отпуска, на государственных аптечных складах по договору комиссии.
Внедрение третьей модели льготного лекарственного обеспечения в
Москве началось в апреле 1999 г., когда право обеспечения декретированных
групп населения по льготным и бесплатным рецептам было передано восьми
уполномоченным фармацевтическим фирмам, выигравшим тендер.
Обе последние модели льготного лекарственного обеспечения не
получили распространения в регионах. Таким образом, здравоохранение
регионов в отношении лекарственного обеспечения декретированных групп
населения осталось в рамках первой модели, снабжаемой «бюджетнозависимым» сектором фармацевтического рынка [2].
В существовании системы гарантированного лекарственного обеспечения
населения России можно выделить определенные периоды, имеющие
принципиальные особенности, ограниченные временными рамками.
До 1991 г. – советский период, который характеризуется
административными принципами распределения льгот на ЛС.
С 1991 по 1993 гг. – период реформирования всей государственности,
характеризующийся практикой декларативного тотального бесплатного
медицинского обслуживания и практикой государственного дотирования.
С 1994 по 1998 гг. – период становления рыночной экономики,
характеризующийся упорядочиванием перечня групп населения и категорий
заболеваний при амбулаторном лечении которых ЛС и изделия медицинского
назначения отпускаются по рецептам бесплатно или с 50,0% скидкой.
С 1999 по 2004 гг. – период стабилизации рыночной экономики,
12
характеризующийся расширением перечня групп населения, получающих
государственную социальную помощь.
С 2005 г. – и по настоящее время – реформирование системы
здравоохранения и переход к системе монетизации льгот.
Одним из самых значительных и масштабных проектов реформирования
здравоохранения за последнее время на территории России стала программа
дополнительного лекарственного обеспечения (ДЛО), внедренная в 2005 г.. В
2008 г. она разделилась на 2 части: обеспечение необходимыми ЛС (ОНЛС) и
высокозатратные нозологии (ВЗН). Реформа лекарственного обеспечения в РФ
начатая в 2005 г. планировалась как медико-социальная с охватом более 20
миллионов человек и предусматривала предоставление ЛС на амбулаторном
этапе лечения. Теперь уже не только аналитики, но и сами чиновники говорят о
том, что программа не справилась с этими функциями. Сейчас она изменила
свою сущность и превратилась просто в социальную, которая обеспечивает
тяжелых хронических больных. Реализация программы была сопряжена со
многими материально-техническими трудностями и ресурсно-кадровыми
проблемами. Индикатором всех этих проблем стало отсутствие доверия
населения к программе и как результат – выход из программы граждан, для
которых она и предназначалась (рис. 1).
16
14,69
14
12
10
7,98
8
7,69
5,62
6
5,1
4,2
4
2
0
2005 год
2006 год
2007 год
2008 год
2009 год
2010 год
Рис. 1. Численность лиц отказавшихся от набора социальных услуг
(млн. человек)
Таким образом, становится очевидной необходимость видоизменения
системы льготного лекарственного обеспечения. Одним из прогнозов развития
программы является следующее: в перспективе останется около 3 млн человек,
имеющих полиморбидную патологию, требующую дорогостоящей постоянной
медикаментозной терапии, программу сократят, но расширят федеральные
закупки по ряду нозологий. Кроме этого правительство работает над
разработкой концепцией лекарственного страхования с включением широких
слоев населения.
13
Литература
1.
Андрианова
Г.Н.
Разработка
концепции
регионализации
фармацевтического рынка Тюменской области в переходный период: автореф.
дис. … д-ра фармац. наук: 15.00.01/ Галина Николаевна. Андрианова. – М.,
2001. – 48 с.
2.
Совершенстование лекарственного обеспечения населения РФ //
Ремедиум – 2003, № 3, 30-32 с.
14
РЕГИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ
ПО ВИЧ/СПИДУ НА ПРИМЕРЕ ЦЕНТРАЛЬНОГО
ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА
Алексеев И.В., Дремова Н.Б.
Курский государственный медицинский университет
В последние десятилетия большое значение уделяется медикосоциологическому мониторингу, который, по мнению организаторов
здравоохранения, является важным инструментом управления, так как
закономерности, выявленные в динамике многочисленных показателей
состояния здоровья населения, позволяют принимать оптимальные
управленческие решения с целью его улучшения. Представляет интерес
использование комплексных индикаторов, количественно характеризующих
популяционное
здоровье
территории,
социально-экономическую
эффективность здравоохранения, качество медицинской помощи. Для
ранжирования административных районов территориальных образований из
комплекса показателей формируются «индексы здоровья». Мониторинг этих
показателей позволяет выделить районы, отличающиеся наиболее плохим
здоровьем населения. В зависимости от полученных результатов
разрабатываются программы по стабилизации или улучшению состояния
здоровья на отдельных территориях [1].
ВИЧ в настоящее время – очень серьезное заболевание, для которого не
найдены пути излечения. По данным ВОЗ с момента начала эпидемии ВИЧ
передался почти 60 миллионам человек и 25 миллионов человек умерли от
заболеваний, связанных с ВИЧ. В разных странах данные показатели
отличаются в связи с различной эпидемиологической ситуацией. Поэтому
региональный эпидемиологический анализ представляет интерес, так как
позволяет увидеть тенденции распространения данного заболевания по
отдельным территориям.
В исследованиях Дрѐмовой Н.Б.(2007г) по федеральным округам России
показано, что в РФ наиболее благоприятная ситуация по ВИЧ/СПИДу,
установленная с помощью метода многомерных группировок, отмечается в
Дальневосточном, Уральском и Северо-Западном округах, а Центральный
округ занимает пятое место из восьми [2].
Целью наших исследований является анализ эпидемиологической
ситуации по ВИЧ/СПИДу в разрезе областей ЦФО (по данным на октябрь
2009г).
Объект исследования: статистическая информация по официально
утвержденным показателям характеристики эпидемиологической ситуации.
Метод: наблюдение, вариационная статистика, структурный анализ,
сравнительный анализ, ранжирование, метод многомерных группировок.
Результаты исследования.
15
Для исследования мы исключили из анализа регионы-мегаполисы:
Москву и Московскую область, так как они существенно отличаются от
остальных областей по множеству показателей.
Количество ВИЧ-инфицированных всего. В 16 областях Центрального
федерального округа по данным 2009г сложилась следующая ситуация.
Максимальное значение зарегистрировано в Тверской области (7196 чел.),
минимальное – в Липецкой области (387 чел.). В структурном анализе от
общего количества ВИЧ+ по Центральному федеральному округу (33868 чел.)
они занимают доли соответственно 20% и 1,08%. Из списка областей также
выделяются показатели у областей: Тульская (15,46%), Ивановская (13,69%),
доля которых свыше 10%. Доли остальных областей варьируют от 7,33% Разанской до 1,86% Курской области (данный показатель Воронежской области
составляет 2,37%).
Количество ВИЧ-инфицированных, из них умерло. Максимальное
значение зарегистрировано в Тульской области (888 чел.), минимальное – в
Курской области (30 чел.). В структурном анализе от общего числа умерших
ВИЧ+ занимают доли соответственно 21,47% и 0,73%. Из списка областей
также выделяются показатели Тверской (17,67%) и Рязанской (14,56%)
областей, доля которых превышает 10%. Доли остальных областей сильно
варьируют от 9,21% Ивановской области до 1,09% Липецкой области.
Количество больных СПИДом всего. Максимальное значение
зарегистрировано в Тверской области (257 чел.), минимальное – в Курской
области (5 чел.). В структурном анализе от общего числа больных СПИДом
занимают доли соответственно 25,15% и 0,49%. Из списка областей также
следует отметить показатели Тульской (22,8%) и Рязанской (12,33%) областей,
доля которых превышает 10%. Доли остальных областей варьируют от 7,44%
Ярославской до 0,68% Костромской областей.
Количество больных СПИДом, из них умерло. Максимальное значение
данного показателя зафиксировано в Тверской области (211 чел.), минимальное
– в Курской области (5 чел.) В структурном анализе от общего числа умерших
больных СПИДом занимают соответственно доли 25,15% и 0,6%. Из списка
областей также выделяются показатели Тульской (19,79%) и Рязанской
(15,02%) областей, доля которых превышает 10%. Доли остальных областей
варьируют от 5,96% Ярославской до 0,83% Костромской областей.
Каждый из вышеперечисленных показателей в определенной степени
влияет на общую ситуацию по ВИЧ/СПИДу, причем чем больше их значения,
тем хуже будет региональная ситуация. Учитывая необходимость включения в
комплекс различных показателей, для проведения многофакторного анализа мы
остановились на методе многомерных группировок на основе нормирования
(Шиган Е.Н.,1986), апробированном в исследованиях фармацевтического рынка
(Дрѐмова Н.Б.,1999,2007) [3,4].
Суть метода заключается в переводе абсолютных значений показателей,
имеющих разные единицы измерения, в преобразованные нормируемые
величины, позволяющие их суммировать. По сумме нормируемых величин
(НВ) проводится ранжирование, далее по сумме уже рангов определяется место
16
в общем прямом рейтинге. В нашем случае интерпретация полученных
результатов будет следующая: регион с меньшим рейтинговым значением НВ
будет иметь лучшую ситуацию по ВИЧ/СПИДу.
Технология расчетов выполняется в несколько этапов с использованием в
исследованиях программного обеспечения «Норма» для компьютерных
расчетов [4].
На первом этапе нами был выбран следующий перечень нормируемых
показателей: ВИЧ-инфицированные, всего; ВИЧ-инфицированные дети;
больные СПИДом, всего; больные СПИДом дети; дети, рожденные от ВИЧ+
матерей; умершие от ВИЧ-инфекции, всего; умершие от ВИЧ-инфекции дети;
умершие от СПИДа, всего; умершие от СПИДа дети [5].
На втором этапе производилось нормирование показателей ситуации по
ВИЧ/СПИДу, для чего абсолютные показатели делятся на соответствующие
нормируемые показатели (НП), таким образом, переводятся в нормированные
величины (НВ).
Третьим этапом осуществлялось ранжирование полученных НВ. Первый
ранг присваивался минимальной величине НВ, затем второй ранг большей
величине и т.д.
На 4 этапе мы определяли по каждой области сумму рангов НВ.
Пятым этапом было определение общего рейтинга в суммах рангов НВ.
Так, по 9 показателям ситуация по ВИЧ/СПИДу в 2009г. в самом лучшем
положении оказалась в Курской области – 1 место, 2 место занимает Липецкая,
3 – Белгородская, 4 – Костромская, 5 и 6 место делят Воронежская и Орловская
области, 7 и 8 – Брянская и Тамбовская области, 9 – Ярославская, 10 –
Смоленская, 11 – Владимирская, 12 – Рязанская, 13 – Калужская, 14 –
Ивановская области. Худшие показатели в Тульской – 15 место и Тверской – 16
место областях.
В итоге исследования можно констатировать, что метод многомерного
исследования позволяет службам, отвечающим за состояние ситуации с
ВИЧ/СПИДом, знать эпидемиологическую картину, которая усугубляется в
связи с переходом заболеваемости ВИЧ-инфекцией в стадию СПИДа.
Постоянный контроль является необходимостью, чтобы в определенной мере
сдерживать продвижение ВИЧ-эпидемии в Российской Федерации.
Литература
1. Решетников А.В. Медико-социологический мониторинг. Руководство
(2003) М., Медицина, 1048с.
2. Медико-социологический мониторинг ситуации с эпидемией
ВИЧ/СПИДа в Российской Федерации. Дремова Н.Б.(2007) ШАГИ
профессионал, 5, 47-57.
3. Шиган Е.Н. Методы прогнозирования и моделирования в социальногигиенических исследованиях (1986) М., Медицина, 208с.
17
4. Дремова Н.Б., Соломка С.В. Компьютерные технологии маркетинговых
исследований в медицинских и фармацевтических организациях (1999) Курск,
КГМУ, 150с.
5. Справка о ситуации ВИЧ-инфекции на 31 октября 2009 г. ШАГИ
профессионал, 6, 95-96.
18
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ
МАЗЕЙ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ
В ХИРУРГИИ ИНФИЦИРОВАННЫХ РАН КОЖИ
Алипов В.В.1, Боева С.А.2, Дзюба В.Ф.2, Лебедев М.С.1,
Райкова С.В.1, Шаповал О.Г.1 e-mail: [email protected]
1
Саратовский государственный медицинский университет
им. В.И.Разумовского
2
Воронежский государственный университет
В настоящее время применяется множество препаратов для местного
лечения инфицированных ожоговых ран. Перед хирургами стоит задача
подбора эффективных лекарственных средств, при этом выбор препарата
должен основываться как на особенностях раневого процесса, так и на
свойствах препарата. Известно, что синегнойная палочка является одним из
основных возбудителей раневой инфекции у ожоговых больных. Особенности
вирулентных свойств данного микроорганизма обуславливают нередко
длительное и тяжелое течение гнойного процесса в ожоговой ране.
В этиотропной терапии ожоговой раневой инфекции большое внимание
уделяется местному методу, который предусматривает использование
препаратов с потенцирующим заживление эффектом и антимикробным
действием. Ввиду распространения антибиотикоустойчивых штаммов
псевдомонад актуален поиск новых веществ, обладающих подобным
действием, в том числе антисинегнойной активностью. Адекватно подобранные
лекарственные препараты способствуют снижению ишемии тканей и
инфицирования ран, создавая оптимальные условия для регенерации. В связи с
этим актуальной задачей является поиск и экспериментальное обоснование
использования новых высокоэффективных способов местного лечения
ожоговых ран и их инфекционных осложнений.
На основании вышеизложенного, была поставлена цель исследования –
апробация в условиях эксперимента эффективности применения новых мазей с
антибактериальными свойствами при местном лечении ожоговых
инфицированных ран.
Задачи исследования: создание модели контролируемой по глубине и
площади ожоговой раны с помощью применения запатентованного способа
лазерного излучения; в условиях эксперимента определение особенности
течения раневого процесса при инфицировании ожоговой раны кожи опытными
штаммами синегнойной палочки; разработка состава мази на эмульсионной
основе с антибактериальными свойствами, эффективной при местном лечении
инфицированной ожоговой раны.
Материал и методы. Экспериментальный раздел работы выполнен на
базе кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии СГМУ.
Исследования проведены на 60 белых лабораторных крысах обоего пола весом
19
до 300 г с соблюдением правил использования лабораторных животных, норм
асептики и антисептики под комбинированным обезболиванием.
Был использован разработанный на кафедре малоинвазивный способ
создания ожоговой раны кожи в эксперименте на лабораторных животных,
характеризующийся тем, что в установленной проекции в межлопаточном
пространстве спины крысы сбривается шерсть, кожа обрабатывается
спиртом. К установленному участку кожи подводят световод лазера. При
непосредственном контакте с кожей создается ожоговая
рана
последовательно всех слоев кожи до подкожной клетчатки.
Свидетельством полного прохождения кожного покрова является
подтягивание кожи при выведении световода из раны. При этом площадь
ожоговой раны составляет 9,8 мм 2. Время проведения манипуляции – 2
секунды. Для создания ожоговой раны до 20% кожного покрова требуется
многократное воздействие на кожу лазерным излучением, соответственно с
общей экспозицией 16 секунд.
По сравнению с аналогичными способами создания ожоговой раны при
использовании лазерных технологий значительно упрощается и ускоряется
процесс моделирования, при этом удается точно создать глубину и площадь
ожога кожи заданной степени. При морфологической верификации
гистосрезов субстрата ожоговой раны, выполненных в разных режимах
лазерного воздействия установлено, что полученная модель раны
соответствует ожогу III Б степени, т.е. поражению всех слоев кожи до
подкожной клетчатки.
Бактериологические исследования проведены на кафедре микробиологии
СГМУ. После снятия струпа (на 3 день после ожога) раны инфицировали
клиническим штаммом Pseudomonas aeruginosa, выделенным из раны пациента.
Согласно стандарту мутности McFarland из суточной агаровой культуры
готовили суспензию в физиологическом растворе хлорида натрия
концентрацией 3×106 КОЕ/мл, 0,1 мл которой орошали рану. Предварительно
было взято отделяемое ран для качественного и количественного учета
микрофлоры.
В эксперименте с ожоговыми ранами, инфицированными синегнойной
палочкой, нами было изучено влияние двух, отличных по составу мазей на
эмульсионной основе с антибактериальными свойствами. Состав мази №1
включал масло амаранта, димексид, масло фенхеля на эмульсионной основе
Кутумовой. Составляющими компонентами мази №2 были: амарантовое масло,
левомицетин, димексид, масло фенхеля, также на эмульсионной основе
Кутумовой. Представленная комбинация компонентов в указанных
рецептурных прописях разработана специальными исследованиями в ВГУ и
включает наиболее физически и химически совместимые вещества, способные
в данном сочетании взаимно усиливать активность и расширять спектр
антимикробного действия. Указанные мази применяли путем ежедневного
нанесения на ожоговые поверхности в течение 3-х, 10-х и 14-х суток
эксперимента.
20
Взятые в опыт крысы были разделены на 3 группы, по 20 животных в
каждой. Группу №1 составили крысы с ожоговыми ранами, получающими
местное лечение мазью №1, группу № 2 – крысы с ожоговыми ранами,
получающими лечение мазью №2. В группу №3 вошли животные, не
получающие лечение.
На 3, 10 и 14 день после инфицирования раневое отделяемое собирали
стандартными сухими стерильными тампонами и тщательно суспензировали в
1 мл физиологического раствора хлорида натрия. Полученную взвесь
использовали для приготовления четырех последовательных 10-кратных
разведений. Из каждого разведения осуществляли посев шпателем 0,1 мл на
чашку с мясо-пептонным агаром. Посевы помещали в термостат при t 37ºС и
через 24 часа инкубации подсчитывали количество выросших колоний. С
учетом полученных результатов рассчитывали количество клеток P.aeruginosa
в раневом отделяемом.
Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что на 3-и
сутки после инфицирования в опытах с применением мази №2 эпителизация
раневой поверхности шла более интенсивно по сравнению с группами №3 и
№1. При визуальном осмотре и планиметрических исследованиях обнаружено,
что на поверхности раны животных группы №2 возникали островки розовой
окраски, свидетельствующие о появлении новообразованных сосудов,
снижалась плазморрея. В группе животных №2 сокращалась площадь ожоговой
поверхности за счет краевой эпителизации более выражено, чем в первой и тем
более третьей группах. В группе № 3 ожоговая поверхность бледная, с редкими
грануляциями, фибриновым налетом и подрытыми краями. Среднее количество
P.aeruginosa в раневом отделяемом животных группы №1 составило 3710±92,
группы №2 – 3720±173, группы №3 – 3800±242 КОЕ/мл.
На 10-е сутки после инфицирования этот показатель у группы №1
составил 1000±110, группы №2 – 170±70, группы №3 – 1480±57 КОЕ/мл.
Статистически достоверными оказались различия между полученными
средними значениями при сравнении групп №1 и №3, №2 и №3, №1 и №2 на
10-е сутки после инфицирования. В группе животных №2 отмечался активный
рост грануляционной ткани, местами доходящей до уровня эпидермиса,
ожоговая поверхность значительно сократилась в размерах. В группе
животных, получавших мазь №1 признаки начинающегося регенераторного
процесса были менее выражены, рана оставалась бледной, рыхлой и отечной. В
группе контроля (№3) ожоговая рана представляла собой бледную, изрытую,
неживую ткань, покрытую фибрином, имела место плазморрея.
К 14-м суткам эксперимента лучшие результаты получены при
использовании мази №2. Во всех 20 наблюдениях раны эпителизировались. В
первой группе животных констатировано формирование зрелых грануляций,
отмечалась частичная островковая эпителизация. В целом у животных третьей
группы размеры раны уменьшились, но края раны оставались подрытыми,
местами сохранялся трудно отделяемый струп. На 14 день после
инфицирования у всех животных трех групп роста P.aeruginosa не было
получено.
21
Заключение. При моделировании ожогов кожи целесообразно
применение лазерного излучения, позволяющего точно определять как глубину
поражения кожи, так и площадь ожога. Синегнойная палочка является
причиной развития гнойного процесса в ране, которая без специального
лечения остается инфицированной до 14 суток эксперимента. В местном
лечении инфицированных ожоговых ран в условиях эксперимента отмечена
эффективность комбинации разработанных препаратов с антимикробным
действием. Антисинегнойная активность мази №2 в отношении опытного
штамма преобладает над таковой мази №1.
22
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА И ТИОКТОВОЙ КИСЛОТЫ НА
АКТИВНОСТЬ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ И УРОВЕНЬ ЦИТРАТА В
СЕРДЦЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ
АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Аллекрад Х., Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Семенихина А.В.,
Матасова Л.В. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Известно, что хроническая алкогольная интоксикация приводит к
окислительному стрессу путем усиления образования свободных радикалов и
разрушения антиоксидантной системы защиты в клетках [1]. Интенсивность
процессов свободнорадикального окисления в значительной мере зависит от
уровня ионов Fe2+, который возрастает при окислительном стрессе за счет
высвобождения железа из вне- и внутриклеточных депо, распада Fe2+содержащих белков, в частности, аконитатгидратазы (аконитазы, АГ), и
восстановления Fe3+ в составе ферритина. Снижение уровня Fe2+ может
достигаться за счет увеличения содержания цитрата [2], который способен
хелатировать данные ионы. В настоящее время внимание исследователей
привлекают средства антиоксидантной защиты, в основе которых лежат
естественные
метаболиты
клеток.
Мелатонин
(индол-N-ацетил-5метокситриптамин), гормон, продуцируемый эпифизом и экстрапинеальными
тканями, участвует в синхронизации суточных и сезонных биоритмов,
регуляции репродуктивной и иммунной систем, антистрессовой защите [3].
Тиоктовая кислота (ТК; α-липоевая кислота) – широко распространенный в
природе кофермент. Целью работы явилось исследование влияния мелатонина
и тиоктовой кислоты на активность аконитазы и уровень цитрата в тканях крыс
при хронической алкогольной интоксикации.
В качестве объекта исследования использовались белые лабораторные
крысы-самцы массой 150-200 г. В ходе эксперимента животные были
разделены на пять групп: в 1-й группе (n=19) крыс содержали на стандартном
режиме вивария; 2-ю группу (n=12) составляли животные с хронической
алкогольной интоксикацией, которую создавали путем добавления к
стандартному рациону 15% этанола регулярно в течение месяца [4]; в 3-й
группе (n=9) животным с 14 дня развития патологии внутрибрюшинно вводили
ТК в дозе 35 мг/кг каждые 48 часов в течение последующих 14 дней; крысам
4-й группы (n=8) по аналогичной схеме вводили ТК в дозе 70 мг/кг; крысам 5-й
группы (n=9) по представленной выше схеме вводили мелатонин в дозе 1 мг/кг;
крысам 6-й группы (n=10) по той же схеме вводили мелатонин в дозе 2 мг/кг.
Материал для исследования забирали через 28 дней после начала
алкоголизации. Количество цитрата определяли по методу Нательсона [5].
Aктивность AГ определяли спектрофотометрически при 233 нм в среде
следующего состава: 50 мМ трис-НCl-буфер, pН 7,8, содержащий 0,15 мМ
цитрат, и выражали в единицах на г сырой массы ткани и мл сыворотки.
23
Содержание цитрата, % от
контроля
Данные обрабатывали с использованием t–критерия Стьюдента, различия
считали достоверными при p<0,05.
При хронической алкогольной интоксикации содержание цитрата в
сердце и сыворотке крови увеличивалось в 2,3 и 1,2 раза соответственно по
сравнению с контрольными животными (рис. 1). Повышение уровня цитрата
может иметь адаптивное значение благодаря хелаторным свойствам аниона
лимонной кислоты по отношению к ионам двухвалентного железа. При
введении ТК в дозе 35 мг/кг была выявлена лишь тенденция к снижению
содержания цитрата в сердце, при введении ТК в дозе 70 мг/кг животным с
алкогольной интоксикацией было отмечено уменьшение в 1,2 раза по
сравнению с патологией. В сыворотке животных, которым вводили ТК, не было
выявлено достоверного изменения исследуемого параметра по сравнению с его
величиной при хронической алкогольной интоксикации. При действии
мелатонина в дозах 1 и 2 мг/кг уровень цитрата снижался в сердце в 1,2 и 1,4
раза, в сыворотке крови - на 10% и 20% относительно значений при патологии.
300
250
200
150
100
50
0
1
2
3
4
5
6
Группы животных
cердце
cыворотка крови
Рис. 1. Содержание цитрата в сердце и сыворотке крови крыс в контроле
(1), при алкогольной интоксикации (2) и действии на фоне патологии
тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4), мелатонина в дозе 1
мг/кг (5) и 2 мг/кг (6)
24
Активность аконитазы,
% от контроля
120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
Группы животных
cердце
cыворотка крови
Рис. 2. Активность аконитазы в сердце и сыворотке крови крыс в
контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии на фоне
патологии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4),
мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6)
Основная роль в регуляции накопления цитрата принадлежит АГ.
Молекула фермента легко разрушается активными формами кислорода,
содержание которых при оксидативном стрессе возрастает, что приводит к
накоплению цитрата [6]. Активность АГ при хронической алкогольной
интоксикации в сердце и сыворотке крови крыс уменьшалась в 1,3 и 3,0 раза
соответственно (рис. 2). Действие протекторов на фоне развития патологии
приводило к изменению активности АГ в сторону нормы. Так, при введении ТК
в дозе 35 и 70 мг на кг веса животного активность АГ возрастала в сердце крыс
в 1,2 и 1,3 раза, в сыворотке - в 1,9 раза по сравнению с патологией. При
введении мелатонина в дозе 2 мг на кг веса активность АГ в сердце и сыворотке
крови крыс была выше показателей животных с хронической алкогольной
интоксикацией в 1,3 и 2,9 раза соответственно. Уменьшение дозы мелатонина
до 1 мг на кг веса животного приводило к значительному снижению
протекторного эффекта, активность АГ в сердце и сыворотке крови крыс
увеличивалась в 1,1 и 1,5 раза соответственно по сравнению с патологией.
Сравнение влияния ТК и мелатонина на регистрируемые параметры
показало, что данные вещества обладают протекторным действием, однако
более значительный эффект оказывал мелатонин, который, обладая
амфифильными свойствами, способен проникать в различные ткани и
оказывать антиоксидантное действие как за счет непосредственного
обезвреживания активных форм кислорода, так и за счет стимуляции работы
антиоксидантной защиты организма. ТК оказывала сходное действие на
25
исследуемые показатели в дозах 35 и 70 мг/кг, в то время как мелатонин
проявлял дозозависимый эффект.
Литература
1. Alcohol-induced oxidative stress/ O.R. Koch [et al.] // J. Xenobiotica. –
1991, № 8. – Р. 1077–1084.
2. Skulachev V.P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation
/ V.P. Skulachev // Biosci. Rep. - 1997. – V.17, №3. – P.347-366.
3. Yu H.S. Melatonin. Biosynthesis, physiological effects, and clinical
applications / H.S. Yu, R.Y. Reiter // Broca Raton. – 1993. – P. 572– 583.
4. Бардина Л.Р. Метаболическая адаптация к алкоголю у крыс,
различающихся по предпочтению этанола воде / Л.Р. Бардина,
В.И. Сатановская // Вопр. мед. химии. – 1999. - № 2.
5. Афанасьев В.Г. К микрометоду определения лимонной кислоты в
сыворотке крови с помошью фотоэлектроколориметра / В.Г. Афанасьев, В.С.
Зайцев, Т.И. Вольфсон // Лаб. дело. - 1973. - №4. - С. 115-116.
6. Gardner P.R. Aconitase is a sensitive and critical target of oxygen poisoning
in cultured mammalian cells and in rat lungs / P.R. Gardner, D.M. Nguyen,
C.W. White // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1994. – V. 91, N 25. – P. 12248 - 12252.
26
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА АКТИВНОСТЬ
ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ
ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У КРЫС
Аллекрад Х., Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Матасова Л.В.,
Горбенко М.В. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Важнейшей медико-социальной проблемой современности является
хронический алкоголизм и связанные с ним соматические заболевания. Имеется
ряд данных, свидетельствующих о том, что в алкогольном повреждении печени
и сердца участвуют свободные радикалы [1]. Установлено, что как при острой,
так и при хронической алкогольной интоксикации интенсификация
свободнорадикального окисления связана прежде всего с угнетением
функционирования антиоксидантной глутатионовой системы вследствие
снижения уровня восстановленного глутатиона (GSH) [2]. В настоящее время
повышается интерес к средствам антиоксидантной защиты, в основе которых
лежат естественные метаболиты клеток. В связи с этим приобретает
актуальность исследование эффектов мелатонина - гормона, который
вырабатывается эпифизом и экстрапинеальными тканями. Известно, что
мелатонин является активным донором электронов, эффективным
перехватчиком свободных радикалов и индуктором ряда антиоксидантных
ферментов [3, 4]. Однако использование мелатонина в медицине не выходит за
рамки его классического действия как гормона–регулятора биоритмов. Целью
настоящей работы явилось исследование влияния мелатонина на активность
глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в тканях крыс при хронической
алкогольной интоксикации.
В качестве объекта исследования использовались белые лабораторные
крысы-самцы (Rattus rattus L.) массой 150-200 г. В ходе эксперимента
животные были разделены на четыре экспериментальные группы: в 1-й группе
(n = 19) животных содержали на стандартном режиме вивария; 2-ю группу (n =
12) составляли животные с хронической алкогольной интоксикацией, которую
создавали путем добавления к стандартному рациону 15% этанола регулярно в
течение месяца [5]; в 3-й группе (n = 9) животным с 14 дня развития
хронической алкогольной интоксикации внутрибрюшинно вводили мелатонин
в дозе 1 мг на кг каждые 48 часов в течение последующих 14 дней; крысам 4-й
группы (n = 10) по аналогичной схеме вводили мелатонин в дозе 2 мг на кг.
Материал для исследования забирали через 28 дней после начала
алкоголизации. Активность ферментов определяли при 340 нм. Измерение
активности ГП проводили в среде следующего состава: 50 мМ калийфосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА, 0,12 мМ НАДФН,
0,85 мМ
восстановленного
глутатиона,
0,37 мМ
Н2О2,
1
ед/мл
глутатионредуктазы. Контрольная проба не содержала восстановленный
глутатион. Измерение активности ГР проводили в среде, содержащей 50 мМ
27
Активность
глутатионпероксидазы, % от
контроля
калий-фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 0,16 мМ НАДФН и 0,8 мМ
окисленного глутатиона. Активность ферментов выражали в единицах на г
сырой массы или на мл сыворотки. Реакции начинали добавлением
ферментного препарата. Данные обрабатывали с использованием t–критерия
Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05.
При хронической алкогольной интоксикации происходило снижение
активности ГП в сердце и печени крыс в 2,2 и 1,8 раза соответственно по
сравнению с контролем (рис. 1). Активность ГР в печени снижалась в 2,5 раза,
однако в сердце практически не отличалась от уровня контроля (рис. 2).
Активность ГП и ГР в сыворотке уменьшалась в 2,8 и 1,6 раза соответственно
по сравнению с нормой. По-видимому, снижение активности ГР в тканях крыс
при хронической алкогольной интоксикации взаимосвязано с уменьшением
содержания GSH в данных условиях [6]. Уменьшение активности ГП, вероятно,
сопряжено с тем, что при хронической алкогольной интоксикации наблюдается
снижение содержания селена, играющего важную роль в катализе [7].
120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Группы животных
печень
сердце
сыворотка крови
Рис. 1. Активность глутатионпероксидазы в сердце и сыворотке
крови крыс в контроле (1), при хронической алкогольной интоксикации
(2) и действии на фоне патологии мелатонина в дозе 1 мг/кг (3) и 2 мг/кг (4)
28
Активность
глутатионредуктазы,
% от контроля
140
120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Группы животных
печень
сердце
сыворотка крови
Рис. 2. Активность глутатионредуктазы в сердце и сыворотке крови
крыс в контроле (1), при хронической алкогольной интоксикации (2) и
действии на фоне патологии мелатонина в дозе 1 мг/кг (3) и 2 мг/кг (4)
При введении мелатонина на фоне хронической алкогольной
интоксикации наблюдалось дозозависимое увеличение активности ГП/ГРсистемы по сравнению с патологией, что может быть связано как с активацией
данных ферментов под действием мелатонина, так и с индукцией их синтеза
[7]. Так, введение мелатонина в дозе 2 мг/кг веса сопровождалось увеличением
активности ГП и ГР в сыворотке в 2,8 и 1,9 раза соответственно, в печени крыс
- в 1,3 раза. При этом в сердце крыс активность ГП возрастала в 1,4 раза
относительно данных при патологии, а активность ГР - на 18%. При снижении
дозы экзогенного мелатонина до 1 мг/кг веса активность ГП возрастала в
печени и сердце крыс в 1,3 раза, в сыворотке – в 2,7 раза по сравнению с
животными с хронической алкогольной интоксикацией. При этом активность
ГР в печени и сердце увеличивалась в 1,3 и 1,1 раза соответственно, а в
сыворотке – в 1,7 раза по сравнению с показателями при патологии.
Полученные данные свидетельствуют о возможности коррекции
функционирования
глутатионредуктазной
/
глутатионпероксидазной
антиоксидантной системы при хронической алкогольной интоксикации с
помощью экзогенного мелатонина. Мелатонин является производным индола и
обладает амфифильными свойствами, что позволяет ему преодолевать все
тканевые барьеры, проходить через клеточную мембрану.
Литература
1. Alcohol-induced oxidative stress/ O.R. Koch [et al.] // J. Xenobiotica. –
1991, № 8. – Р. 1077–1084.
29
2. Guerri C. Changes in glutathione in acute and chronic alcohol intoxication /
C. Guerri, S. Grisolia // Pharmacol. Biochem. Behavior. - 1980. – V.13. – P. 53–61.
3. Actions of melatonin in the reduction of oxidative stress / R.J. Reiter [et al.]
// J. Biomed. Sci. – 2000. – V. 7/ - P. 444-458.
4. Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin / C.
Rodriguez [et al.] // J. Pineal Res. – 2004. – V. 36. – P. 1-9.
5. Бардина Л.Р. Метаболическая адаптация к алкоголю у крыс,
различающихся по предпочтению этанола воде / Л.Р. Бардина, В.И.Сатановская
// Вопр. мед. химии. – 1999. - № 2.
6. Уровень глутатиона в тканях крыс при хронической алкогольной
интоксикации и действии протекторов / Аллекрад Х. [и др.] // Сб. тр.
«Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». – Воронеж:
ООО «Центрально-Черноземное книжное изд-во», 2009 . - Вып. 11. - С. 37-40.
7. Effects of chronic ethanol administration on free radical defence in rat
myocardium / C. Rabiere [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 1992. – V.44, № 8. –
P.1495-1500. 7.
30
АНАЛИЗ КОМПОЗИЦИИ ЭКСТРАКТА СЕМЯН ЛЬНА
И ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Андриуцэ Е.Н., Савватеев А.М., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л.
e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М Сеченова
В состав многих биологически активных добавок (БАД) входят
флавоноидные соединения. Одним из них является дигидрокверцетин (ДГК),
обладающий широким спектром фармакологической активности [1]. Другой
группой биологически активных соединений, вызывающих интерес в
настоящее время, являются лигнаны, доступным источником которых, в
частности, секоизоларицирезинола диглюкозида (СДГ), являются семена льна
масличного (Linum usitatissimum Linn.) [2, 3]. С целью модификации
фармакологического действия на базе дигидрокверцетина создан ряд
композиций с другими биологически активными соединениями [1]. С учѐтом
широкого спектра биологического действия ДГК и СДГ перспективна в плане
фармакологической активности композиция, содержащая ДГК и СДГ в
качестве основных биологически активных веществ.
Цель работы – оптимизация условий качественного и количественного
анализа биологически активных соединений композиции, содержащей ДГК и
СДГ.
Материалы и методы. Объект исследования – композиция
дигидрокверцетина (содержание ДГК не менее 92%, ТУ 9354-001-49446523-04,
производства ООО «Флавир», Россия) и сухого экстракта семян льна,
(содержащего не менее 40% СДГ, AlaLife, Китай). Анализ проводили на
жидкостном хроматографе Prostar (Varian, USA): градиентный насос PS 235,
спектрофотометрический детектор PS 325, колонка с октадецилсилановым
сорбентом (Luna 5 мкм 100А; 250x4,6 мм), инжектор Reodayne; объем вводимой
пробы 20 мкл. Программное обеспечение для управления прибором и расчета
хроматографических параметров – Star Workstation (версия 6.2, Varian). УФспектры исследуемых объектов получали на спектрофотометре Cary – 100
(Varian, USA).
Результаты и обсуждение. Для оптимизации условий пробоподготовки
проведен анализ степени извлечения ДГК и СДГ индивидуальными
экстрагентами и смесями. Контроль за полнотой извлечения проводили по
интенсивности поглощения в УФ-спектре (табл. 1).
Наиболее полное извлечение достигнуто при использовании метанола.
Непосредственное спектрофотометрическое определение каждого из
компонентов композиции невозможно ввиду их близких спектральных
характеристик. Спектр ДГК характеризуется максимумом полосы поглощения
при 290 2 нм. УФ-спектр экстракта семян льна имеет максимум поглощения
при 280 1 нм и характерное плечо в области 310-320 нм, что, по-видимому,
связано с присутствием в субстанции фенолокислот [2]. При совместном
31
присутствии кривая УФ-спектра представляет собой спектр наложения, в
котором невозможно выделить области индивидуального поглощения каждого
из компонентов.
Таблица 1.
Полнота извлечения СДГ и ДГК различными экстрагентами
Метанол
98%
Экстрагенты
Смеси органических компонентов и кислот в
различных соотношениях: изопропиловый спирт,
Этанол
пропиленгликоль, ДМФА, ацетонитрил, уксусная
кислота (0,1; 1%), ортофосфорная кислота (0,1,
0,05, 0,02%)
% извлечения, в пересчете на сухое вещество
95%
Менее 90%
Одним из возможных способов анализа мог бы быть способ, основанный
на предварительном разделении компонентов композиции методом
твердофазной экстракции (ТФЭ) с последующим спектрофотометрическим
анализом каждого компонента. Однако, проведенное исследование различных
вариантов разделения методом ТФЭ не дало положительных результатов. Это
предопределило необходимость применения хроматографического разделения
компонентов. Такой подход в наибольшей мере сочетается с методом ВЭЖХ со
спектрофотометрическим детектированием.
В качестве аналитической выбрана длина волны 280 нм. Оба компонента
имеют интенсивное поглощение в этой области, соотношения интенсивностей
поглощения СДГ и ДГК составляют 1:3 соответственно, что позволяет
определять их одновременно. В интервале рН 2-3 исследуемые объекты
находятся в неионизированном состоянии, что учитывалось при выборе
кислотного модификатора подвижной фазы.
Пробоподготовка композиции ДГК и экстракта семян льна заключалась в
еѐ непосредственном растворении в метаноле, разведении подвижной фазой до
необходимой концентрации и фильтровании. В качестве подвижной фазы
предложена смесь метанола (А) и 0,02% ортофосфорной кислоты (Б). Изучение
хроматографических параметров показало, что оптимальным является
градиентный режим элюирования: 0 мин А : Б – 25 : 75 об.%; 0-15 мин
80 : 20 об.%; 15-20 мин 80 : 20 об.%. Установлено, что сопутствующие
основным составляющим композиции вещества, растворимые в подвижной
фазе, не мешают определению компонентов изучаемой субстанции.
Разработанная методика оптимизирована по хроматографическим
параметрам. Значения коэффициента емкости k составляют 3,04 для ДГК и 2,46
для СДГ, и находятся в оптимальном диапазоне от 1 до 10. Удовлетворительны
значения параметров селективности = 1,24 и разрешающей способности RS =
3,3. Эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная для пика
32
ДГК, составила не менее 50 000, для пика СДГ – не менее 40 000 теоретических
тарелок.
Для 9 независимых определений (каждое значение рассчитывалось как
среднее из 3 параллельных измерений) проведена статистическая обработка
результатов (табл. 2). Полученные параметры свидетельствуют о пригодности
хроматографической системы.
Идентификацию пиков ДГК и СДГ и их количественный анализ
осуществляли методом внешних стандартов. Идентифицированы пики
родственных дигидрокверцетину соединений, присутствующих в субстанции:
дигидрокемпферола и нарингенина.
Таблица 2.
Метрологические характеристики количественного определения
компонентов композиции СДГ и ДГК
n
СДГ 9
ДГК 9
f
8
8
S2
3,12689·10-7
1,87243·10-7
S
P t(95,8)
Δx
0,000559186 95% 2,36 0,00106
0,000432716 95% 2,36 0,00082
ε
1,79
1,24
Выводы. Разработана ВЭЖХ методика качественного и количественного
анализа композиции ДГК и СДГ. Методика обладает удовлетворительными
метрологическими данными, селективностью и воспроизводимостью.
Литература
1.
Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М. Лекарственные
препараты на основе диквертина. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2005. – 228 с.
2.
Hu C., Yuan Y.V., Kitts D.D. Antioxidant activities of the flaxseed
lignan secoisolariciresinol diglucoside, its aglycone secoisolariciresinol and the
mammalian lignans enterodiol and enterolactone in vitro. // Food and Chem.
Toxicology.-Vol. 45,-2007.-P. 2219–2227
3.
Prasad K. Antioxidant Activity of Secoisolariciresinol Diglucosidederived Metabolites, Secoisolariciresinol, Enterodiol, and Enterolactone. // Intern. J.
Angiology.-Vol. 9.-2000.-P. 220-225.
33
ТРАВА ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ – НОВЫЙ СЫРЬЕВОЙ ИСТОЧНИК
АНГИОПРОТЕКТОРНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Анисимова М.М. e-mail: [email protected]
Самарский государственный медицинский университет
Особый интерес в настоящее время представляют лекарственные
средства растительного происхождения, сочетающие в себе широкий спектр
биологической активности и относительную безвредность. Среди них
выделяют препараты, содержащие флавоноиды, классическим представителем
которых является рутин (3–О–рутинозид кверцетина). Так, рутин является
универсальным органопротектором и применяется в качестве лечебного
средства, причем чаще всего в сочетании с аскорбиновой кислотой
(«Аскорутин», «Профилактин», поливитаминные препараты). Важно также
отметить, что рутин обладает не только выраженным капилляроукрепляющим,
но и антиоксидантным, гепатопротекторным действием. Кроме того,
заслуживает внимания и гиполипидемический эффект, заключающийся в
существенном снижении (на 30-40%) концентрации в сыворотке крови беталипопротеидов и триглицеридов.
В настоящее время основным источником получения рутина являются
бутоны софоры японской, причѐм потребность в данном препарате
удовлетворяется за счѐт импорта (Бразилия, Германия), что не выгодно с
экономической точки зрения. На наш взгляд, перспективным отечественным
источником рутина и других флавоноидов может являться трава гречихи
посевной (Fagopyrum sagittatum L.), широко культивируемая как ценная
пищевая культура в Российской Федерации.
В цветущих побегах гречихи в качестве основного компонента
содержится рутин (до 3-5 %), а также сопутствующие ему другие флавоноиды –
кверцетин, изокверцитрин и др.
Целью настоящей работы является фитохимическое исследование
надземной части травы гречихи посевной в плане обоснования
целесообразности использования сырья данного растения в качестве
отечественного сырьевого источника рутина – стандартного образца и
лекарственных средств с ангиопротекторной и антиоксидантной активностью.
Исследовали
образцы
надземной
части
гречихи
посевной,
культивируемой в Самарской области, а именно: ГУ «Средне-Волжский филиал
ВИЛАР» (пос. Антоновка), Самарский ботанический сад. Образцы сырья
собирали в фазу цветения.
Спектрофотометрическое исследование осуществляли с использованием
спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Для определения подлинности
травы гречихи посевной была разработана методика тонкослойного
хроматографирования (ТСХ). При этом нами было предложено использование в
данной методике государственного стандартного образца (ГСО) рутина.
34
В задачу исследования входил подбор системы растворителей и способа
детектирования зон адсорбции на хроматограмме и других условий
хроматографирования,
позволяющих
идентифицировать
флавоноиды.
Разделение флавоноидов было наиболее оптимальным в системе
растворителей: хлороформ-метанол-вода (26:14:3) («Силуфол УФ 254» или
«Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ»). В данных условиях четко разделяются
флавоноидные и фенилпропаноидные соединения. Для обнаружения веществ
на хроматограмме использовали детекцию в УФ-свете (254 нм и 366 нм). На
хроматограмме обнаруживается доминирующее пятно Rf - 0,4 (рутин), а также
проявляются другие пятна, в частности, фиолетового цвета с величиной Rf - 0,2
(хлорогеновая кислота), с Rf - 0,75 (кверцетин) и с Rf - 0,6 (изокверцитрин).
Для оценки количественного содержания рутина в траве гречихи
посевной предложена методика хроматоспектрофотометрического определения
и обоснована целесообразность использования ГСО рутина. С использованием
разработанной методики был исследован ряд образцов травы гречихи посевной.
Содержание рутина в траве гречихе посевной, культивируемой в Самарской
области, находится в диапазоне 2,50-3,70 %.
В результате проведенных технологических исследований по разработке
способа получения рутина–стандарта был достигнут выход рутина порядка 1,0
% от массы воздушно-сухого сырья. Этот факт также свидетельствует о
перспективности получения препарата из травы гречихи посевной на основе
флавоноидного
комплекса,
обладающего
ангиопротекторными
и
антиоксидантными свойствами, что подтверждается и литературными
данными, и результатами собственных исследований.
В настоящее время нами проводится отработка оптимальных
технологических параметров получения экстракционных препаратов из травы
гречихи посевной с высоким содержанием целевой группы веществ –
соединений флавоноидной природы.
35
СИНТЕЗ ПОТЕНЦИАЛЬНО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
НА ОСНОВЕ 3-АРИЛМЕТИЛИДЕН-3Н-ФУРАН-2ОНОВ
Аниськова Т.В., Чадина В.В., Егорова А.Ю. e-mail: [email protected]
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
Структурные фрагменты исследуемых нами 3-арилметилиден-3Нфуран(пиррол)-2-онов (1) входят в состав природных соединений
(протоанемонин, аскорбиновая и пеницилловая кислоты), синтетических
лекарственных средств, используемых при лечении болезней желудочнокишечного тракта, сердечно-сосудистой системы.
В связи с этим синтезированные соединения на основе
арилметилиденовых производных 3Н-фуран(пиррол)-2-онов также являются
потенциально биологически активными веществами с возможным широким
спектром действия, перспективными для дальнейших исследований.
Введение в структуру синтезированных соединений заведомо
потенциально биологически активных фрагментов, также позволяет
предположить у впервые полученных соединений проявление различного рода
биологической активности.
Арилметилиденовые производные 3Н-фуран(пиррол)-2-онов были
введены в реакцию с динитрилом малоновой кислоты. В зависимости от
условий проведения реакции и характера заместителя в арилметилиденовом
фрагменте получены различные продукты реакции, строение которых
однозначно доказано с привлечением спектральных данных. Соединения 2
получены при нагревании замещенных 3Н-фуран-2-онов и малононитрила в
растворе абсолютного спирта, в присутствии триэтиламина. При наличии в
арилметилиденовом фрагменте ОН-группы в положении 2 происходит
образование соединений 4,5. Соединения 3 получены с помощью
трехкомпонентной конденсации при взаимодействии 3-арилметилиден-3Нфуран(пиррол)-2-она, малононитрила и ацетоуксуного эфира в основной среде.
С
целью
поиска
дальнейших
перспективных
возможностей
практического применения впервые синтезированных соединений осуществлѐн
их виртуальный скрининг с помощью программы PASS. Компьютерная
программа предсказания спектра действия по его структурной формуле
позволяет оценить фармакологические эффекты, механизмы действия и
специфическую токсичность вещества.
Для фуро(пиррол)пиридиновых систем (2) отмечена способность
ингибировать рецепторы клетки, перенос ионов через мембрану. Также
отмечена вероятность проявления обезболивающего, парализующего,
антисеборейного действия для данных систем.
По данным виртуального скринига триоксоциклопентафенантрены (5) и
азациклопентафенантрены
(4)
можно
использовать
как
антигиперхолестеринемические и антикоагулянтные средства, а также средства,
проявляющие антинеопластическую активность.
36
Cl
O
R
O
O
N
3
Cl
O
Ar
NH2
CN
R
R
N
H
O
CH3
NH
O
X
R
X
1
2 N
4
O
NH2
X= O, NH
R
O
NH
O
5
Достаточно широкий спектр действия по данным виртуального скрининга
проявили этиловые эфиры циклопентанафталин-6-карбоновых кислот (3). Для
данных систем отмечена способность ингибировать рецепторы клетки,
ферменты, в частности аминопептидазу. Данные соединения могут оказывать
антиартрическое,
психотропное,
антисеборейное,
противоаллергенное,
противовоспалительное, обезболивающие действие, а также проявлять антиВИЧ активность.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ
для государственной поддержки молодых российских ученых №МК-635.2009.3.
и РФФИ 10-03-00640-а
37
МЕТОДЫ АНАЛИЗА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ГЕПАРИНОВ
Арианова Е.А.
НИИ питания РАМН
Низкомолекулярные гепарины – одни из наиболее часто применяемых
антикоагулянтов для лечения и профилактики тромбоза, тромбофлебита,
тромбоэмболии, а так же их осложнений. Характерной особенностью
применения низкомолекулярных гепаринов является их способ введения
(инъекционный), а также кратность применения (ежедневно в течение всего
заболевания до 3-х раз в сутки). Это обуславливает повышенные требования к
обеспечению качества и безопасности лекарственных средств данной группы.
В настоящее время низкомолекулярные гепарины широко используется
во всех странах мира, что обуславливает быстрое накопления опыта и
возможных проблем, связанных с их применением.
Низкомолекулярные гепарины представляют собой смесь полимеров
высокосульфированный мукополисахаридов, состоящих из последовательно
чередующихся остатков D-глюкороновой кислоты и 2-амино-2-дезокси-Dглюкозы, соединенных связями 1—4, имеющих диапазон молекулярных масс
от 5000 до 40000 Да. Это существенно осложняет проведение их качественного
и количественного анализа, т.к. определяемый компонент не является
отдельным веществом, которое можно выделить и четко охарактеризовать.
Такая ситуация способствует возможному загрязнению низкомолекулярных
гепаринов сходными по структуре и свойствам примесями, которые сложно
обнаружить.
Так, наиболее известный случай подобного загрязнения связан с
обнаружением
примеси
хондроитин
сульфата
в
препаратах
низкомолекулярного гепарина. В Китае на ранних стадиях производства в
лекарственное средство (ЛС) был добавлен сульфатированный хондроитин
сульфат, который, как и гепарин, обладает антикоагулянтными свойствами, но
в 100 раз дешевле в производстве (не 2000, а 20 дол. США за 1 кг). Контроль
ЛС на наличие этого вещества не был предусмотрен спецификацией качества
на гепарин. В итоге по меньшей мере 81 пациент в США умер по причине
побочных реакций на препарат. Другие источники сообщают о более чем 100
смертельных случаях в США и сотнях серьезных побочных реакций в Европе
или о более 200 случаях смерти в разных странах.
Все это требует разработки современных комплексных подходов оценки
качества и безопасности лекарственных средств на основе низкомолекулярных
гепаринов. Такой комплексный подход должен решать данную проблему сразу
по нескольким направлениям: совершенствовать и разрабатывать методы
контроля качества самого препарата, а также осуществлять контроль процесса
его производства.
Анализ фармакопейных статей низкомолекулярного гепарина Российской
Федерации показывает, что при определении качества и безопасности
38
низкомолекулярного гепарина применяют различные методы: химические
(качественные
реакции)
и
физико-химические
(спектральные,
хроматографические
и
электрофоретические).
Однако
во
многих
фармакопейных статьях предлагаемые методики не позволяют в полной мере
обеспечить качество и безопасность лекарственных средств на основе
низкомолекулярных гепаринов.
В фармакопейной статье на эноксапарин натрия предложена методика
качественного
определения
с
использованием
0,01N
раствора
хлористоводородной кислоты с последующей записью УФ-спектра
полученного раствора на подходящем спектрофотометре в кювете с толщиной
слоя 1 см в области длин волн от 220 нм до 300 нм относительно 0,01N
раствора хлористоводородной кислоты. В этой статье не заложено испытание
на такие примеси, как хондроитин сульфат, в то время как
спектрофотометрический метод не позволяет различить эти компоненты.
Для проведения испытаний подлинности на дальтепарина натрия в
фармакопейной статье предложен более эффективный метод анализа
подлинности – высокоэффективная жидкостная хроматография. Но в этой
статье так же не представлены условия разделения хондроитин сульфата и
дальтепарина натрия.
В фармакопейной статье на препарат «Гепарин натрий-браун»
подлинность и количественное содержание гепарина определяют по удлинению
времени свертывания плазмы крови в цитратном буфере. Такой метод не
позволяет обнаружить наличие примесей, таких как хондроитин сульфат,
поскольку хондроитин сульфат также обладает антикоагулянтной активностью.
В испытаниях подлинности субстанции гепарин натрия фармакопейной
статьей предложено проведение зонального электрофореза. Для анализа
субстанции Пласдон-С15 предложен метод ИК-спектрофотометрии. Оба эти
метода не позволяют в полной мере определить наличие и количественное
содержание примесей.
Анализ научных публикаций показывает, что комплексный состав
низкомолекулярных гепаринов еще не до конца изучен, а так же не до конца
определен спектр возможных примесей. В литературе описано достаточное
количество модификаций выше перечисленных методов для анализа гепарина,
однако их использование требует доработки и детального исследования.
Описана методика спектрофотометрического определения гепарина с
диметилметиленовым синим. Однако этот метод не дает информации о
структурных особенностях компонентов образца, а так же он обладает
достаточно низкой чувствительностью.
Большое количество публикаций описывает способы качественного и
количественного анализа низкомолекулярных гепаринов, а также методы их
разделения, распределения по молекулярным массам. Наиболее эффективен для
данных целей капиллярный электрофорез. Как правило, для разделения
низкомолекулярных гепаринов применяется фосфатный буфер с рН=3,0.
Встречаются публикации, где для такого разделения использовали добавление
в данный буфер диметилсульфоксида. Для анализа низкомолекулярных
39
гепаринов встречается применение и щелочного буфера (три-, дибутиламин,
триэтиламин). Практически во всех случаях исследования низкомолекулярных
гепаринов используют кварцевый капилляр.
В статье Romain R. предложен метод анализа гепарина и его примесей с
помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При этом использовали
30% акриламидные гели, разделение осуществляли при 25mА, для окраски
использовали 0,08% Азур А. В результате была получена электрофореграмма,
на которой четко визуализируются различные дисахаридные и моносахаридные
остатки гепарин сульфата. Так же в качестве красителя применяется
Алциановый синий.
Широко распространен метод высоко эффективной жидкостной
хроматографии для анализа низкомолекулярных гепаринов. В данном методе
часто используют различные модификации, как подвижной, так и не
подвижной фазы. В статье Maurier описывает метод модификации колонки С18
цетилтриметиламмониумом. В отношении подвижной фазы чаще всего
встречается градиент перехода вода\2,5М натрия хлорид, 20мМ Tris\фосфатный
буфер с рН=3,0. Описан опыт использования градиента подвижной фазы водаацетонитрил, где оба компонента подкислены муравьиной кислотой (0,1%).
Большое разнообразие представляют собой используемые способы
детекции низкомолекулярных гепаринов. Наиболее часто используется
диодноматричный детектор, при этом как правило применяется длина волны
230 нм. Так же описан опыт использования флюоресцентного детектора.
Безусловно, наиболее точным и дающим представление о составе компонентов
образца является применение масс-спектрометров, таких как ионная ловушка,
время пролетный масс-детектор. Как правило, в сочетании с ВЭЖХ или
капиллярным электрофорезом этот метод дает наиболее полную и
исчерпывающую информацию о составе и количестве действующих веществ и
их примесей в анализируемом лекарственном средстве.
Для каждого описанного выше метода существуют свои задачи и свои
ограничения. Необходимо решение такой задачи, как анализ компонентов
низкомолекулярных гепаринов, разработка оптимальных методов контроля
подлинности и качества лекарственных препаратов на основе гепарина. Так же
крайне важна разработка методик определения хондроитин сульфата в гепарин
содержащих лекарственных препаратах. Эти вопросы требует детального
анализа препаратов, предложенных на российском рынке, а так же субстанций
для их производства.
40
МАРКЕТИНГОВАЯ ОЦЕНКА ПОЗИЦИЙ АССОРТИМЕНТА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ПРИ КАШЛЕ
Афанасьева Т.Г., Шевченко Т.В.
Воронежский государственный университет
Кашель является одним из наиболее распространенных симптомов у
пациентов с бронхолегочными заболеваниями и частая причина обращения за
медицинской помощью.
Пациенты, желающие приобрести средство для лечения кашля,
составляют значительную часть посетителей аптеки. А, следовательно,
правильно сформированный ассортимент противокашлевых и отхаркивающих
препаратов имеет огромное значение в улучшении экономических показателей
фармацевтической организации.
Для формирования аптечного ассортимента необходимы не только
сведения о совокупном ассортименте рынка, но и информация о позициях
каждого лекарственного средства (ЛС) в сознании целевой аудитории, которая
и формирует спрос на рынке.
Принцип позиционирования подразумевает выявление самых важных
свойств товара, т.е. приоритетность факторов для различных потребителей,
ориентируясь на которые принимаются решения о назначении лекарственного
средства (врачами), реализации (фармацевтами) и покупке (потребителями).
Перечисленные лица являются основными участниками реализации
лекарственного средства с момента назначения препарата до момента его
покупки.
Целью исследования является – изучение факторов, влияющих на
позиции ЛС, применяемых при кашле и оценка их конкурентоспособности.
Методика, используемая в настоящем исследовании в качестве оценки
позиций ЛС применяемых при кашле, является многоуровневой, основанная на
разработанных методических рекомендациях КГМУ, под редакцией доктора
фармацевтических наук, профессора Дремовой Н.Б.
В основе метода позиционирования ЛС лежит оценка их
конкурентоспособности по следующим параметрам: эффективность ЛС,
быстрота действия, безопасность применения, широта фармакологического
действия, удобный способ применения, доступная цена и д.р., поэтому на
первом этапе для установки более значимых характеристик ЛС, применяемых
при кашле было проведено медико-социологическое исследование. Данное
исследование предусматривает следующие стадии:
- определение номенклатуры показателей, играющих первостепенную
роль в процессе продажи, так называемых параметров позиционирования;
- экспертная оценка параметров позиционирования с помощью
специально разработанных оригинальных анкет. В исследовании принимали
участие потребители, фармацевтические работники, врачи г. Воронежа (по 60
экспертов каждой группы), всего 180 экспертов;
41
- математическая обработка ответов респондентов.
Для оценки было предложено 13 параметров, 3 из которых разбиты на
составляющие их компоненты: безопасность применения, способ приема и
фирменный стиль. Такая операция проведена с целью подробного разъяснения
значений данных характеристик и получения исчерпывающей информации об
их месте в создании целевой аудитории. Таким образом, было оценено в
комплексе 24 потребительских свойства. (таблица№1)
При выборе параметров конкурентоспособности ЛС применялись
следующие принципы: они не должны иметь взаимосвязей между собой; не
должны являться составляющими друг друга; должны быть понятны
респондентам; должны соответствовать целям решаемой маркетинговой задачи.
Многофакторный анализ показал, что эффективность ЛС, применяемых
при кашле является наиболее важной характеристикой для всех групп
респондентов. Средневзвешенная оценка важности равна 4,75 балла. Второе
место для врачей и фармацевтических работников занимает быстрота действия,
а для потребителей цена. Этот факт объясняется тем, что в сложной
экономической обстановке, ценовой фактор располагается лишь на 7 месте. На
третьем месте располагается широта фармакологического действия.
Маркетинговая оценка позиционирования определенной группы ЛС
позволяет уточнить фактические позиции конкретного препарата, занимаемые
им в определенный ситуационный момент исследования на фармацевтическом
рынке и сформировать ценностные предложения по формированию
ассортиментной и сбытовой политики фармацевтической организации.
Таблица 1.
Рейтинг важности параметров позиционирования
название параметра
Для врачей Для
провизор
ов
всв Рей- Всв рейтинг
инг
1.Эффективность ЛС
4,90 1
4,6 1
5
2.Безопастность
4,63 4
4,0 5
1
2.1.незначительные
4,35
4,0
побочные действия
2
2.2.личная переносимость 4,92
4,0
препарата
0
3.Понятная информация 3,76 9
3,7 7
на упаковке
3
42
Для
потребител
ей
всв рейтинг
4,7 1
0
4,1 5
4
3,8
7
4,4
2
3,3 8
8
Среднее
всв
4,7
5
4,2
7
4,0
8
4,4
5
3,5
0
рейтинг
1
4
9
4.Удобный
способ 4,16
приема
4.1.периодичность
3,37
приема
4.2.небольшая дозировка 4,02
8
4.3 правила приема
3,86
5.Доступная цена
4,18
7
6.Способ хранения
3,60
12
7.Лекарственная форма
4,18
6
8.Фирменный стиль
3,84
10
8.1.название ЛС
4,25
8.2.товарный знак
3,83
8.3.страна производитель
4,05
8.4.фирма производитель
4,0
8.5.фирменный цвет
3,27
8.6.информация
о
производителе
9.Форма
отпуска
(рецептурный,
безрецептурный)
10.Эстетический
вид
упаковки
11.Быстрота действия
3,62
3,70
11
3,32
13
4,62
2
12.Вид
сырья,
из 4,27
которого изготовлено ЛС
13.Широта
4,57
фармакологического
действия
5
3
3,3
9
3,7
0
3,3
0
3,1
7
4,1
8
3,1
2
3,7
2
3,1
0
3,4
5
3,1
8
3,5
3
3,2
7
2,4
7
2,6
8
3,6
0
11
3,4
7
4,4
0
3,7
8
4,0
8
10
3
12
8
13
9
2
6
4
3,2
7
3,6
7
3,2
6
2,8
8
4,3
5
3,3
5
3,1
3
2,9
2
2,7
6
3,1
5
3,3
3
2,7
7
2,4
3,1
0
3,5
5
2,6
8
4,2
7
3,6
3
4,2
3
10
2
9
11
12
7
13
3
6
4
3,3
9
3,3
4
3,5
3
3,3
1
4,2
4
3,3
6
3,6
8
3,2
8
3,4
9
3,3
9
3,6
4
3,3
5
2,7
1
3,1
3
3,6
2
10
3,1
6
4,4
3
3,8
9
4,2
9
13
5
11
7
12
8
2
6
3
Литература
Маркетинговая оценка позиционирования лекарственных средств/ [под
ред.Дремовой Н.Б.]. – Курск:КГМУ, 2007. – 30 с.
43
БИЗНЕС-ПЛАН И ЕГО РОЛЬ В СОВРЕМЕННОМ
ПРЕДПРИНИМАТЕЛЬСТВЕ
Афанасьева Т.Г.
Воронежский государственный университет
Современная экономическая ситуация в РФ диктует предприятиям новый
подход к внутрифирменному планированию. Процесс вхождения российской
экономики в систему рыночных коммуникаций, деятельность хозяйственных
субъектов в условиях конкуренции и в постоянно меняющейся конкурентной
среде требуют от каждого предпринимателя, бизнесмена, менеджера
постоянного совершенствования предпринимательской деятельности. Они
вынуждены искать такие формы и модели планирования, которые
обеспечивали бы максимальную эффективность принимаемых решений.
Оптимальным вариантом достижения таких решений в новых экономических
условиях хозяйствования является бизнес-план (БП).
БП помогает предпринимателям продумывать свою стратегию,
соизмерять свой энтузиазм с реальностью и осознавать существующие
ограничения. Это позволит избежать таких потенциально опасных ошибок, как
нехватка капитала для функционирования фирмы, отрицательный баланс
движения денежной наличности, неверный подбор персонала, неправильный
выбор местонахождения предприятия и погоня не за тем рынком, который
действительно нужен.
Профессионально подготовленный БП способствует аптечному
предприятию (АП) развивать и укреплять свои позиции на рынке товаров и
услуг, моделировать свою фармацевтическую деятельность на основе
современных принципов менеджмента, маркетинга и экономики АП.
В связи с этим, в исследовании была поставлена цель разработать модель
БП для АП ООО «Наша аптека». Аптека имеет лицензию на осуществление
розничной фармацевтической деятельности, в составе которой три отдела:
отдел готовых лекарственных форм, отдел парафармацевтики и фитоотдел.
Аптека располагается в оживленном месте, по статистическим данным,
жилой массив района насчитывает в среднем 20 тыс. жителей, протяженность
жилого массива составляет около 1 км. По статистическим данным примерно
50% из всего числа жителей, составляет население пенсионного возраста и дети
до 10 лет. Отсутствие потенциальных конкурентов в данном жилом массиве
предполагает приток населения в открываемую аптеку. На начало 2009 года
ожидается прирост населения в связи с заселением близлежащих новостроек.
Ближайшими лечебно-профилактическими учреждениями являются МУЗ
ГО Городская клиническая поликлиника №4, МУЗ ГО Городская детская
поликлиника №11. Основные конкуренты: ЗАО «Фармация», ИП Додонов, ИП
Иванов и др.
В ходе маркетингового анализа были получены результаты
социологических исследований и выявлены основные группы потребителей
44
АП. Ими оказались: дети в возрасте от 0 до 16 лет; гериатрические больные
(женщины в возрасте от 55 и мужчины в возрасте от 60 лет); женщины
репродуктивного возраста (в большинстве с 18 лет).
Общая площадь аптеки 95м2, площадь торгового зала – 65м2, количество
кассовых мест – 2.
Общая численность АП 11 человек, в т.ч. административного персонала –
3
сотрудника
(директор
предприятия,
зав.
аптекой,
бухгалтер),
фармацевтического персонала – 6 сотрудников (2 провизора, 4 фармацевта),
вспомогательного персонала – 2 сотрудника (санитарки)
Составлено штатное расписание персонала с учетом общего фонда
заработной платы, которое составляет 183000рублей в месяц.
Структура товарооборота на момент открытия: доля ЛП – 70%, БАД –
6,95%, ИМН – 4,78%, гомеопатические препараты – 3,77%, лечебная косметика
– 1,71%, другие группы медицинских товаров – 12,79%.
Отдел готовых лекарственных форм будет осуществлять реализацию
лекарственных препаратов (ЛП), в т.ч. гомеопатических. В отделе
парафармацевтики предусматривается реализация изделий медицинского
назначения, лечебного и диетического питания, косметической продукции,
оптики, БАД и других. Фитоотдел будет осуществлять реализацию эликсиров,
бальзамов, настоек, эфирных масел, сборов и других лекарственных препаратов
растительного происхождения.
АП имеет своей целью предложить своим будущим покупателям
достаточно широкий ассортимент лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и другого товара аптечного ассортимента, а именно
около 6000 наименований, из них 70% составляют лекарственные средства, а
30% – приходится на парафармацевтическую продукцию.
Факторами, обеспечивающими инвестиционную привлекательность
предлагаемого проекта являются: квалифицированный менеджмент, четкий
маркетинговый план, наличие предварительных договоренностей с
потенциальным арендодателями, знание требований целевой аудитории,
значительный финансовый потенциал, обеспечивающий инвестиционную
привлекательность данного бизнеса.
Источником финансирования данного проекта являться – кредитные
средства в размере 3млн. рублей.
Желаемые условия кредитования, при которых проект достигает заданной
эффективности представлен в табл. 1.
Основные вводные данные:
- месяц начала реализации проекта – январь 2010года;
- месяц начала ведения фармацевтической деятельности – апрель
2010года;
- шаг проекта (минимальный период расчетов) – 1 год;
- горизонт планирования (количество расчетных периодов) – 4года;
- используемая в расчетах система налогообложения – единый налог на
вмененный доход;
45
- финансовые расчеты выполнены в текущих ценах без изменения цен на
ресурсы и реализуемую продукцию;
- амортизация начисляется линейным способом;
- транспортные расходы на доставку товара в аптеку в проекте не
учитываются, поскольку товар доставляется силами поставщика;
- условия расчетов с покупателями – 100% оплата товара покупателями
(без какой либо отсрочки);
- для обеспечения необходимости рентабельности учредителями задаются
планы на основные финансовые показатели:
- маржа – не менее 26,5% от выручки (в среднем по году);
- оборачиваемость товарных запасов – не более 35 дней;
Эффективность инвестиционного проекта оценивается по основным
интегральным показателям.
Таблица 1.
Объем и условия финансирования
Показатель
Значение
Запрашиваемый кредит, руб.
3 000 000
Период кредитования
январь 2009 – декабрь 2013
Периодичность погашения процентов
за пользование кредитом
Периодичность погашения основного
долга за пользование кредитом
Ставка процента за пользование
средствами
Ежемесячно,
начиная с января 2011г.
Ежемесячно,
начиная с января 2010г.
Срок погашения кредита
2013 год
22% годовых
Полученные результаты следующие:
Чистая текущая стоимость (NPV) = 363 тыс. рублей.
Индекс прибыльности (PI) = 18%
Внутренняя норма рентабельности (IRR) = 33%
Дисконтированный период окупаемости проекта = 3,4 года
Накопленная чистая прибыль на конец проекта = 1 325тыс. рублей.
Таким образом, полученные данные в результате составления БП
свидетельствуют о достаточно высокой степени эффективности проекта.
46
Литература
1.
Афанасьева Т.Г., Н.Б. Дремова «Бизнес-планирование в
практической деятельности фармацевтического сектора здравоохранения. Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация, 2009, №1, с.87-91.
2.
Дорофеева В.В. Разработка бизнес-плана//Новая аптека. - 2005, №12, - с.46-53
3.
Дорофеева В.В. Разработка бизнес-плана//Новая аптека. - 2006, №1, - с.45-56
4.
Планирование на предприятии: практическое пособие / Под ред.
Ю.Н. Лапыгина. - М. : Издательство «Омега — Л», 2007. - 304 с.
47
МОНИТОРИНГ СОСТОЯНИЯ СЕГМЕНТА ОТЕЧЕСТВЕННОГО
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО РЫНКА НООТРОПНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Афанасьева Т.Г., Бердникова А.М., Филонова Е.В. e-mail: [email protected]oronej.ru
Воронежский государственный университет
В настоящее время все больше возрастает темп жизни современного
человека. Увеличивается объем информации, которую нужно переработать и
запомнить, возрастает нагрузка на нервную систему. Из этого следует, что в
настоящее время возрастает потребность в лекарственных препаратах (ЛП),
которые при минимуме побочных эффектов оказывают значительное
положительное влияние на память, процессы восприятия, мышления, обучения.
Целью нашего исследования стало проведение мониторинга российского
фармацевтического рынка ноотропных лекарственных препаратов (НЛП),
входящих в группу по АТС – классификации N06В – Психостимуляторы и
ноотропные препараты.
Широкий спектр действия НЛП и доказанный позитивный клинический
эффект их применения позволяет считать, что эти ЛП являются необходимым
компонентом современной патогенетической лекарственной терапии при
лечении нарушений функций головного мозга. Учитывая, что в клинической
практике потребность в данных ЛП велика, получение и внедрение в практику
новых высокоэффективных НЛП является очень актуальной проблемой.
Используемые методы исследования: контент-анализ официальных
источников информации о лекарственных средствах (ЛС) (Регистр ЛС России
2009 года издания, Справочник Видаль 2009 года), методы маркетинговых
исследований ассортимента ЛС (классификация, группировка, структурный
анализ, описательная статистика, сравнительный анализ).
Результаты
контент-анализа,
систематизация
и маркетинговые
характеристики целевого сегмента рынка предложений исследуемой группы
представлены в табл. 1.
Таблица 1.
Маркетинговые характеристики сегмента рынка ЛП группы N06B
Отечеств.
Зарубеж.
1)
2)
3)
№ п/п
МНН
ТН
ЛП
к-во доля,
к-во доля,
%
%
N – НЕРВНАЯ СИСТЕМА
N06 – Психоаналептики
N06В – Психостимуляторы и ноотропные препараты
1.
N06ВА – Симпатомиметики центрального типа действия
1. 1.1.
Атомоксетин
1
15
15
100
Итого
1
15
15
100
48
2.
2. 2.1.
3. 3.1.
4. 3.2.
5. 3.3.
6. 3.4.
7. 3.5.
8. 3.6.
9. 3.7.
10. 3.8.
11. 3.9.
12. 3.10.
13. 3.11.
14. 3.12.
15.
16.
17.
18.
19.
3.13.
3.14.
3.15.
3.16.
3.17.
20. 3.18.
21. 3.19.
22. 3.20.
23. 3.21.
24. 3.22.
25. 3.23.
N06ВС – Производные ксантина
Кофеин
4
79
73
92,4
6
7,6
Итого
4
79
73
92,4
6
7,6
N06ВХ – Другие психостимуляторы и ноотропные препараты
Винпоцетин
13
343
245
71,4
98
28,6
Пирацетам
14
403
343
85,1
60
14,9
Гинкго двулопастного
12
112
26
23,2
86
76,8
листьев экстракт
Гинкго двулопастного
1
18
18
100
листья
Полипептиды коры
2
8
8
100
головного мозга скота
Церебролизин
1
5
5
100
Ноопепт
1
13
8
61,5
5
38,5
Глицин
5
123
115
93,5
8
6,5
Пиритинол
2
4
1
25
3
75
Гопантеновая кислота
8
82
82
100
Фенилпирацетам
1
5
5
100
Никотиноил – гамма7
79
79
100
аминомасляная кислота
Ацетилкарнитин
2
6
4
66,7
2
33,3
D,L-гопантеновая кислота
2
12
12
100
Деанола ацеглумат
2
5
5
100
Идебенон
5
35
30
85,7
5
14,3
Сульбутиамин
1
7
7
100
Мозга крупного рогатого
1
6
6
100
скота гидролизат
Семакс
2
9
9
100
Цитиколин
1
7
7
100
Ацетиламиноянтарная
1
1
1
100
кислота
N06ВХ – Другие психостимуляторы и ноотропные препараты
(НЛП в комбинациях)
Пирацетам+Циннаризин
4
17
15
88,2
2
11,8
Винпоцетин+Пирацетам
1
9
9
100
Итого
89
1309 1020 77,9
289
22,1
Всего
94
1403 1093 77,9
310
22,1
Примечание: 1) международные непатентованные наименования;
2)торговые названия;
3) лекарственные препараты;
Общий ассортимент фармацевтического рынка ЛП группы N06В
составляет 23 действующих вещества по МНН плюс одно действующее
49
вещество Циннаризин (препарат для устранения головокружения), входящее в
комбинированный препарат, т.е. всего 24. Общее количество ТН составляет 94.
Общее количество ЛП с учетом различных лекарственных форм, дозировок и
фасовок – 1403. Среди них 22,1% (310) составляют зарубежные ЛП, а 77,9%
(1093) – это ЛП российского производства.
Среди зарубежных стран по количеству предложений в рейтинге
лидируют – Индия (27,5%), США (13,9%), Республика Беларусь (11,3%),
Германия (10,3%), Венгрия (6,1%) (рис.1).
Рис.1. Рейтинг зарубежных стран по количеству зарегистрированных
предложений ЛП группы N06B (%)
Из всего числа ЛП доля монокомпонентных составляет 98,1% (1377 ЛП),
остальные 26 ЛП (1,9%) – это комбинированные средства.
Анализ по видам лекарственных форм (рис. 2) показал, что в структуре
ассортимента преобладают таблетки (61,8%), на втором месте капсулы (14,7%),
а на третьем месте раствор для инъекций (13,5%).
Рис. 2. Соотношение лекарственных форм в структуре ассортимента
группы N06B (%)
50
Таким образом, мониторинг состояния целевого сегмента отечественного
фармацевтического рынка ЛП группы N06B показывает положительные
тенденции в его развитии. Постоянно расширяющийся ассортимент НЛП
данной группы свидетельствует об их значительной роли в терапии
заболеваний нервной системы.
Литература
1.
Улезко А.В., Платонова Ю.В. «Психотропные средства в
психиатрической практике», издательство «Феникс», 2007 г. – 176 с.
2.
РЛС-аптекарь, электронный справочник – www.rlsnet.ru
3.
Справочник Vidal, издательство «АстраФармСервис», 2009 г. – 1760
с.
51
ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФИНАНСОВЫХ ЗАТРАТ ПО
СТАТЬЕ «МЕДИКАМЕНТЫ » ЗА 2009 ГОД (АВС – VEN АНАЛИЗ)
Бегина О.А., Гладчук Н.В., Назарьева Н.А.
ГУЗ «Областная детская клиническая больница № 2»
Кабинетом клинической фармакологии проведена фармакоэкономическая
оценка финансовых затрат по статье «Медикаменты » за 2009 год, они
составили 13400 тыс. руб.
Клинико-экономический анализ – оценка качества двух и более
методов профилактики, диагностики, лечения на основе комплексного учѐта
результатов медицинского вмешательства и затрат на его выполнение.
Применительно к лекарственным способам лечения данный метод
анализа называется фармакоэкономическим.
Основные задачи:
1.
Обосновать выбор лекарственного средства для формулярного
списка, протоколов ведения больных, составления заявки на лекарственные
препараты.
2.
Провести анализ эффективности и качества лекарственных средств,
применяемых в стационаре.
3.
Оценить рациональность использования денежных средств
лекарственного бюджета и адекватно планировать денежные ресурсы. АВС –
анализ – это метод оценки рациональности использования денежных средств.
Он позволяет получить объективную картину расходования финансовых
ресурсов в соответствии с лекарственным формуляром.
А – группа лекарственных средств, на которые затрачено 70-80 %
бюджета,
В – 10-20 % бюджета,
С – не более 10 % бюджета.
АВС – VEN анализ за 2009 года
Объѐм финансовых
затрат по группам
медикаментов
А – 69, 37 % (9,5
млн.руб)
В – 20,57 % (2,8
млн.руб)
С – 10,05% (1,4
млн.руб)
Итого:100% (13,4
млн.руб)
Распределение медикаментов по степени их
необходимости
V,%
E,%
N,%
55,52
13,85
-
14,2
6,37
-
4,68
5,35
0,02
74,4
25,58
0,02
52
Распределение групп лекарственных средств по торговым
наименованиям
Группы
А
В
С
Торговые
наименования ЛС
24%
16%
60%
Группа А – самые дорогие препараты. Первое место занимает –
цефотаксим ≈ 8 % всех денежных средств, потраченных на лекарственные
средства в 2009 году, второе место – препараты интерферона Альфа-2
(«Виферон», «Гриппферон», «Офтальмоферон») ≈ 6% , третье место
«Меронем» – 4 % .В Перечень жизненно-необходимых и важнейших
лекарственных средств, утверждѐнный распоряжением Правительства РФ от
29.03.2007 года № 376- р, входят 30 наименований препаратов данной группы
(83%) препараты аминокислот, антибиотики резерва, препараты для наркоза,
антимикотики, лекарственные средства для лечения кишечных, респираторных
заболеваний (амброксол, интерфероны, циклоферон, диосмектид). Шесть
препаратов из группы А не входят в Перечень жизненно-необходимых и
важнейших лекарственных средств, на их приобретение тратиться ≈ 11,6%
лекарственного бюджета в год (≈ 1,6 млн. руб.). Это: 1) противовирусные
средства (препараты интерферона альфа 2, инозин пранобекс); 2) актовегин; 3)
амброксол; 4) позаконазол; 5)эссенциальные фосфолипиды.
Группа В – средний уровень потребления. Сюда вошли:
антибактериальные препараты, гормоны, антигистаминные средства,
спазмолитики.71,4 % данной группы входят в Перечень жизненнонеобходимых и важнейших лекарственных средств, 28,6 % не входят в
Перечень на них расходуется чуть больше 5% денежных средств (756905,07
руб.) Не вошедшие препараты: «Линекс», «Немозол», Вакцина антирабическая,
«Бифиформ», «Ксенетикс», «Макропен», «Липофундин», «Себиво», «Анаферон
детский», «Кортексин», «Биопарокс», «Телебрикс».
Группа С – препараты с низкой частотой использования. В Перечень
жизненно-необходимых и важнейших лекарственных средств входят 42 %
наименований.
VEN - анализ – метод анализа лекарств по клинической значимости,
позволяющий установить приоритеты для закупок лекарственных препаратов и
формирования формуляра лекарственных средств. Группы лекарственных
средств:

жизненно важные (Vital) – лекарства важные для спасения жизни,
имеющие опасный для жизни синдром отмены, постоянно необходимые для
поддержания жизни;

необходимые (Essential) – лекарства, эффективные при лечении
менее опасных, но серьѐзных заболеваний;
53

второстепенные (Non-essential) – лекарства для лечения лѐгких
заболеваний, сомнительной эффективности, дорогостоящие медикаменты с
симптоматическими показаниями.
V (Vital) – жизненно важные препараты; средства, используемые для
оказания экстренной помощи, поддержания витальных функций. Расходы на
эту группу составили 74,4% бюджета (10,2 млн. руб.). Сюда вошли
глюкокортикоиды, плазмозаменители, растворы для парентерального питания,
гемостатики, инсулины, антибиотики резерва, анестетики, сыворотки, вакцины,
анатоксины, ингибиторы протеолиза, антидоты, а также гепарин, адреналин,
сердечные гликозиды и др.
E (Essential) – необходимые. Препараты, определѐнные стандартами
лечения ГУЗ ОДКБ № 2; «базовые», использующиеся для лечения основных
нозологических форм заболеваний, посиндромной терапии. Финансовые
затраты составили 25,58% бюджета (3,5 млн. руб.). Группа представлена
антибактериальными препаратами первого ряда, противовирусными,
отхаркивающими средствами, муколитиками, антигистаминными, ферментами,
ноотропами,
спазмолитиками,
гепатопротекторами,
витаминами,
противосудорожными, препаратами железа, жаропонижающими, препаратами
для лечения специфических заболеваний (фансидар, немозол, медифокс и др.)
N (Non-essential) – второстепенные. Препараты, применяемые в составе
комплексной терапии; для лечения легких форм заболеваний, сомнительной
эффективности,
дорогостоящие
медикаменты
с
симптоматическими
показаниями. Расходы на эту группу составили 0,02% бюджета (3,2 тыс. руб.).
Это: аллохол, мазь «Вишневского», мазь «Гидрокортизоновая», вазелин
борный, валерианы настойка, корвалол, никотиновая кислота, «Аевит».
В течение 2009 года в нашем стационаре использовалось 277
международных непатентованных названий лекарственных средств, из них 179
входит в Перечень жизненно-необходимых и важнейших лекарственных
средств. Распределение по группам следующее: V – 125 наименование; E – 54,
N – наименования отсутствуют.
Выводы:
1. С учетом ABC - VEN анализа внесены изменения в Формуляр
лекарственных средств и заявку на медикаменты в 2009году.
2. В стационаре использовались наиболее эффективные и качественные
лекарственных средства, приоритет в закупках отводился препаратам,
входящим в Перечень жизненно-необходимых и важнейших лекарственных
средств.
3. Удалось достигнуть экономии денежных средств (92 тыс.руб.) за счет
снижения количества закупаемых препаратов категории N (второстепенных).
Заключение:
1.Данные АВС – VEN анализа необходимо использовать для определения
приоритетов закупок лекарственных средств на 2010 год.
2. При распределении лекарственных препаратов по клинической
значимости ориентироваться на Перечень жизненно- необходимых и
54
важнейших лекарственных средств, а так же разработанные в нашем
стационаре стандарты лечения.
3.
Необходимо максимально снизить затраты на приобретение
препаратов группы N (второстепенные).
55
ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ КВЕРЦЕТИНА И (+)-КАТЕХИНА
НА ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА
Беланова Н.А.1, Лозовская Т.С.2, Чепелева Е.О.1, Карпов С.И.1, Селеменев В.Ф.1
1
2
Воронежский государственный университет
Воронежская государственная технологическая академия
Силикагель остается наиболее часто применяемым сорбентом в
тонкослойной хроматографии. К силикагелям относят как собственно
силикагель, так и силикагель с привитыми фазами.
Силикагель
получают
самопроизвольной
полимеризацией
и
дегидратацией водного раствора кремниевой кислоты, которая в свою очередь,
образуется при подкислении раствора силиката натрия, как результат –
пористый твердый материал. Удельная поверхность и средний диаметр пор
силикагеля может изменяться в широком интервале значений (200-1000м2/г и
1,0-1500 нм соответственно).
Поверхность силикагеля содержит следующие группы:
- силоксановые группы;
-Si-O-Si- свободные силанольные группы;
- водород от молекул воды, связанный с силанольными группами;
- несорбированную «капиллярную» воду в объеме[1].
В данной работе использовались пластины двух видов: «Silufol», «SorbfilПТСХ-П-В».
Таблица 1.
Физические свойства силикагелей и типы связующих веществ
пластин, используемых марок
Марка
пластины
Диаметр
пор, нм
Объем
пор, мл/г
Silufol
SorbfilПТСХ-П-В
6
0,8
9-12
0,8
Удельная
Фракционный
поверхность,
состав, мкм
2
м /г
500
5-40
350
8-10
Толщина
слоя, мкм
Связующее
100
Крахмал
100-120
Силиказоль
Флавоноиды – самая распространенная группа биологически активных
соединений. Это соединения ароматического ряда, характеризующиеся общим
56
отличительным признаком: в их молекулах имеются гидроксильные группы,
непосредственно связанные с ароматическим ядром. Им присуща высокая
биологическая активность, обусловленная наличием в молекуле фенольных
гидроксилов и карбонильных групп, которые, подвергаясь различным
биохимическим изменениям, принимают участие в ряде физиологических
процессов [2, 3, 4, 5].
Наличие и варьирование положения ОН-групп полифенольных
соединений обуславливают хроматографические параметры удерживания, и
определяют условия их определения и разделения в экстрактах растительного
материала.
Использование силикагеля при проведении хроматографирования в
тонком слое сорбента предполагает закрепление полифенольных соединений за
счет поверхностных силанольных групп (рис.1).
Рис 1. Мономолекулярные слои при сорбции полифенольных
соединений
Изменение поверхностных свойств сорбента и локализация силанольных
групп может изменять удерживание полифенольных соединений.
Таблица 2.
Значение Rf для стандартных веществ на пластинах
«Sorbfil-ПТСХ-П-В»
Rf/элюент
Вещество
Кверцетин
(+)Катехин
амиловый
спиртуксусная
кислотавода (2:1:1)
0,82±0,01
0,78±0,01
бутанол –
уксусная кислотавода
(4:1:5)
0,83±0,01
0,79±0,01
бутанол уксусная кислота-вода
(40:12:29)
уксусная
кислота
60%
хлороформметанол-вода
(26:14:3)
0,83±0,01
0,79±0,01
0,87±0,01
0,91±0,01
0,83±0,01
0,72±0,01
На основании рассчитанных основных параметров хроматографирования
сделан вывод о том, что наиболее эффективной подвижной фазой является
57
смесь растворителей н-амиловый спирт – уксусная кислота – вода, взятых в
объемном отношении 2 : 1 : 1, на пластинах «Sorbfil-ПТСХ-П-В». Широкий
фракционный состав гранул сорбента в случае пластин «Silufol» обуславливает
большее размывание пятен, что объясняется значительной вихревой
диффузией. Последнее ухудшает разделение полифенольных соединений.
Таким образом, наряду со структурой флавоноида большое значение имеют
поверхностные свойства сорбента.
Литература
1.
Ф. Гейсс. Основы тонкослойной хроматографии, Том 1. Пер. с
англ./ Ф. Гейсс; под ред. В.Г. Березкина 406 с.
2.
Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений / М.Н.
Запрометов. - М.: Высшая школа, 1974.-213 с. // М.-1999г. 406 с.
3.
Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычина Р.А., Толстиков.
Природные флавоноиды/ Д.Ю. Корулькин.- Новосибирск: Гео, 2007.-232с.
4.
Запрометов М.Н. Биохимия катехинов/М.Н.Запрометов.М.:Наука,1964.-295с.
5.
Химический анализ лекарственных растений/ под.ред. Н. И.
Гринкевич., Л. Н. Сафронович. -М.: Высшая школа,1983, 176 с.
58
СТРУКТУРНО-ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ
СУЛЬФОКАТИОНООБМЕННИКА В ФОРМЕ ГЛИЦИНА
Белашова Г.М., Бутырская Е.В., Шапошник В.А., Селеменев В.Ф.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Ионообменники широко применяются в качестве сорбентов при
хроматографическом
разделении
и
концентрировании
аминокислот.
Закономерности их сорбции и характеристики хроматографического
разделения могут быть проинтерпретированы на основе компьютерного
моделирования структуры и свойств аминокислот и ионообменников. В работе
выполнен квантово-химический расчет гидратации цвиттер-иона глицина и
структурно-групповой анализ сульфокатионообменника КУ-2 в форме данной
аминокислоты. Компьютерное моделирование проведено с использованием
программы Gaussian03 методом Хартри – Фока в базисе 6-311G(d,p). При
исследовании гидратации к карбоксильной группе и аминогруппе молекулы
глицина постепенно добавляли по одной молекуле воды до полного заполнения
гидратной оболочки данной аминокислоты. Расчет показал, что при
фиксированном количестве молекул воды возможно образование нескольких
гидратных структур. Все гидратные структуры цвиттер-иона глицина были
проанализированы и из них выбраны более энергетически выгодные. Анализ
гитратированных структур цвиттер-иона глицина показывает, что наиболее
гидрофильной является карбоксильная группа аминокислоты, поскольку ее
гидратная оболочка заполняется в первую очередь. Максимальное число
гидратации для карбоксильной группы равно 4, а для аминогруппы – 3.
Анализ рассчитанных ИК спектров
оптимизированных
структур
сульфокатионообменника в форме глицина
показал, что наблюдается хорошее согласование
рассчитанных частот валентных колебаний с
экспериментальными значениями для структур,
в которых катион глицина отделен от
сульфогруппы катионообменника молекулами
воды.
Оптимизированная
структура
репрезентативного
фрагмента
сульфокатионообменника в форме глицина с
гидраторазделенной
ионной
парой,
рассчитанная с 5 молекулами воды, представлена на рисунке. Для структур с
контактной ионной парой расхождение теории и эксперимента превышает
погрешность определения колебательных частот. Таким образом, структурногрупповой анализ сульфокатионообменника в форме глицина показывает, что
энергия активации транспортных процессов в ионообменниках равна сумме
энергии разрыва водородной связи между гидратными оболочками
59
противоионов и ионной связи между противоионами. Понимание механизма
транспорта
позволяет
оптимизировать
процессы
разделения
в
хроматографическом анализе.
60
РАЗРАБОТКА НОВЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ С ЦЕЛЬЮ
ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Беленова А.С., Ковалева Т.А., Сливкин Д.А., Сливкин А.И., Лапенко В.Л.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Липаза (триацилглицерол-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.3) находит свое
применение в различных областях промышленности и медицине. Уникальные
каталитические свойства липолитических ферментов позволяют использовать
их для получения различных соединений, как в лабораторных, так и в
промышленных масштабах [1]. Они могут входить в состав лекарственных
средств при заместительной терапии, а также выступают в качестве агентов,
специфически разрушающих нежелательные продукты обмена веществ в
организме больного. Современная фармацевтическая промышленность
выпускает следующие препараты, содержащие липазу: «Панзим форте»,
«Мезим форте», «Фестал», «Мексаза» и многие другие [2].
Известно, что биокатализаторы могут применяться как в свободной, так и
в иммобилизованной формах. Закрепление фермента на нерастворимой
матрице приводит к повышению стабильности белковых препаратов по
отношению к денатурирующим воздействиям внешней среды, а также
способствует многократному применению энзимов в различных областях
промышленности. В настоящее время особое внимание исследователи уделяют
вопросам подбора носителей для ферментов, используемых в качестве
самостоятельных лекарственных препаратов.
Одним из таких носителей является хитозан – сополимер D-глюкозамина
и N-ацетил-D-глюкозамина. За счет большого количества водородных связей он
является универсальным сорбентом, который может связывать огромный
спектр веществ органической и неорганической природы, в том числе и
ферментов [3].
В связи с возможным использованием хитозана как самостоятельного
лекарственного препарата, его высокой биологической совместимостью и
низкой токсичностью данный гликан становится перспективным носителем для
создания новых лекарственных препаратов пролонгированного действия.
В данной работе изучалась адсорбционная иммобилизация липазы на
различных типах хитозанов.
Объектом исследований является фермент липаза из Rhizopus niveus
(«Sigma»). В качестве носителей использовались образцы хитозана, полученные
на кафедре фармацевтической химии и фармацевтической технологии
Воронежского государственного университета.
Иммобилизацию липазы на нерастворимых носителях осуществляли
следующим образом: 5 грамм носителя оставляли на 12 часов при комнатной
температуре в 50 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 7,0). 5 мл раствора
липазы (10-5 моль/л) добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с
61
помощью электрической мешалки в течение 1,5 часов при температуре 25 С.
Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут,
осадок промывали буфером (рН 7,0) до отсутствия белка в промывных водах,
контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-46 при 280 нм.
Адсорбцию липазы на растворимом хитозане проводили добавлением к 5
мл раствора хитозана (10-4 моль/л) 5 мг липазы и инкубированием в течении 2
часов (250С) при постоянном перемешивании
Определение количества белка в препарате свободной липазы
осуществляли методом Лоури, в иммобилизованном ферменте –
модифицированным методом Лоури [4].
Каталитическую активность свободной и иммобилизованной липазы
измеряли при помощи метода Андерсона-Маккарти [5].
Экспериментально показано, что липаза, иммобилизованная на
низкомолекулярном хитозане (1 0,2 кДа), сохраняет 41% активности
растворимого фермента, на высокомолекулярном носителе (10 кДА) - 24 %, а
при связывании с растворимым хитозаном (0,84 0,2 кДа) - 55 % активности
нативной липазы.
А, ед/мг
14
12
10
8
6
1
4
2
0
4
2
3
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Т,оС
Рис. 1. Зависимость каталитической активности свободной и
иммобилизованной липазы от температуры гидролиза:
1. – свободная липаза;
2. – липаза, иммобилизованная на низкомолекулярном хитозане;
3. – липаза, иммобилизованная на высокомолекулярном хитозане;
4. – липаза, иммобилизованная на растворимом хитозане.
На рис. 1 показано, что при иммобилизации фермента на
высокомолекулярном хитозане оптимальная температура гидролиза смещается
в сторону более высоких значений и составляет 45 оС. Для липазы,
иммобилизованной на низкомолекулярном хитозане, данного эффекта не
наблюдается, оптимальная температура гидролиза остается неизменной и
составляет 37 оС. Связывание энзима с растворимым носителем приводит к
62
расширению диапазон оптимальных значений температуры гидролиза от 37 ˚С
до 45 ˚С.
При изучении влияния рН на каталитическую активность нативной и
иммобилизованной на хитозане липазы, установлено, что адсорбция фермента
на носителях не приводит к изменению оптимальных значений pH (рис. 2).
А, ед/мг
12
10
1
8
6
4
2
4
3
2
0
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
pH
Рис. 2. Зависимость каталитической активности свободной и
иммобилизованной липазы от pH среды:
1. – свободная липаза;
2. – липаза, иммобилизованная на низкомолекулярном хитозане;
3. – липаза, иммобилизованная на высокомолекулярном хитозане;
4. – липаза, иммобилизованная на растворимом хитозане.
Таким образом, проведенные исследования показали, что изменение
молекулярной массы используемого хитозана дает возможность получать
ферментные препараты с различными функциональными особенностями, в
зависимости от сферы их применения.
Литература
1. Брокерхоф К. Липолитические ферменты /К. Брокерхоф, Р. Дженсен. –
М.: Мир, 1978. – 396 с.
2. Кабанова В.С. Совещание по применению ферментных препаратов /
В.С. Кабанова // Фермент. и спиртовая пром-ть. – 1983. – Т. 7. – С. 41-43.
3. Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г.
Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М: Наука, 2002. - 368 с.
4. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent/ O.H.
Lowry, N.J. Rosebrougn, A.L. Farr, R.J. Randall // J Biol Chem. – 1951. – V.193,
№1. – P. 265 - 275.
5. Anderson M.M. Rapid and sensitive assay for free fatty acids using
rodamine 6G / M.M. Anderson // Anal. Biochem. – 1972. – V.45, №1. – P. 271-276.
63
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ В
ПОЛИВИТАМИННЫХ КОМПЛЕКСАХ МЕТОДОМ
КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Богачук М.Н. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова
Витамины участвуют во множестве биохимических реакций, выполняя
каталитическую функцию в составе активных центров большого количества
разнообразных ферментов либо выступая регуляторными посредниками,
выполняя сигнальные функции экзогенных прогормонов и гормонов.
Концентрация витаминов в тканях и суточная потребность в них
невелики, но при недостаточном поступлении витаминов в организме
наступают характерные и опасные патологические изменения. Большинство
витаминов не синтезируются в организме человека, поэтому они должны
регулярно и в достаточном количестве поступать в организм с пищей или в
виде витаминно-минеральных комплексов и биологически активных добавок к
пище.
На современном этапе развития методов анализа водорастворимых
витаминов встал вопрос о методе, который бы позволил одновременно
определить эти витамины в витаминных комплексах с целью контроля качества
этих препаратов, тем самым уменьшив затраты времени и средств. Для
качественного и количественного анализа внесенных витаминов в нашей стране
традиционно применяются различные методы анализа в соответствии с ГФ X,
XI и XII, а именно, титрование, спектрофотометрию, полярографию,
флуорометрию, фотоэлектроколориметрию. Указанные методы являются
трудоемкими, что затрудняет изучение содержания витаминов в
поливитаминных комплексах. Также используют метод высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но он упоминается лишь в разделе
«Посторонние примеси».
Капиллярный электрофорез является сравнительно новым методом,
позволяющим с меньшими затратами решить эту задачу. Он подходит для
разделения различных проб и дополняет классические методы разделения,
такие как ВЭЖХ и газовая хроматография (ГХ). Метод основан на принципе
разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном
электрическом поле. По сравнению с другими разделяющими методами
анализа, капиллярный электрофорез имеет следующие преимущества:
– экономичность, т.к. практически не требуется применение
дорогостоящих высокочистых растворителей (ацетонитрил, метанол,
гексан) и малый расход реактивов;
– отсутствие дорогостоящих хроматографических колонок;
– отсутствие дорогостоящих прецизионных насосов высокого давления,
необходимых для ВЭЖХ;
– простота аппаратурного оформления;
64
– экспрессность анализа и возможность одновременного определения
нескольких биологически активных веществ.
Целью нашей работы являлась разработка метода качественного и
количественного определения водорастворимых витаминов (тиамина хлорида,
рибофлавина, пиридоксина, никотинамида, фолиевой и аскорбиновой кислоты)
методом капиллярного электрофореза в витаминно-минеральных комплексах и
биологически активных добавках к пище.
Навеску измельченного образца помещали в мерную колбу на 100 мл,
добавляли 50 мл дистиллированной воды, озвучивали в УЗ-ванне в течении 4-х
минут, доводили до объема дистиллированной водой и перемешивали.
Полученный раствор центрифугировали в течение 10 минут при 14000-15000
об/мин. и анализировали надосадочную жидкость.
В работе была использована система капиллярного электрофореза Agilent
3D CE с диодноматричным детектором. Перед работой новый капилляр
последовательно промывали 5 минут 1 М раствором гидроксида натрия, 5
минут деионизированной водой и 5 минут рабочим буфером. Между анализами
для промывки капилляра использовали следующую схему: 3 минуты 0,1 М
раствором гидроксида натрия, 3 минуты деионизованной водой и 3 минуты
рабочим буфером.
Разделение проводили в следующих условиях: рабочий буфер – 50 мМ
боратный буфер (рН=9,3); кварцевый капилляр Lэфф/Lобщ=36/56 см, ID=50
мкм; температура термостата 25°С; эффективное напряжение 25 кВ. Общее
время анализа 22 минуты. Детектирование проводили на длинах волн 254 нм и
292нм.
аскорбиновая кислота
mAU
700
600
500
400
300
никотинамид
тиамина
хлорид
200
рибофлавин
100
фолиевая
кислота
пиридоксин
0
4
6
8
10
12
14
Рис.1 Электрофореграмма разделения витаминов в образце
65
16
min
Время миграции составило: тиамина хлорид – 4,2 мин., рибофлавин – 8,2
мин., пиридоксин – 9,2 мин., аскорбиновая кислота – 12,0 мин., никотинамид –
13,7 мин., фолиевая кислота – 16,9 мин.
Проведенные исследования показали возможность быстрого и менее
трудоемкого определения качественного и количественного содержания
водорастворимых витаминов в витаминно-минеральных комплексах и
биологически активных добавках к пище.
66
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ ВОЛН НА ЭКСТРАКЦИЮ
САПОНИНОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Боева С.А.1, Чусова Т.В.2, Казьмина О.М.1, Родивилова А.Ю.1
1
2
Воронежский государственный университет
ГУЗ «Воронежский центр контроля качества и сертификации
лекарственных средств»
Ультразвуковые волны используют в производстве экстракционных
препаратов для ускорения процесса экстрагирования лекарственного сырья и
обеспечения полноты извлечения действующих веществ. Воздействующий на
лекарственное растительное сырье ультразвук создает знакопеременное
давление, кавитацию и «звуковой ветер». В результате происходит ускорение
пропитки материала и растворение содержимого клетки, увеличение скорости
обтекания частиц сырья, в пограничном диффузионном слое экстрагента
образуются турбулентные и вихревые потоки. Молекулярная диффузия внутри
растительного материала и в диффузионном слое практически сменяется на
конвективную, что приводит к интенсификации массообменных процессов.
Возникновение кавитации вызывает разрушение клеточных структур.
Ускорение процесса экстрагирования в данном случае происходит за счет
вымывания экстрактивных веществ из клеток и тканей растительного
материала. При озвучивании вытяжку можно получить в течение нескольких
минут. Однако ультразвуковые волны не являются индифферентным агентом
по отношению к действующим веществам: могут вызывать кавитацию,
ионизацию молекул, изменять свойства биологически активных веществ,
понижать или усиливать их терапевтическую эффективность, поэтому их
применение требует тщательного экспериментального исследования [1].
Целью настоящей работы явилось изучение влияния ультразвуковых волн
на экстракцию тритерпеновых сапонинов из растения Beta vulgaris L. conditiva
Alef.
Извлечение сапонинов из растительного сырья проводили щелочной
экстракцией, при этом дополнительно вводили стадию ультразвукового
воздействия. В работе использовали ультразвуковую ванну «Град»; мощность
ультразвука варьировали от 30 до 100%, время воздействия – 5 и 10 минут.
Диаметр частиц сырья 1-2 мм. Экстракцию осуществляли при температуре
70º С. Полученные фракции очищали органическими растворителями. В табл. 1
представлены результаты исследования влияния ультразвука на количество
извлеченных веществ. В эксперименте №1 после экстракции щелочью
переосаждение кислотой проводили по отработанной методике через 12 часов,
в экспериментах №2-7 – сразу после охлаждения раствора.
Анализируя данные таблицы, следует отметить, что воздействие
ультразвуковых волн в процессе экстрагирования биологически активных
веществ из растительного сырья повышает их выход в среднем в 1,5 раза, при
67
этом наиболее эффективным является использование ультразвука 100%
мощности в течение 10 минут.
Таблица 1.
Влияние ультразвуковых волн на экстрагирование биологически
активных веществ из растительного сырья
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
Условия проведения экстракции
m сырья, г
M извлечения, г
τ = 30 мин., без УЗ
τ = 25 мин. + 5 мин. УЗ min (30%)
τ = 20 мин. + 10 мин. УЗ min (30%)
τ = 25 мин. + 5 мин. УЗ (50%)
τ = 20 мин. + 10 мин. УЗ (50%)
τ = 25 мин. + 5 мин. УЗ max (100%)
τ = 20 мин. + 10 мин. УЗ max (100%)
3,0580
3,0390
3,0569
3,0017
3,0099
3,0613
3,0143
0,0097
0,0144
0,0145
0,0158
0,0155
0,0139
0,0167
Выход,
%
0,32
0,47
0,47
0,53
0,52
0,45
0,55
Поскольку в процессе экстрагирования вместе с сапонинами из
растительного сырья могут извлекаться сопутствующие вещества, определяли
сумму сапонинов в полученных фракциях УФ-спектрофотометрическим
методом по реакции с концентрированной серной кислотой.
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
220
270
320
370
образец №1
образец №3
образец №5
образец №7
Рис. 1. Спектры сапонинов, полученные после гидролиза (τ = 2 часа)
Содержание суммы сапонинов рассчитывали относительно образца №1
(извлечение традиционным способом). Определили, что УЗ воздействие
ускоряет технологический процесс получения сапонинов и позволяет увеличить
их выход за меньший отрезок времени.
68
Исследовали гемолитическую активность сапонинов в полученных
извлечениях методом хроматографии в тонком слое сорбента. Использовали
две подвижные фазы: н-бутанол-этанол-25% аммиак (7:2:5) и н-бутанолуксусная кислота-вода (5:1:4), детектирующий реагент – желатин с
дефибринизированной кровью. Во всех образцах обнаружены три светлых
пятна гемолизирующих веществ со значениями Rf1 = 0,47, Rf2 = 0,53, Rf3 = 0,60
(в первой системе), Rf1 = 0,37, Rf2 = 0,44, Rf3 = 0,71 (во второй системе
соответственно).
Таким образом, установлено, что использование ультразвуковых волн
позволяют сократить время извлечения сапонинов из растительного сырья, не
изменяя при этом их биологически активных свойств.
Литература
[1] Технология лекарственных форм / Под ред. Л.А. Ивановой. – М.:
Медицина, 1991. – 544 с.
69
ПРОЦЕССЫ СЛИЯНИЯ И ПОГЛОЩЕНИЯ
НА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ РЫНКЕ: СОСТОЯНИЕ, ОЦЕНКА
Болдырева Е.В., Чупандина Е.Е., Бобина А.А. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Одной из характерных черт российского фармацевтического рынка в
условиях кризиса является активизация процессов слияния/поглощения. Это
обусловлено двумя группами причин, имеющих разнонаправленное действие. С
одной стороны, это попытка финансово несостоятельных фармацевтических
организаций уйти от банкротства через процессы поглощения, с другой –
удобный случай для укрупнения доли рынка за счет слияния двух и более
субъектов рынка.
Как в первом, так и во втором случае процессу слияния/поглощения
субъектов фармацевтического рынка предшествует анализ инвестиционной
привлекательности сделки, целью которой выступает обоснование
целесообразности ее проведения, прогнозирование эффективности интеграции
и определение степени риска [1].
Инвестиционная привлекательность является предметом научных работ
А.А. Агеенко, П.В. Виленского, Д.А. Ендовицкого, В.В. Ковалева, А.И.
Ковалева, М.Н. Крейниной, В.А. Лившица, В.А. Москвина, В.Е. Соболевой,
Н.Ю. Трясциной и др. Вопросы изучения инвестиционной привлекательности
на фармацевтическом рынке освещены в работах С.Б. Пашутина, Е.Е.
Чупандиной. Разработаны подходы по оценке и анализу инвестиционной
привлекательности отраслевых рынков в целом и его сегментов, отдельных
организаций. Обобщая позиции ряда авторов, следует отметить, что до
настоящего времени нет четкого и единого понимания в подходах ученых при
определении понятийной категории «инвестиционная привлекательность», что
влечет за собой различную интерпретацию полученных результатов при
использовании
классических
подходов
в
оценке
инвестиционной
привлекательности различными заинтересованными сторонами.
Одной из актуальных задач при исследовании инвестиционной
привлекательности процессов слияния и поглощения является изучение
многофакторной природы ее формирования. Результаты проведенного контенанализа научной литературы по анализу влияния факторов макро- и микросреды на инвестиционную привлекательность свидетельствуют об отсутствии
работ в области оценки состояния процессов слияния и поглощения на
фармацевтическом рынке России, что послужило основанием для их
проведения.
Информационной базой обзора состояния рынка слияний и поглощений в
сфере обращения лекарственных средств выступили данные аналитического
портала «Mergers.ru» и аналитического издания «Слияния&Поглощения» за
период с 2004 по 2009 годы. В выборку попали только завершенные сделки по
70
слияниям и поглощениям на фармацевтическом рынке Российской Федерации
с ценой не менее 5 млн дол.
За исследуемый период выявлены два периода в развитии рынка слияний
и поглощений: 2004-2007 гг. и 2008 г. – по настоящее время. Первый период
характеризуется ростом числа сделок (базисный темп прироста 66,7%),
стоимости сделок (базисный темп прироста 223,9%) и ее средней стоимости
(базисный темп прироста 80%). Для второго периода характерно значительное
снижение исследуемых показателей. Сложившаяся тенденция характерна и для
наиболее крупных сделок (более 100 млн. дол.), совершенных на
фармацевтическом рынке за исследуемый период: число сделок до 2008 года
составило 6, с 2008 года по настоящее время таких сделок не совершено.
Анализ процессов слияний и поглощений на фармацевтическом рынке по
национальной принадлежности показал, что приоритетным направлением для
исследуемого рынка являются внутренние сделки, которые составили в 2004г. –
80% от числа совершенных сделок, в 2005г. – 100%, в 2006г. – 83,3%, в 2007г. –
84,6%, в 2008г. – 50,0%.
В процессах слияний и поглощений на фармацевтическом рынке с
позиции экспортной интеграции, наметилась положительная динамика, что
явно свидетельствует о росте доверия иностранных инвесторов к РФ.
Интересы российских инвесторов также расширяются, так в феврале
2008г. ЗАО «Фарм-синтез» (г. Москва) купил во Франции фармацевтический
завод (цена сделки - 25 млн. дол.). До этой сделки никто из отечественных
компаний не выходил на рынки Европы через покупку производства.
В период с 2004-2007 гг. в структуре сделок основными объектами
выступали аптечные сети: в 2004 г. – 80% сделок, в 2006 г. – 66,6%, в 2007 г. –
76,9%. Начиная с 2008 г. эта тенденция была нарушена и основным объектом
сделок выступили фармацевтические заводы, которые занимают 50% от общего
числа сделок. В равных долях в качестве объектов выступили
фармацевтические дистрибьюторы и аптечные сети – по 25%.
При исследовании сделок слияния/поглощения в зависимости от
направления интеграции предприятий выявлено, что количество вертикальных
сделок уменьшается в каждом отчетном году. Следует отметить, что
горизонтальные сделки составляют 76,3 % от общего количества сделок. Это
указывает на то, что фирмы в большинстве случаев приобретают организации,
которые функционируют в одной области и на одном этапе производственного
цикла. Значительное увеличение количества горизонтальных сделок в 2007 г.
связано с приобретением аптечных организаций различных областей РФ
аптечной сетью «36,6» (г. Москва). Единственным примером конгломератного
поглощения выступает сделка в 2008 г. по приобретению группой компаний
«Агрика» (ОАО «Агрика Продукты питания») контрольного пакета акций ЗАО
«Биофарм»-производителя биологических и фармацевтических препаратов, а
также вакцин для животных (Республика Мордовия, г. Саранск).
Проведенное
исследование
продемонстрировало,
что
влияние
финансового кризиса на фармацевтический рынок проявляется, в том числе, и
на процессах слияния и поглощения через снижение их активности. В этих
71
условиях надежность, адекватность используемых методик по оценке
инвестиционной активности приобретает первостепенное значение.
Для установления пригодности классических методик в оценке
инвестиционной привлекательности процессов слияния и поглощения на
фармацевтическом рынке, нами было проведено пилотное исследование на
одном из российских фармацевтических заводов с использованием авторской
методики, разработанной под руководством профессора Д.А. Ендовицкого [1].
Причиной выбора данной методики послужила ее отраслевая
универсальность и возможность использования во всех случаях слияния и
поглощения безотносительность характера и направления сделки.
Инвестиционная привлекательность сделок оценивается по совокупному
показателю, полученному путем экспертного оценивания пяти направления
функционирования предприятия-цели. Под предприятием-целью понимается
объект сделки. В нашем случае, предприятие-цель имеет частную форму
собственности и представляет собой закрытое акционерное общество. В
качестве экспертов выступили руководители фармацевтического предприятия.
По результатам обработки анкет инвестиционная привлекательность
исследуемого объекта оценена как средняя по трехуровневой шкале. Вместе с
тем, в качестве замечаний экспертов прозвучала необходимость практической
адаптации используемой методики к особенностям функционирования
объектов фармацевтического рынка. В частности, весовые коэффициенты
блоков, по мнению экспертов, требуют существенной корректировки, блок по
оценке диверсификации продукции недостаточно отражает специфику
формирования ассортиментного портфеля для производителей.
Таким образом, результаты пилотного исследования показали
необходимость
проведения
комплексного
исследования
факторов,
оказывающих
влияние
на
инвестиционную
привлекательность
фармацевтических предприятий и последующим их отражением в оценке
инвестиционной привлекательной.
Литература
Ендовицкий Д.А. Экономический анализ слияний/поглощений компаний
: науч. изд. / Д.А. Ендовицкий, В.Е. Соболева. – М. : КНОРУС, 2008. – 448с.
72
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗИТРОМИЦИНА
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
Бредихина Т.А.1, Панкрушева Т.А.2 e-mail: [email protected]
1
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
2
Курский государственный медицинский университет
К антибиотикам широкого спектра действия относится азитромицин,
часто применяемый клиницистами в терапии многих урогинекологических
заболеваний таких, как: гонорея, уретрит и уретральный синдром, инфекции
мочевыводящих путей без установленной локализации, воспалительные
болезни шейки матки, воспалительные болезни женских тазовых органов не
уточненной этиологии. В настоящее время выпускаются препараты
азитромицина для внутреннего и инъекционного путей введения. Однако, в
гинекологической практике наряду с таблетками и инъекциями широко
используются лекарственные формы для местного применения. Нами
разработаны мази и суппозитории для интравагинального введения,
содержащие в качестве основного компонента азитромицин.
Важным показателем, определяющим качество лекарственных
препаратов, является количественное содержание лекарственного вещества и
его стабильность в процессе хранения. В связи с этим, целью нашей работы
явилась разработка надежной и чувствительной методики количественного
определения азитромицина в лекарственных формах для местного применения
с использованием УФ-спектрофотометрии.
Объектами исследования явились экспериментальные образцы мазей и
суппозиториев с азитромицином, приготовленные на разрешенных к
медицинскому применению основах. Все используемые вещества
удовлетворяли фармакопейным требованиям.
Для выбора аналитической длины волны предварительно был построен
спектр поглощения используемой субстанции азитромицина. С учетом
рекомендаций нормативной документации в качестве растворителя и раствора
сравнения был выбран 0,05 М раствор калия фосфата двузамещенного в смеси
ацетонитрил : вода (11:9). Спектр азитромицина в используемом растворителе
имеет один максимум при длине волны 210±2 нм, что соответствует
фармакопейным статьям и литературным данным.
Для установления возможности использовать данную длину волны в
качестве аналитической был построен калибровочный график. Зависимость
оптической плотности азитромицина от его концентрации при длине волны
210±2 нм носит линейный характер и подчиняется объединенному закону
светопоглощения в интервале от 0,17 до 0,69 мг/мл.
Для количественного анализа азитромицина в разрабатываемых
лекарственных формах был выбран расчетный метод с использованием
молярного коэффициента поглощения. Для его определения готовили серию
стандартных растворов с содержанием азитромицина 0,0005 моль/л так, как при
73
данной концентрации ошибка измерения минимальна. В качестве растворителя
и раствора сравнения использовали 0,05 М раствор калия фосфата
двузамещенного в смеси ацетонитрил : вода (11:9). Измерение оптической
плотности проводили на спектрофотометре марки СФ-46 при длине волны 210
нм. Проводили по пять параллельных опытов. Среднее значение молярного
коэффициента поглощения, рассчитанное по известной формуле, составило
860 моль–1·л·см–1, что позволяет использовать его для количественного
определения азитромицина по разработанной методике.
Для проведения спектрофотометрического определения в исследуемых
образцах мазей и суппозиториев необходимо было подобрать оптимальные
условия количественного извлечения азитромицина из лекарственных форм и
установить степень влияния основ и других компонентов на проведение
анализа.
Точные навески образцов мазей или суппозиториев помещали в 50 мл
0,05 М раствора калия фосфата двузамещенного в смеси ацетонитрил : вода
(11:9) и нагревали на кипящей водяной бане до полного расплавления основы,
тщательно взбалтывая. После охлаждения полученную вытяжку фильтровали
через предварительно промытый тем же растворителем бумажный фильтр в
мерную колбу на 50 мл и доводили объем до метки. Отбирали 1 мл
полученного раствора в мерную колбу вместимостью 20 мл, доводили до
метки 0,05 М раствором калия фосфата двузамещенного в смеси ацетонитрил :
вода (11:9) и перемешивали. Оптическую плотность измеряли на
спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 210
нм. Содержание азитромицина в суппозиториях и мазях рассчитывали,
используя молярный коэффициент поглощения.
С целью установления влияния компонентов основ на спектр
поглощения азитромицина определяли оптическую плотность вытяжек из
лекарственных форм-плацебо. Для этого готовили извлечение из
экспериментальных образцов суппозиториев и мазей на соответствующих
основах, не содержащих действующее вещество. Получение извлечений и
измерение оптической плотности проводили по той же методике. Результаты
исследований показали, что измеренная оптическая плотность для всех
образцов в максимуме спектра поглощения азитромицина не превышала
ошибки прибора. Это позволило в дальнейшем в качестве раствора сравнения
использовать 0,05 М раствор калия фосфата двузамещенного в смеси
ацетонитрил : вода (11:9).
Найденные условия обеспечивают практически полное извлечение
азитромицина из лекарственных форм, при этом компоненты основ не
оказывают заметного мешающего влияния. Таким образом, предложена
простая, экономичная и воспроизводимая методика экстракционного
спектрофотометрического определения азитромицина в лекарственных формах
для местного применения в УФ-области.
74
ОЦЕНКА БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ТАБЛЕТОК КАПТОПРИЛА
РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ТЕСТА «РАСТВОРЕНИЕ»
Брежнева Т.А., Казацкая Ю.Н.
Воронежский государственный университет
На сегодняшний день ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента
являются самыми востребованными препаратами в кардиологии. Ингибиторы
АПФ
относятся
к
финансово
доступным
препаратам,
причем,
воспроизведенные лекарственные средства, как правило, значительно дешевле
оригинальных. Одним из наиболее востребованных лекарственных препаратов
является каптоприл, на долю которого приходится 70% продаж препаратов
данной группы. В настоящее время в России официально зарегистрировано 37
препаратов
каптоприла,
изготовленных
различными
фирмами
производителями. Воспроизведенные препараты каптоприла требуют
проведения текущего контроля качества, так как перенесение данных по
эффективности и безопасности, полученных на оригинальных препаратах, на
их копии недопустимо. Основным видом контроля подобных лекарственных
препаратов является оценка их биоэквивалентности, основанная на сравнении
биодоступности генерического и эталонного (оригинального) лекарственного
препарата.
Одним из испытаний in vitro, позволяющих получить необходимые
данные о процессе высвобождения действующего вещества из лекарственной
формы, поступлении его в организм, и сделать предварительный вывод о
биоэквивалентности воспроизведенных и оригинальных препаратов, а также
выявить фальсифицированную продукцию, является анализ дозированной
лекарственной формы с использованием биофармацевтического теста
«растворение».
Целью настоящей работы являлось исследование биоэквивалентности
таблеток каптоприла различных фирм - производителей с применением теста
«растворение».
Для исследования биоэквивалентности были выбраны таблетки
«Капотен» (НД № 42-0017028406; производитель - фирма «Акрихин» в
сотрудничестве с предприятием – разработчиком препарата «Bristol-Myers
Squibb» (США)), лидирующие по объему продаж на рынке каптоприла (77%), а
так же широко представленные в аптеках города таблетки «Каптоприл» фирм
«Озон» (НД № 42-022906) и «Щелковский витаминный завод» (НД № 42 –
252807).
Испытание проводилось на приборе «Вращающаяся корзинка» 545-АК-7.
Объем среды растворения, в соответствии с НД, составлял 1000 см3,
температура 37 ± 0,5 0 С. Согласно требованиям НД на исследуемые препараты,
время растворимости Каптоприла в 0,1М кислоте хлороводородной составляло
25 минут, скорость вращения корзинки – 50 оборотов в минуту.
75
В первые 5 минут растворения пробы отбирали с интервалом в одну
минуту, с пятой минуты от начала испытания пробы отбирали с интервалом в 5
минут. В соответствии с ОФС «Растворение» после каждого отбора пробы
проводили восполнение среды растворения в эквивалентном объеме – 5,00 см3.
Профильтрованные растворы анализировали на спектрофотометре СФ-2000 в
максимуме поглощения 204 нм. В качестве рабочего стандартного образца при
получении градуировочных зависимостей использовали субстанцию
каптоприла (НД
42-133-56-04). Процент высвобождения действующего
вещества был рассчитан относительно 100% -го содержания в таблетках,
полученного в результате количественного определения как среднее из 5
параллельных определений. Полученные нами профили растворения
представлены на рис. 1.
Рис. 1. Средние профили высвобождения каптоприла из таблеток
различных фирм – производителей в среде 0,1 М HCl
Анализируя данные рисунка можно отметить, что наиболее равномерное
высвобождение лекарственного вещества наблюдается у таблеток фирмы
Акрихин: уже к 5-й минуте от начала испытания концентрация лекарственного
вещества в среде растворения составляет 82%, затем содержание действующего
вещества в растворе плавно возрастает и достигает максимума на 25-й минуте
растворения. Высвобождение каптоприла из таблеток фирмы Щелковский
витаминный завод происходит более стремительно – максимальная
концентрация действующего вещества в среде растворения наблюдается уже на
76
15-й минуте испытания. Средний профиль растворения таблеток фирмы Озон
отличен от профилей растворения таблеток фирм Акрихин и Щелковский
витаминный завод. В течение первых трех минут испытания в среде
растворения не обнаружено действующего вещества. Однако с 4-й минуты от
начала растворения концентрация каптоприла в растворе резко возрастает, и
полное высвобождение лекарственного вещества наблюдается на 15-й минуте
испытания.
Таким образом, на этапе визуальной оценки, можно предположить, что
биоэквивалентны таблетки фирм Акрихин и Щелковский витаминный завод, а
таблетки фирмы Озон отличаются и по скорости, и по количеству
высвобождаемого действующего вещества в те же временные отрезки.
Помимо визуальной оценки сопоставимость полученных зависимостей
оценивалась с использованием коэффициентов различия и подобия, методика
определения которых была одобрена Center for Drug Evaluations and Research
(FDA) и Human Medicinal Evaluations Unit of The European Agency for the
Evaluations of Medicines Products (EMEA) в качестве критериев оценки подобия
профилей растворения in vitro.
Расчет коэффициента различия (f1) и коэффициента подобия
(f2)
проводили по формулам:
f1= (Σ |Rj - Tj|)*100: ΣRj
f2= 50* log {[1+1/n (Σ |Rj – Tj|2)]-0,5*100},
где Rj и Tj – процент растворившегося вещества в каждый момент
времени для таблеток каптоприла каждой из сравниваемых фирм [2]. Профили
растворения принято считать подобными, если значения коэффициента
различия находятся в диапазоне значений от 0 до 15, а коэффициента подобия –
от 50 до 100. Коэффициенты рассчитывали, сравнивая полученные профили
растворения таблеток разных фирм – производителей попарно друг с другом.
Результаты вычислений представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1.
Значения коэффициентов различия профилей растворения
таблеток каптоприла различных фирм – производителей
Коэффициент различия (f1), %
Акрихин и
Щелково
11,2
(норма 0-15)
Акрихин и
Озон
Щелково и
Озон
47,5
51,4
77
Таблица 2.
Значения коэффициентов подобия профилей растворения таблеток
каптоприла различных фирм – производителей
Коэффициент подобия (f2), %
Акрихин и
Щелково
50,9
(норма 50-100)
Акрихин и
Озон
Щелково и
Озон
17,6
14,4
Из таблиц видно, что коэффициенты подобия и различия укладываются в
границы интервала нормы только для таблеток фирм Акрихин и Щелковский
витаминный завод, что свидетельствует о биоэквивалентности таблеток данных
производителей.
78
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТА «РАСТВОРЕНИЕ» ДЛЯ ОЦЕНКИ
БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ТАБЛЕТОК КО-ТРИМОКСАЗОЛА
РАЗЛИЧНЫХ ФИРМ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
Брежнева Т.А., Мануковская Д.С.
Воронежский государственный университет
Фармацевтический рынок России характеризуется высокой долей оборота
воспроизведенных лекарственных средств группы сульфаниламидов и, в
частности, одного из наиболее востребованных лекарственных средств –
комбинированного препарата Ко-тримоксазол, в состав которого входят
сульфаметоксазол
и триметоприм. Востребованность Ко-тримоксазола
приводит к увеличению количества производителей лекарственного средства. В
настоящее время в России официально зарегистрированы 26 препаратов Котримоксазола, произведенных различными фирмами, биоэквивалентность
которых требует специальной оценки.
Одним из испытаний, позволяющих сделать достоверный вывод о
биоэквивалентности воспроизведенных и оригинальных препаратов, является
анализ дозированной лекарственной формы с использованием теста
«растворение». Проведение подобных испытаний требует применения
современных аналитических методов для количественного определения
лекарственного вещества, высвобождающегося в среду растворения. Одним из
наиболее часто применяющихся для этой цели методов является УФ спектрофотометрия. Применение данного метода в анализе двухкомпонентных
лекарственных форм имеет существенные ограничения, связанные с часто
наблюдающимся наложением полос поглощения определяемых компонентов
друг на друга.
УФ-спектрофотометрическое
определение
сульфаметоксазола
и
триметоприма в совместном присутствии при рН=1,0 (в условиях,
рекомендованных для оценки растворимости таблеток соответствующей НД)
невозможно, т.к ингредиенты имеют общие максимумы поглощения при
λ1max = 200 нм и λ2max = 265 нм, однако, учитывая наличие кислотных и
основных центров в молекулах определяемых веществ, положение максимумов
могло претерпевать изменения с изменением рН среды растворения.
В настоящей работе были исследованы спектральные характеристики
растворов сульфаметоксазола и триметоприма в различных растворителях при
различных значениях рН и подобраны условия, позволяющие определять
сульфаметоксазол и триметоприм в совместном присутствии. Было
установлено, что в нейтральной и щелочной среде в области второго
максимума поглощения сульфаметоксазола (λ = 265 нм) триметоприм
собственным поглощением не обладает, что открывало возможность
определения в данном максимуме сульфаметоксазола в присутствии
триметоприма, как в однокомпонентной системе. Содержание триметоприма в
79
максимуме его поглощения (λ1max = 205 нм) можно было найти, используя
метод изолированной абсорбции.
Для дальнейшей работы в качестве среды растворения была выбрана
вода очищенная (рН = 5,4). В рекомендуемых условиях получены
градуировочные зависимости для количественного определения ингредиентов в
субстанциях и лекарственной форме. Определены основные параметры
валидации предлагаемой методики.
С использованием разработанной методики было проведено изучение
профилей растворения таблеток Ко–тримоксазола трех различных фирмпроизводителей: «Польфа», «СТИ-МЕД-СОРБ» и «Фармстандарт-лексредства».
Использовали прибор – «Вращающаяся корзинка» типа 545-АК-7. Объем
среды растворения (вода очищенная, рН=5,4) – 1000 см³, температура
37°С ± 0,5°С. Скорость вращения корзинки 100 об/мин. Время эксперимента
– 60 мин. Для испытания в корзинку помещали 1 таблетку. Через каждые
5 минут отбирали пробу раствора объемом 5,00 см 3, восполняя среду
растворения
в
соответствующем
объеме.
Полученные
растворы
спектрофотометрировали на спектрофотометре СФ-2000 при двух длинах
волн λ1 = 205 нм и λ2 = 265 нм, выбранных на основании данных
спектрального анализа.
Профили высвобождения сульфаметоксазола и триметоприма из
исследуемых таблеток, построенные как среднее из пяти параллельных
измерений в координатах: время растворения – процент высвободившегося
вещества, приведены на рис.1.
Рис.1. Средние профили высвобождения действующих веществ из
таблеток ко-тримоксазола различных производителей (среда – вода
очищенная)
80
Сравнение профилей растворения таблеток Ко-тримоксазола фирм
«Фармстандарт», «СТИ-МЕД-СОРБ» и завода «Польфа» позволило сделать
вывод о том, что их вид несколько отличен друг от друга, что свидетельствует о
неодинаковом высвобождении действующих веществ во времени из
исследуемых препаратов.
Сопоставимость полученных профилей растворения оценивалась с
помощью коэффициента различия (f1)
и коэффициента подобия (f2),
рассчитанных по формулам:
f1= (Σ |Rj - Tj|)*100: ΣRj и
f2= 50* log {[1+1/n (Σ |Rj – Tj|2)]-0,5*100},
где n – число точек времени отбора проб, Rj и Tj – процент
растворившегося вещества из таблеток Ко-тримоксазола двух различных фирмпроизводителей в каждый момент времени j.
Коэффициент различия равен нулю, если профили растворения Котримоксазола двух фирм-производителей идентичны. По мере увеличения
несходства между двумя профилями растворения значение коэффициентов
различия возрастает. Значения коэффициента подобия находятся в интервале от
0 до 100. По мере несходства кривых профилей растворения значение
коэффициента подобия приближается к 0. Профили растворения принято
считать подобными, если значения f1 находятся в пределах диапазона от 0 до
15, а значения f2 находятся в пределах диапазона от 50 до 100.
Значения коэффициентов, полученные согласно указанным формулам
при попарном сравнении кривых растворения исследуемых таблеток,
приведены в таблице 1:
Таблица 1
Значения коэффициентов различия и коэффициентов подобия
профилей растворения таблеток Ко-тримоксазола
Определяемые компоненты
Коэффициент
Коэффициент
(Фирмы-производители)
различия f1
подобия f2
(Норма 0 – 15)
(Норма 50 – 100)
Cульфаметоксазол
(Польфа и СТИ-МЕД-СОРБ)
23,20
36,00
Триметоприм
(Польфа и СТИ-МЕД-СОРБ)
28,95
30,00
Сульфаметоксазол
(Польфа и Фармстандарт)
37,16
27,80
Триметоприм
(Польфа и Фармстандарт)
38,53
18,00
Сульфаметоксазол
(СТИ-МЕД-СОРБ и Фармстандарт)
19,94
39,50
Триметоприм
(СТИ-МЕД-СОРБ и Фармстандарт)
20,89
36,50
81
На основании данных таблицы 1 полученные профили растворения не
являются подобными, следовательно, исследуемые таблетки нельзя считать
полностью биоэквивалентными друг другу.
82
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ САПРОПЕЛЕВОГО ГУМАТА
НА ДИНАМИКУ ГЛИКЕМИЧЕСКОЙ КРИВОЙ ПО ДАННЫМ
ГЛЮКОЗОТОЛЕРАНТНОГО ТЕСТА НА ЗДОРОВЫХ ЖИВОТНЫХ
Бузлама А.В. e-mail: [email protected]yandex.ru
Воронежский государственный университет
Введение. Актуальность скрининга биологически активных веществ,
обладающих гипогликемической активностью обуславливается высокой
медико-социальной значимостью заболевания, для коррекции которого
используется данный фармакологический эффект. Многочисленными
отечественными и зарубежными исследователями доказано, что сахарный
диабет в последние десятилетия имеет тенденцию к неуклонному широкому
распространению среди населения [1, 3]. Представляется перспективным
изучение гипогликемических свойств низкотоксичных соединений природного
происхождения, каковыми являются в том числе соли гуминовых кислот,
получаемые из придонных сапропелевых грязей [4]. Наиболее простым и
удобным тестом для скрининга веществ, обладающих гипогликемической
активностью, является тест толерантности к глюкозе, именуемый так же
глюкозотолерантным тестом. В связи с вышеизложенным, целью настоящего
исследования явилось изучение гипогликемических свойств сапропелевого
гумата при проведении глюкозо-толерантного теста на здоровых животных.
Материалы и методы исследования.
Исследования проведены на белых беспородных мышах самцах и самках
общим количеством 32 головы с массой тела 25,95±1,07 г. Животных разделили
на группы – 2 контрольных и 2 опытных по 8 самцов и 8 самок каждой.
Предварительно, всех животных контрольной и опытной групп подвергали 12часовой пищевой депривации (лишение корма) при свободном доступе к воде.
В период проведения эксперимента животные были лишены корма в течение
120 минут.
Глюкозо-толерантный тест воспроизводили путем введения животным
контрольной и опытной групп 40,0% водного раствора глюкозы однократно
подкожно в дозе 3,0 г/кг массы тела (объем 0,15 мл на 20,0 г).
Опытным группам животных вводили сапропелевый гумат в виде 0,1%
водного раствора в дозе 10,0 мг/кг (0,2 мл на 20 г массы тела) однократно
перорально за 30 минут до введения глюкозы. Контрольным группам животных
вводили эквивалентный объем физиологического раствора однократно перорально
за 30 минут до введения глюкозы.
Измерения концентрации глюкозы в крови животных опытной группы
проводили 5-и кратно – натощак до введения препарата (исходно), через 30
минут после введения препарата до введения глюкозы (точка отсчета,
принимаемая за 0 минут), через 30, 60 и 120 минут после введения глюкозы. В
контрольной группе животных измерения поводили 4-х кратно – натощак до
введения глюкозы (0 минут) и через 30, 60 и 120 минут после введения
83
глюкозы. Забор крови производили из хвостовой вены [75], содержание
глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с использованием
наборов фирмы «LACHEMA» и выражали в мМ/л. Результаты подвергали
статистической обработке с вычислением средних значений и ошибки среднего,
для определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента
[2]. Оценивали изменение показателей гликемии по отношению к исходным
значениям по группе, результат выражали как разницу с исходным в процентах.
Сравнение между опытными и контрольными группами проводили по
соответствующим абсолютным показателям гликемии и относительно
изменений по отношению к исходным по группе значениям гликемии.
Результаты исследования.
Установлено, что при исходном измерении концентрации глюкозы крови
натощак показатели в контрольной группе составили 3,29±0,49 мМ/л, в
опытной группе 5,73±0,38 мМ/л, не имея достоверных различий и в целом
соответствуя значениям средней видово-возрастной нормы гликемии натощак
для здоровых животных (норма 3,5–5,5 мМ/л).
Таблица 1.
Влияние сапропелевого гумата на изменения концентрации глюкозы
в крови при проведении глюкозо-толерантного теста
Показатель
Контроль, среднее
разница с исходным, %
Опыт, среднее
разница с начальным
(5,73±0,38 мМ/л), %
разница с исходным, %
разница с контролем по
абсолютным значениям, %
разница с контролем по
отношению к исходному, %
Концентрация глюкозы в крови, мМ/л,
через n мин.
0
30
60
120
(исходно)
9,84±0,93 9,63±0,74 5,42±0,40
3,29±0,49
+++
+++
++
+200,0
+193,0
–
+65,0
+3,0 раз +2,93 раз
5,55±0,60 7,00±0,57 9,82±0,93 7,91±0,29
++,**
+++
+++, ***
-3,2
–
–
–
–
+26,1
+76,9
+42,5
–
-28,9
+2,0
+45,9
-173,9
-116,1
-22,5
Примечание: + - Р<0,05; ++- Р<0,01, +++- Р<0,001– достоверность
различий при сравнении между опытными и контрольными показателями с
исходными значениями; * - Р<0,05; **- Р<0,01, ***- Р<0,001– достоверность
различий при сравнении между опытными и контрольными показателями.
84
Через 30 минут после введения раствора сапропелевого гумата (до
введения глюкозы) наблюдалось незначительное снижение концентрации
глюкозы в крови животных опытной группы до 5,55±0,06, что составило на
3,2% ниже начального значения, однако данные изменения не являлись
достоверными.
В контрольной группе через 30 минут после введения глюкозы
наблюдалось повышение гликемии в 3 раза выше исходного уровня (на
200,0%). Затем концентрация глюкозы постепенно снижалась, являясь через 60
минут на 193,0% выше исходного уровня и через 120 минут на 65,0% выше
исходного (табл. 1). В целом, динамика гликемической кривой в контрольной
группе животных соответствовала параметрам нормы.
На фоне применения сапропелевого гумата через 30 минут после
введения глюкозы наблюдалось достоверное (Р<0,01) снижение гликемии в
среднем на 28,9% при сравнении с абсолютными результатами контроля и на
173,9% при сравнении с контролем по отношению к исходным значениям.
Через 60 и 120 минут разница проявлялась только по относительным значениям
составив 116,1% и 22,5% соответственно (табл. 1).
Выводы. Таким образом, при проведении глюкозо-толерантного теста
установлено наличие слабовыраженной гипогликемизирующей активности
растворов сапропелевого гумата. Эффект исследуемого раствора начинает
проявляться через 30 минут после перорального введения и сохраняется в
течение последующих 30 минут, составляя в целом около 1,0 часа. С учетом
того, что исследуемый раствор сапропелевого гумата незначительно снижает
исходный уровень глюкозы натощак, проявляя более выраженный эффект при
глюкозной нагрузке, данный эффект следует расценивать скорее как
«нормогликемический» нежели «гипогликемический».
Литература
1.
Балаболкин М.И. Диабетология / М.И. Балаболкин. – М.: Медицина,
2000. – 671 c.
2.
Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М.:
Практика, 1999. – 459 c.
3.
Дедов, И.И. Сахарный диабет – проблема XXI века / И.И. Дедов //
Врач. – 2000. –№1. – C.4-6.
4.
Низкая токсичность и противовоспалительная активность гуматов,
выделенных из торфа и сапропеля Томской области / Р.Р. Исматова, А.У.
Зиганшин, С.Е. Дмитрук, И.В. Федько // Казанский медицинский журнал. –
2006. – Том 87, №6 . – С. 454–455.
85
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ГУМАТА ЛЕОНАРДИТА
НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАНЭРИТРОЦИТОВ
В МОДЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ
Бузлама А.В. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Введение. Известно, что соли гуминовых кислот обладают
разнонаправленной биологической активностью, в связи с чем в последние
годы все шире рассматривается вопрос о возможности их применения в
медицине и фармации [2]. Особенности химической структуры гуминовых
веществ обуславливают их поверхностно-активные свойства [1], что приводит к
способности увеличивать растворимость гидрофобных органических веществ.
Данная особенность гуминовых веществ позволяет предположить возможность
их влияния на свойства фосфолипидов и других компонентов биологических
мембран. Однако, до сих пор влияние гуминовых веществ на компоненты
клеточных мембран млекопитающих и человека изучено недостаточно. В связи
с вышеизложенным, представляет интерес исследование влияния солей
гуминовых кислот, получаемых из леонардита, на проницаемость мембран в
модельных условиях изменения свойств мембраны эритроцитов при кислотном
и гипоосмотическом гемолизе, что и явилось целью настоящего исследования.
Материалы и методы исследования. Для изучения влияния гумата
леонардита на проницаемость мембран использовали модели кислотного и
гипоосмотического гемолиза эритроцитов. Степень влияния гумата леонардита,
выступающего в качестве «модификатора» физико-химических свойств
белково-липидных комплексов плазматических мембран оценивали на 3-х
компонентной модельной системе «1 – препарат + 2 – эритроциты + 3 –
гемолитик» по изменению химической резистентности эритроцитарных клеток
к индукторам кислотного или гипоосмотического гемолиза.
Оценку осмотической и кислотной резистентности эритроцитов
проводили при помощи автоматического метода регистрации кислотных и
гипоосмотических эритрограмм, основанного на фотометрической регистрации
процесса гемолиза эритроцитов во времени [3]. Эритроциты для проведения
исследований получали из крови белых беспородных крыс-самцов. Забор крови
осуществляли методом резекции дистальной части хвоста; кровь,
стабилизированную цитратом натрия, смешивали с 0,9% изотоническим
раствором натрия хлорида. С целью получения суспензии эритроцитов
полученную смесь центрифугировали на центрифуге лабораторной
медицинской ОПН-8 производства ОАО «ТНК» Дастан, Кыргызская
республика, в течение 10 минут при скорости 3000 об./мин. К осадку,
содержащему эритроциты, добавляли 0,9% раствор NaCl, осторожно
перемешивали и снова центрифугировали при тех же условиях 3 раза.
Гемолиз эритроцитов проводили в кюветах с наружными размерами
20 40 10 мм и рабочим объѐмом 4,0 мл. Измерение величин светорассеяния
86
осуществляли при длине волны λ=490 нм. Фотометрическую регистрацию
кинетики индуцированного гемолиза эритроцитов осуществляли при помощи
прибора КФК-3, производства ОАО «Загорский оптико-механический завод», г.
Загорск, Россия. Показатели регистрировали через каждые 15 секунд в течение
735 секунд. Цифровые данные отображали на графике, в результате
регистрировали
S-образную
интегральную
кинетическую
кривую
(эритрограмму), форма которой отражает суммарное изменение величины
светорассеяния в исследуемом растворе во времени. Анализ эритрограммы
осуществляли графическим способом. Структурное состояние мембран
эритроцитов оценивали в соответствии с методикой [3] по следующим
расчетным параметрам: Кmax – константа максимальной скорости гемолиза (отн.
ед.); G – относительное количество гемолизированных клеток (%); Gmax –
относительное количество гемолизированных эритроцитов (%); Gсф –
относительное количество сфероцитов (%); t lat – время нахождения
эритроцитов в латентной стадии гемолиза (сек). Индуцирование кислотного
гемолиза осуществляли путем добавления в рабочую кювету к 5 мл суспензии
эритроцитов 100 мкл соляной кислоты (0,1 Н раствора HCl). Кинетику
кислотного гемолиза оценивали по изменению резистентности эритроцитов к
воздействию соляной кислоты (0,1 моль/л) в изоосмотическом растворе NaCl
(0,9 %). Индуцирование гипоосмотического гемолиза проводили путем
создания в рабочей кювете с суспензией эритроцитов гипоосмотического раствора, содержащего 0,55 % NaCl.
При проведении исследований изучаемый 0,01% водный раствор гумата
леонардита добавляли в рабочую взвесь эритроцитов в количестве,
эквивалентном предполагаемой минимальной терапевтической дозе 1 мг/кг.
Эксперименты проведены в 5 сериях опытов, полученные результаты
подвергали статистической обработке с вычислением средних значений. В
каждой из серий опытов исследования проводили в параллельных пробах, одна
из которых являлась контрольной (эритроциты+гемолитик), а вторая опытной
(эритроциты+гумат леонардита+гемолитик).
Результаты исследования.
На модели кислотного гемолиза (Табл. 1) установлено, что под влиянием
гумата леонардита регистрируется снижение показателя Кmax на 15,8%
относительно контроля. С учетом того, что величина Кmax характеризует долю
эритроцитов, одновременно вступивших в стадию гемолиза, полученный
результат свидетельствует о способности гумата леонардита вызывать
модификацию мембран эритроцитов, приводя к увеличению степени
дифференцировки более стойких эритроцитарных клеток по отношению к
кислотному гемолитику. Следовательно, в короткий промежуток времени гумат
леонардита в испытуемой концентрации обеспечивает увеличение барьера
проницаемости мембраны для Н+-ионов. Однако, на фоне добавления в
модельную систему гумата леонардита происходит незначительное увеличение
показателя сферуляции (Gсф) на 0,158%. Указанный результат объясняется
распространением модифицирующего действия гумата леонардита на большее
количество эритроцитов низкостойкой популяции. Зарегистрировано так же
87
уменьшение латентной стадии гемолиза (t lat = 5,0 сек.), что обусловлено более
быстрым переходом от стадии сферуляции к стадии собственно гемолиза.
На модели гипоосмотического гемолиза (Табл. 2), выявляющего скрытые
повреждения мембраны эритроцитов, установлено, что под влиянием гумата
леонардита наблюдается снижение Kmax на 7,72%, что свидетельствует о
повышении порога проницаемости мембран для внеклеточного содержимого.
При этом выявлено незначительное снижение G120 на 3,29%, что характеризует
снижение количества эритроцитов, вступивших в стадию собственно гемолиза.
Таблица 1.
Результаты влияния гумата леонардита на динамику
кислотного гемолиза эритроцитов
Показатель
t lat (сек.)
Kmax (отн. ед.)
Gсф (%)
Контроль
15,0
5,145
-2,987
Гумат леонардита
5,0
4,331
-3,145
Таблица 2/
Результаты влияния гумата леонардита на динамику
гипоосмотического гемолиза эритроцитов
Показатель
Kmax (отн. ед.)
G120 (%)
Контроль
28,64
47,071
Гумат леонардита
26,43
43,793
Выводы, обсуждение результатов. Таким образом, в результате
проведенных исследований на модели регистрации кислотных и
гипоосмотических эритрограмм выявлена способность раствора гумата
леонардита модифицировать мембраны эритроцитов, предположительно за счет
взаимодействия с белково-липидными компонентами цитоплазматических
мембран. Установлена способность гумата леонардита снижать проницаемость
биомембраны для ионов, что может свидетельствовать о повышении
резистентности мембраны к кислотному гемолитику. Выявлена так же
способность гумата леонардита уменьшать выраженность скрытых дефектов
мембраны на модели гипоосмотического гемолиза. Полученные результаты
позволяют предположить наличие мембранопротекторных свойств гумата
леонардита. Кроме того, влияние на проницаемость биологических мембран
может
являться
одним
из
клеточных
механизмов
реализации
фармакологической активности гуминовых веществ.
Литература
1.
Горовая А.И. Гуминовые вещества / А.И. Горовая, Д.С. Орлов, О.
88
В. Щербенко. – Киев: Наук. думка, 1995. – 304 с.
2.
Сухих
А.С.
Перспективы
применения
гуминовых
и
гуминоподобных кислот в медицине и фармации / А. С. Сухих, П. В. Кузнецов
//Медицина в Кузбассе. – 2009. – №1. – С. 10–14.
3.
Практикум по биофизике / В.Г. Артюхов [и др.]. – Воронеж: Изд-во
ВГУ, 2001. – С. 147-161.
89
ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
КАЧЕСТВА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ
СТАЦИОНАРНЫМ БОЛЬНЫМ
Бурков А.А., Глембоцкая Г.Т. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Аптеки лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) являются
важнейшим звеном в системе оказания фармацевтической помощи (ФП)
стационарным больным. До настоящего времени не разработана
структурированная система оценки качества фармацевтической помощи в
стационарах, основанная на принципах и подходах менеджмента качества и
процессного менеджмента.
Базисная концепция, на которой должны основываться все медицинские
услуги и фармацевтическая практика, – это предоставление качественной
помощи пациенту. В самом общем виде процесс формирования системы
показателей качества фармацевтической помощи состоит из следующих этапов:
1.
Идентификация ФП с учетом еѐ потребителей.
2.
Выделение основных компонент и этапов формирования и оказания
ФП.
3.
Формирование системы индикаторов качества и эффективности
ФП.
В условиях утвержденного правового поля каждое учреждение
здравоохранения самостоятельно формирует систему показателей качества
ФП: она может быть использована при оказании (предоставлении) ФП, оценке
еѐ соответствия стандартам и формулярам, при регулировании отношений ЛПУ
и потребителей, внутреннем контроле качества работы подразделений,
совместно участвующих в процессе ФП.
Нами была осуществлена структуризация системы ФП стационарным
больным с выделением трех основных компонент: структурной (основные
фонды и ресурсы), процессной (технологические операции и процедуры) и
результативной (результат деятельности медицинских и фармацевтических
специалистов ЛПУ).
Сбои и нарушения при выполнении той или иной операции или
процедуры, наличие так называемых «узких мест», могут носить явный или
скрытый характер и быть причинами общего снижения качества ФП
стационарным больным. Для
их детектирования и диагностики часто
необходимы комплексные внешние или внутренние аудиты ЛПУ с
применением дифференцированной системы оценки качества ФП.
В ходе критического анализа результатов проведенного нами
исследования, синтеза данных отечественных и зарубежных литературных
источников по менеджменту качества, а также, основываясь на собственном
опыте, нами была разработана и научно-обоснована система показателей
качества ФП стационарным больным и критерии их оценки (табл. 1).
90
Таблица 1.
Показатели оценки качества ФП стационарным больным
и критерии их оценки
Показатель
Критерии оценки
(характеристика)
Ответственность
Четкое распределение обязанностей, закрепленных в
функционально-должностных и именных
инструкциях медицинских и фармацевтических
специалистов ЛПУ
Разработка и реализация системы менеджмента
качества в ЛПУ. Наличие уполномоченного по
качеству
Установленная ответственность за ошибки при
оказании ФП
Квалифицированность Доля специалистов с высшим образованием
Доля специалистов с ученой степенью
Доля специалистов с первой/высшей
квалификационной категорией
Систематичность повышения квалификации
специалистов
Систематичность участия в научно-практических
конференциях
Безотказность
Доля необходимых препаратов, отсутствующих в
ЛПУ
Уровень финансирования ЛПУ
Число замен ЛС при отпуске из аптеки в
подразделения ЛПУ
Использование современных систем учета ЛС в ЛПУ
Эффективность
Доля используемых ЛС с доказанной эффективностью
Доля используемых биоэквивалентных
воспроизведенных ЛС
Доля пациентов с полным выздоровлением при
выписке из стационара
Безопасность
Количество неблагоприятных исходов при
стационарном лечении
Число ошибок медицинских и фармацевтических
специалистов при оказании ФП
Число ошибок фармацевтических специалистов при
изготовлении ЛС в аптеке и контроле их качества
Число и характер нарушений лицензионных
требований и условий при осуществлении
медицинской и фармацевтической деятельности,
выявленных в ходе внутреннего аудита и контроля
надзорных органов
91
Оценка назначенной лекарственной терапии
клиническим фармакологом
Наличие и реализация системы фармаконадзора в
ЛПУ.
Наличие и реализация системы своевременного
изъятия из обращения забракованных лекарственных
средств и лекарственных средств, являющихся
незаконными копиями
Своевременность
Время ожидания в приемном отделении
Время ожидания врача в отделении при поступлении
Время ожидания диагностики
Время от момента назначения ЛС больному до
момента приема ЛС пациентом
Время от момента поступления препарата в аптеку
ЛПУ до момента приема ЛС пациентом
Возможность срочной поставки ЛС в ЛПУ
Доступность
Число стационаров в населенном пункте и их
удаленность
Число поставщиков ЛС в населенном пункте и их
удаленность
Доля пациентов, находящихся на стационарном
лечении в рамках реализации государственных
целевых программ (национальных проектов)
Доля социально незащищенных пациентов,
получивших ФП
Комплайенс
Доля пациентов,
удовлетворенных/неудовлетворенных качеством ФП в
ЛПУ
Доля пациентов, ощущающих себя вовлеченными в
лечебный процесс
Адекватность
Доля оригинальных инновационных ЛС в
современным методам формулярном перечне ЛПУ
лечения
Уровень технического оснащения ЛПУ
Наличие системы регулярного информирования
медицинских и фармацевтических специалистов о
новых ЛС в ЛПУ
Проведение медико-фармацевтических конференций
и совещаний в ЛПУ
Нормы биоэтики и Количество жалоб и замечаний, касающихся
деонтологии
соблюдения норм этики общения между пациентами
и медицинскими специалистами
Приведенная система показателей качества ФП стационарным больным
служит базисом для первоначального анализа работы аптеки и других
92
подразделений ЛПУ в рамках реализации программ по улучшению
лекарственного обеспечения и может быть принята за основу учреждениями
здравоохранения для достижения повышения качества, эффективности,
безопасности, оперативности и экономической обоснованности ФП как
подсистемы медицинской помощи населению.
Литература
1.
Мороз, Т.Л. Разработка теоретических и методических подходов к
организации лекарственного обеспечения стационарных больных на
современном этапе: автореф. дис.... д-ра фармац. наук. – Санкт-Петербург, 2001
– 39 с.
2.
Кудрин В.С. Мониторинг медицинской деятельности в системе ее
комплексной оценки // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и
истории медицины. – 2001. – №2.
3.
Хачатуров, А.Е., Куликов, Ю.А. Основы менеджмента качества. –
М.: Дело и Сервис, 2003 – 304 с.
93
АНАЛЬГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
ПРОИЗВОДНЫХ 4-ГИДРОКСИ-4-МЕТИЛ-2-ОКСО-6ФЕНИЛЦИКЛОГЕКСАН-1-КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Вагапов А.В., Носова Н.В., Гейн В.Л., Сыропятов Б.Я.,
Данилова Н.В., Вахрин М.И.
Пермская государственная фармацевтическая академия
Литературные данные свидетельствуют, что циклогексанолоны и их
производные проявляют различные виды биологической активности, такие как
противомикробная, анальгетическая, противовоспалительная и антифаговая [14]. Однако, циклокетолы не имеющие заместителей в 5 положении алицикла
недостаточно изучены.
С целью синтеза новых соединений данного ряда и оценки влияния их
структуры на биологическую активность, нами было изучено взаимодействие
функциональных
производных
4-гидрокси-4-метил-2-оксо-6фенилциклокексан-1-карбоновых
кислот
с
гидразоном бензофенона,
гидразидами
салициловой
и
цианоуксусной
кислоты,
а
также
тиосемикарбазидом (схема 1).
Схема 1
I
II
IV, V, VII
III, VI
VIII-XII
94
R1 = C6H5NH (I, X), 2-CH3C6H4NH (V, XII), 4-ClC6H4NH (XI),
CH3O (IV, VIII), C2H5O (II, VI), (CH3)2CHCH2O (III, IX), (CH3)3CO (VII)
R2 = 2-OHC6H4 (III, IV, V, VI), NCCH2 (VII)
Проведенные исследования позволили установить, что нагревание
эквимолярных количеств реагентов в этаноле в отсутствии катализатора с
гидразоном
бензофенона
приводит
к
образованию
2дифенилметиленгидразоно-4-гидрокси-4-метил-N,6-дифенилциклогексан-1карбоксамида (I), с гидразидом салициловой кислоты – метил 4-гидрокси-2-(2(2-гидроксибензоил)гидразоно)-4-метил-6-фенилциклогексан-1-карбоксилата
(IV)
и
4-гидрокси-2-(2-гидроксибензоилгидразоно)-4-метил-6-фенил-N-oтолилциклогексан-1-карбоксамида (V), с гидразидом цианоуксусной кислоты –
третбутил
2-цианометилкарбонилгидразоно-4-гидрокси-4-метил-6фенилциклогексан-1-карбоксилата (VII), с тиосемикарбазидом – алкил 9гидрокси-9-метил-3-тиоксо-7-фенил-1,2,4-триазоспиро[4.5]декан-6карбоксилатов (VIII, IX) и N-арил 9-гидрокси-9-метил-3-тиоксо-7-фенил-1,2,4триазоспиро[4.5]декан-6-карбоксамидов (X-XII). В отдельных случаях реакция
протекала с дегидротацией конечного продукта, в результате которой были
получены этил 2-дифенилметиленгидразоно-4-метил-6-фенилциклогекс-3-ен-1карбоксилат
(II),
изобутил
2-(2-гидроксибензоилгидразоно)-4-метил-6фенилциклогекс-3-ен-1-карбоксилат
(III)
и
этил
2-(2гидроксибензоилгидразоно)-4-метил-6-фенилциклогекс-3-ен-1-карбоксилат
(VI).
Полученные соединения I-XII представляют собой бесцветные или
слабоокрашенные кристаллические вещества растворимые в ДМСО, ДМФА и
нерастворимые в воде. Их строение было подтверждено на основании ИК-,
ЯМР 1Н и масс-спектров.
Анальгетическая активность изучалась на беспородных белых мышах
методом «уксусных корчей» [5]. Каждое соединение исследовалось на десяти
животных. Результаты обработаны статистически с использованием критерия
Стьюдента; эффект считали достоверным при Р < 0,05.
В итоге, анальгетическую активность проявили 10 соединений, 2 из
которых (соединения III и IV) значительно превосходят эталон сравнения метамизол натрия, использованный в дозе 50 мг/кг при внутрибрюшинном
введении.
Литература
1.
А.П. Кривенько, В.В. Сорокин, Замещенные циклогексанолоны,
СарГУ, Саратов (1999), сс. 36-37.
2.
В.Л. Гейн, А.А. Зорина, Н.В. Гейн и др., Хим.-фарм. журн., 39(4),
21-23 (2005).
3.
В.Л. Гейн, Е.Б. Левандовская, Н.В. Носова и др., Хим.-фарм. журн.,
41(12), 21-23 (2007).
95
4.
В.В. Сорокин, О.А. Щелочкова, В.Е. Субботин и др., Сб.
материалов Росс. научно-практической конф. «Достижения и перспективы в
области создания новых лекарственных средств», Пермь (2007), сс. 381-383.
5.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ / Под общей редакцией членакорреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп. –
М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005, с. 701-702.
96
КЛИНОПТИЛОЛИТОВЫЙ ТУФ – НОСИТЕЛЬ ВИТАМИНА Е
Васильева С.Ю.1, Бородина Е.В.1, Котова Д.Л.1, Селеменев В.Ф.1,
Бекетов Б.Н.2 e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Тюменская государственная медицинская академия
В настоящее время цеолитосодержащие туфы находят широкое
применение в качестве носителей лекарственных веществ. Натуральный
цеолитсодержащий
туф
имеет
кристаллическую
трехмерную
алюмокремнекислородную структуру, которая образует систему полостей пор и
каналов. Основной интерес в биологическом действии клиноптилолитового
туфа проявляется благодаря его физическим и химическим свойствам, таким
как ионообменная емкость, высокая адсорбционная способность и возможность
эффективной сорбции разных по размерам молекул. Использование
натуральных цеолитовых туфов в качестве диетических добавок позволяют
улучшить аппетит и усиливают детородную функцию животных [1]. Одной из
важных свойств цеолитсодержащих туфов является их способность к сорбции
биологически активных веществ, таких как аминокислоты, витамины и
минералы [2]. Жирорастворимый витамин Е является мощным антиоксидантом
и необходим в рационе живого организма. Витамин Е, закрепленный на
цеолитосодержащем носителе, потенциально может является составной частью
витаминно-минеральных премиксов и комбикормов. В связи с этим целью
данной работы явилось исследование сорбции витамина Е на
клиноптилолитовом туфе.
В данной работе был использован витамин Е фирмы Sigma (Германия).
Сорбцию витамина Е исследовали на цеолитсодержащем туфе месторождения
Приполярного Урала Югры. Исследуемый природный сорбент представляет
собой многофазовую смесь, основной фазой которого является клиноптилолит
(KNa2Ca2(Si29 Al7O72 )*24 H2O).
Кинетику сорбции витамина Е на клиноптилолитовом туфе (фракцией
0,02-0,06 мм), исследовали статическим методом ограниченного объема [3].
Навеску клиноптилолитового туфа приводили в контакт со спиртовым
раствором витамина Е фиксируя время начала сорбции. Через определенные
промежутки времени раствор отделяли от сорбента и анализировали его на
содержание витамина Е спектрофотометрическим методом. Количество
сорбированного препарата, пересчитанное на 1,0 г сорбента, определяли по
разности концентраций исходного раствора и после контакта его с
клиноптилолитовым туфом.
Установлено, что на исходном клиноптилолитовом туфе сорбируется
незначительное количество витамина Е. Известно, что кислотная активация
сорбентов увеличивает сорбционную способность природных минералов [4].
Кинетику сорбции витамина Е исследовали на кислотоактивированном
клиноптилолитовом туфе. На рис. 1 представлены экспериментальные данные в
97
виде зависимости степени завершенности процесса (α) от времени (τ)
проведения эксперимента: α=Qτ/Q∞.
Согласно полученным данным, равновесие в системе клиноптилолитовый
туф-раствор витамина Е (с = 0,6 мг/мл) достигается в течение 52 часов.
Количество сорбированного витамина Е в состоянии равновесия составляет 9,3
мг/г.
1,2
α
1
0,8
0,6
0,4
0,2
,h
0
0
20
40
60
80
100
Рис.1. Зависимость степени завершенности процесса от длительности
процесса
Вид кинетической кривой в координатах –lgα - τ позволил предположить
двухстадийный характер сорбции токоферола на клиноптилолитовом туфе
(рис.2а).
0,8
0,4
0,6
0,3
0,4
0,2
0,2
0,1
,h
0
0
10
20
30
40
50
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Рис.2. Кинетическая кривая зависимости –lgα- τ
Для определения лимитирующей стадии процесса сорбции использовали
метод прерывания и графический способ представления экспериментальных
данных в координатах α - τ 1/2 (рис.2б). Показано, что на начальном этапе
процесса, сорбция контролируется внутридиффузионным механизмом.
Определен эффективный коэффициент диффузии, величина которого
составляет 3,2*10-12 м2/с.
98
Методом ИК спектроскопии исследованы исходный и содержащий
витамин Е образцы клиноптилолитового туфа. Сорбция витамина Е на
клиноптилолитовом туфе приводит к появлению дополнительных полос
поглощения при 2928, 2857 и 1410 см-1, характеризующих валентными и
деформационными колебаниями групп C-CH3 и С-СН2 соответственно.
Деформационные колебания ароматических СН-групп характеризуются
полосой поглощения при 799 см-1 .
Литература
1.Mumpton F.A., Fishman P.N.(1977). \ Journal of Animal Science 45, 11881203.
2. Pasteiner S.(1998) / Tierernahrung International GesmbH, Austria
3. Акимова М.К. / Автореф. Дис. Канд. Хим. Наук 1973.
99
ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СВЯЗЫВАЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ
ПРОИЗВОДСТВА ШИПУЧИХ ТАБЛЕТОК С ЭКСТРАКТОМ
МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ
Виденин Д.В., Шевченко А.М. e-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Мочекаменная болезнь (МКБ, уролитиаз) в настоящее время является
одним из самых распространенных урологических заболеваний. Не смотря на
широкое внедрение в клиническую практику высокотехнологичных методов
удаления мочевых камней, вопрос о лечении МКБ остается весьма спорным,
так как любое хирургическое вмешательство не устраняет самой причины
камнеобразования и не избавляет от возможного рецидива МКБ. Поэтому
эффективность терапии МКБ во многом зависит от медикаментозного
лечения пациента, которое до настоящего времени остается наиболее
слабым звеном [2].
Учитывая это, целью нашей работы явилась разработка состава и
технологии шипучих таблеток, предназначенных для лечения и профилактики
мочекаменной болезни различной этиологии.
Проведенный нами патентно-информационный поиск показал, что
наиболее часто для лечения и профилактики уролитиаза различной этиологии
используются следующие лекарственные вещества: экстракт марены
красильной сухой, пиридоксина гидрохлорид, калия гидрокарбонат, цитраты
натрия, магния, которые зачастую используются в комплексе [3].
Для выполнения поставленной цели необходимо было провести выбор
оптимального состава вспомогательных веществ для производства шипучих
таблеток с указанными компонентами. Возможными способами получения
массы для таблетирования в этом случае могут быть смешивание сухих
компонентов без грануляции, а также влажная грануляция в двух вариантах:
совместная или раздельная.
На первом этапе исследований изучалась возможность получения
шипучих таблеток методом прямого прессования. С этой целью на
гидравлическом прессе при давлении 120 МПа на пресс-инструменте 24 мм
подвергали таблетированию смесь следующего состава: экстракт марены
красильной сухой (0,25), пиридоксина гидрохлорид (0,015), калия
гидрокарбонат (0,8), цитрат натрия (0,6), цитрат магния (0,25) и лимонная
кислота (0,5). Полученные таблетки оценивали по показателям внешний вид,
распадаемость и прочность. Таблетки имели неоднородную поверхность, сколы
по краям. Определить прочность полученных модельных таблеток не
представлялось возможным, так как они рассыпались при легком сжатии.
Распадаемость полученных таблеток была в пределах 20-30 секунд, что не
обеспечивало полного растворения компонентов за данный промежуток
времени. В связи с этим рекомендовать прямое прессование, как возможный
способ получения шипучих таблеток не имело целесообразности.
100
Поэтому нами исследованы варианты влажной грануляции. Вначале
исследовался вариант совместной грануляции, как наиболее простой в
осуществлении. Для избежания преждевременной реакции газообразования
совместная грануляция обычно проводится неводными растворами ВМВ (чаще
всего спиртовыми). Однако излишнее количество раствора ВМВ может
способствовать переходу увлажненной массы в суспензионное состояние, что
исключает процесс грануляции. Кроме того, высокая концентрация ВМВ может
замедлить растворение полученных таблеток. Поэтому нами изучено влияние
концентрации и количества различных растворов ВМВ на пластическую
прочность увлажненных таблеточных масс вышеуказанного состава и время
растворения модельных таблеток. С этой целью изучали реологические
характеристики увлажненных масс на коническом пластомере КП-3.
Предельное напряжение сдвига неразрушенной структуры θо (в Па)
рассчитывали по формуле Ребиндера [1]:
0
К
m
h2
где К – константа конуса, зависящая от угла при его вершине ά, град.,(по
данным Н.Н. Агранат для α=450 она равна 4,1);
m – масса, действующая на конус (за вычетом трения и сопротивления
пружины индикатора);
h – глубина погружения конуса, м.
Спиртовые растворы ВМВ в таблеточную массу вводили постепенно в
количестве 2% от общей массы, определяя при этом значения пластической
прочности. При достижении максимальной пластической прочности (точка
критического влагосодержания - Кw, %), количество раствора ВМВ
фиксировалось. Оптимальным результатом считался тот, при котором
максимальная пластическая прочность достигалась при минимальной
концентрации и количестве увлажнителя. Для исследования были взяты
спирторастворимые полимеры, наиболее часто используемые в производстве
таблеток. Результаты приведены в табл. 1.
Таблица 1.
Зависимость пластической прочности таблетной массы (Θ, Па∙10-2)
от концентрации и вида увлажнителя
Марки
ВМВ
Концентрация спиртового раствора ВМВ
5%
10%
15%
20%
25%
Θ
Кw
Θ
Кw
Θ
Кw
Θ
Кw
Θ
Кw
385,4 9,3 530,4 11,4 632,9 15,3 765,5 21,5 812,7 29,7
КПН-1
Kollidon
467,5 14,3 680,2 19,6
VA-64
Plasdone S480,1 14,6 632,6 18,4
630
Kollicoat
465 13,9 580,7 17,6
MAE 100 P
Kollidon 25 510,4 15,6 612,7 18,1
738,8 23,4 804,7 27,8 854,5 33,6
717,3 21,8 798,5 25,6 876,6 30,4
637,8 21,6 721,4 24,1 821,3 30,1
697,3 24,4 809,9 29,5 886,4 35,3
101
Как следует из табл. 1, оптимальные результаты получены при
использовании спиртовых растворов Kollidon VA-64, Plasdone S-630, Kollidon
25 в пределах концентраций от 5 до10%. Дальнейшее увеличение концентрации
этих растворов приводило к увеличению их расхода на единицу массы смеси, и,
в конечном итоге, к увеличению времени растворения модельных таблеток.
Предельное напряжение сдвига таблетных масс, увлажненных спиртовыми
растворами КПН-1, Kollicoat MAE 100 P, имело более низкие значения, чем у
вышеперечисленных ВМВ.
Полученные увлажненные массы гранулировали сквозь нержавстальную
сетку с диаметром отверстий 3 мм, грануляты высушивали при температуре не
выше 400 С, вновь протирали сквозь сетку с диаметром отверстий 1 мм. Затем
на лабораторном прессе при давлении 120 МПа получали модельные таблетки
диаметром 24 мм, фиксируя при этом давление выталкивания (Рвыт) по
манометру и проводя перерасчет в МН/м2.
Распадаемость и качество
полученных растворов определяли в соответствии с требованиями Европейской
фармакопеи, изд. 5, ст. 0478, стр.626. Результаты исследований представлены в
табл. 2.
Таблица 2.
Влияние марки ВМВ на качество шипучих таблеток
и полученных из них растворов
Марки ВМВ
КПН-1
Рвыт.
12,5±0,62
Распадаемость
376±18,8
Качество раствора*
––
Kollidon VA-64
7,6±0,38
205±10,25
+
Plasdone S-630
9,2±0,46
204±10,2
++
Kollicoat MAE
100 P
Kollidon 25
9,2±0,46
201±10,05
–––
14,3±0,71
267±13,8
–
Примечание*:
+++ раствор прозрачен, без осадка;
– мутность;
++ легкая опалесценция;
– – хлопьевидная взвесь;
+ опалесценция; – – – хлопьевидная взвесь, осадок.
Как следует из табл. 2 использование в качестве связывающих веществ
Kollidon VA-64 и Plasdone S-630 (фирма ISP) обеспечивает оптимальные
показатели качества растворов при удовлетворительном качестве таблеток.
Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее
оптимальным, можно считать использование в качестве связывающих веществ
10% спиртовых растворов Plasdone S-630 и Kollidon VA-64.
102
Литература
1.
Андрианов, Е.И. Методы определения структурно-механических
характеристик порошкообразных материалов / Андрианов Е.И. – М.: Химия,
1982. – 255 с.
2.
Дзеранов, Н.К. Современные представления об этиопатогенезе и
принципах лечения мочекаменной болезни / Н.К. Дзеранов, О.В.
Константинова, Д.А. Бешлиев, П.С. Бутин // Фарматека. – 2004. – № 11. – С.47 –
52.
3.
Сергиенко, Н.Ф. Цитратная терапия в лечении уратного
нефролитиаза / Н.Ф. Сергиенко, Л.В. Шаплыгин // Урол. и нефрол. – 1999. – №
2. – С. 34 – 36.
103
ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ШИПУЧИХ
ТАБЛЕТОК С ЭКСТРАКТОМ МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ
Виденин Д.В., Шевченко А.М. e-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Целью настоящего исследования является разработка состава
вспомогательных веществ и технологии получения шипучих таблеток
уролитического действия, включающих следующие лекарственные вещества с
учетом их известных терапевтических доз (базовый состав): экстракт марены
красильной сухой (0,25), пиридоксина гидрохлорид (0,015), калия
гидрокарбонат (0,8), цитрат натрия (0,6), цитрат магния (0,25) и лимонная
кислота (0,5). Нами исследовано 6 модельных композиций вспомогательных
веществ, представленных в табл. 1.
Таблица1.
Модельные составы вспомогательных веществ
Компоненты
№ состава (г/таб)
1
2
3
4
5
6
Способ получения
Совместная
Комбинированный
грануляция
метод
Связывающие вещества *:
Kollidon VA-64*
0,052
0,043
Plasdone S-630*
0,098
0,054 0,054 0,054
Kollidon 25*
0,76
0,052
Скользящие и смазывающие вещества:
Магния стеарат
0,026 0,026
ПЭГ – 6000
0,105
0,105
Кислота стеариновая
0,026
0,026
Корригенты:
Ароматизатор «Мѐд»
0,05
0,02
Ароматизатор «Лимон»
0,03
0,05
Ароматизатор «Вишня»
0,03
0,03
Аспасвит
0,05
0,03
0,02
0,02
0,03
0,05
* - указанные вещества вводились в состав в виде 10% спиртового
раствора.
Из составленных композиций на лабораторном прессе при давлении 120
МПа получали модельные таблетки, фиксируя при этом давление выталкивания
по манометру и проводя перерасчет в МН/м2. Таблетки оценивались на
104
соответствие требованиям статьи Государственной Фармакопеи ХI издания
«Таблетки» и Европейской фармакопеи, изд. 5, ст. 0478, стр.626.
Технологические показатели сыпучесть, прессуемость, распадаемость
устанавливали по методикам, приведенным в литературе [1, 0, 0].
Средневзвешенная оценка органолептических свойств проводилась согласно
методики принятой в пищевой промышленности [0]. Результаты определений
представлены в табл. 2.
Таблица 2.
Результаты определения технологических показателей гранулятов
для быстрорастворимых таблеток
№
п/п
Наименование
показателя и его
оптимальное значение
1
2
Сыпучесть (г/с) -8,6-12,0
Прессуемость (Мн) - 70100
Давление выталкивания
из матрицы (МПа) Не ›
10
Распадаемость (сек.) - до
300
Средневзвешенная
оценка
органолептических
свойств (баллы) - 9,0
3
4
5
№ модельной прописи таблеток
Способ получения
Совместная
Комбинированный
грануляция
метод
1
2
3
4
5
6
8,18
10,9
9,75
7,85
7,12
8,25
95
108
95
88
89
77
3,9
3,1
4,2
6,3
5,2
4,7
98
97
108
122
142
137
3,5
6,5
4,0
5,5
3,5
3,5
Однако, приведенные результаты не дают информации об оптимальном
составе, его выбор должен проводиться на основании совокупности
показателей, приведенных в единую систему баллов. Если максимальную
балльную оценку каждого показателя принять равной 100, то на основании
полученных результатов можно провести расчет среднего арифметического
балла по каждому из показателей (табл. 3).
Как следует из табл. 3, максимальный среднеарифметический балл
принадлежит составу №2. Однако среднеарифметическая оценка может
привести к существенному искажению результата, так как все показатели
считаются равнозначными и в них отсутствует взаимная корреляция. Для более
достоверного анализа нами проведено ранжирование показателей с учетом их
значимости в производстве быстрорастворимых таблеток. Рассчитаны весовые
коэффициенты для каждого показателя и проведено их нормирование. Данные
представлены в табл. 4.
105
Таблица 3.
Результаты определения среднеарифметических баллов
№ состава
1
2
3
4
5
6
Кс
Кп
57,5
88,3
75
53,8
45,8
58,3
20,8
44,6
34,6
29,2
30
20,7
Показатели качества (баллы)
Кд
Кр
76,2
86,2
72,5
59,2
60
66,2
84,2
84,6
80
62,2
65,8
67,9
Ко
Êi
n
18,7
68,7
25
32,5
31,2
31,2
51,5
74,5
57,4
47,4
46,6
48,9
Таблица 4.
Ранжирование показателей и их весовые коэффициенты
№
п/п
Наименование показателя
Ранжирование
показателей
Весовые
коэффициенты
1
2
Распадаемость
Давление выталкивания из
матрицы
Прессуемость
Сыпучесть
Средневзвешенная оценка
органолептических свойств
1
2
1
0,8
Нормированные
весовые
коэффициенты
0,33
0,27
3
4
5
0,6
0,4
0,2
0,2
0,13
0,07
3
4
5
Согласно полученным данным проводился расчет средневзвешенных
баллов по каждому показателю, результаты представлены на рис. 1.
76,4
80
70
64,3
61,3
52
50,9
60
54,2
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Совместная грануляция
5
6
Комбинированный метод
Рис.
1.
Результаты
расчета
средневзвешенных
технологических показателей модельных составов гранулятов
106
оценок
Таким образом, проведенные исследования показали, что наибольшие
средневзвешенные оценки принадлежат составу №2 при совместном способе
грануляции с помощью 10% спиртового раствора Plasdone S-630, что позволяет
рекомендовать данный метод как наиболее оптимальный для производства
шипучих таблеток с экстрактом марены красильной.
Литература
1. Воскобойникова, И.В. Применение супердезинтегрантов в твердых
дозированных лекарственных формах / И.В. Воскобойникова [и др.] //
Фармация. – 2005. – №3. – С. 35-37.
2. Езерский, М.Л. Определение физико-химических параметров
фармацевтических порошков / М.Л. Езерский // Хим.-фармац. журн. – 1970. –
Т.4, №9. – С.91.
3. Николаева, М.А. Товарная экспертиза / М.А. Николаева. – М.: Деловая
лит., 1998. – 546 с.
4. Шевченко, А.М. Обоснование выбора состава корригентов для сухих
шипучих напитков с адаптогенами и витаминами /А.М. Шевченко//
Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2005. – №3. –
С.71-73.
107
СИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ПРОТИВОМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ
ПРОДУКТОВ ТРЕХКОМПОНЕНТНОЙ РЕАКЦИИ МЕТИЛОВОГО
ЭФИРА АЦЕТИЛУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ СО СМЕСЬЮ
АРОМАТИЧЕСКОГО АЛЬДЕГИДА И 3-АМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛА
Владимиров И.Н., Курбатова А.А., Гейн В.Л., Вахрин М.И.,
Воронина Э.В. e-mail: [email protected]
Пермская государственная фармацевтическая академия
Ранее было установлено, что взаимодействие эфиров кетокислот со
смесью ароматического альдегида и с моно- и бинуклеофилами приводит к
образованию конденсированных гетероциклических систем. Так, метиловые
эфиры ацилпировиноградных кислот реагируют со смесью ароматического
альдегида и 3-амино-1,2,4-триазола с образованием 4-арил-3-ацил-2метоксикарбонил-1,4-дигидропиримидино[1,2-d]триазола.
С целью получения новых соединений ряда производных
дигидропиримидино[1,2-d]триазола, нами было изучено взаимодействие
метиловых эфиров ацетилуксусной кислоты со смесью 3-амино-1,2,4-триазола
и ароматического альдегида.
Проведенные исследования показали, что при сплавлении эквимолярных
количеств исходных реагентов при 1700-1800С в течение 20-30 мин. в качестве
единственного
продукта
образуются
метил
5-арил-7-метил-1,5дигидропиримидино[1,2-d]триазол-6-карбоксилаты (I-V).
H
O
O
O
NH2
O
HN
O
+
R
+
N
O
NH
N
N
N
N
R=H(I);4-Cl(II); 3-OH-4-OCH3(III);4-NO2(IV);4-OCH3(V).
Полученные
соединения
(I-V)
представляют
собой
белые
мелкокристаллические соединения, нерастворимые в воде, этаноле, при
нагревании растворимые в уксусной кислоте и ацетонитриле, растворимые в
ДМСО, ДМФА.
Структура полученных (I-V) соединений подтверждена данными ЯМР 1H
и ИК-спектроскопии. В ЯМР 1Н спектрах соединений кроме сигналов
метксигруппы, наблюдается группа сигналов ароматических протонов в виде
мультиплета при 6.50-6.90 м.д., сигнал протона C5H в виде синглета в области
6.00-6.50 м.д., сигнал NH протона при 10.50 – 11.00 м.д. и сигналы метильной
группы в виде синглета в области 2.25-2.45 м.д.
108
R
Исследована противомикробная активность полученных соединений
(I-V) по отношению к эталонным штаммам St. aureus и E. Coli.
№
МИК, мг/мл
St.aureus
1000
1000
500
1000
500
62,5-1000
R
I
H
II
4-Cl
III
3-OH-4-OCH3
IV
4-NO2
V
4-OCH3
Диоксидин
E.coli
500
500
500
500
500
3,9-65,5
Литература
1.
Гейн В.Л., ГейнЛ.Ф., Цыплякова Е.П. ЖОрХ. 2003,39.797.
2.
Гейн В.Л., ГейнЛ.Ф., Цыплякова Е.П.ХГС.2003,949.
3.
Гейн В.Л., ГейнЛ.Ф., Цыплякова Е.П., О.С.Панова ЖОрХ.
2007,43.1386.
109
ВЫДЕЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКОЙ АМИНОКИСЛОТЫ ИЗ СМЕСИ
С МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ ДИАЛИЗОМ
С ПРОФИЛИРОВАННОЙ КАТИОНООБМЕННОЙ МЕМБРАНОЙ
Воробьева Е.А., Васильева В.И., Григорчук О.В., Лаврентьева О.А.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Для выделения ароматических аминокислот в биотехнологии их
необходимо
отделять
от
остатков
питательной
среды
после
микробиологического синтеза, проводить деминерализацию, разделять смеси
различных аминокислот. Наиболее перспективный метод при обработке
растворов содержащих электролиты – диализ с ионообменными мембранами.
Препятствием на пути внедрения диализа как метода выделения является
низкая скорость диффузии вещества через мембрану. Для ее увеличения
необходимо использование дополнительных эффектов, в частности
гидродинамической интенсификации, ускорение транспорта аминокислот с
применением катионообменной мембраны в водородной форме («эффект
облегченного переноса»).
Экспериментальная часть работы была выполнена с использованием
диализной ячейки, собранной из двух секций, разделенных ионообменной
мембраной. Исследуемый раствор подавался в секцию 1 со скоростью 4,5·10-2
см/с, а через секцию 2 пропускали дистиллированную воду со скоростью 5,8·10 3
см/с. Измерение скоростей подачи растворов осуществлялось на выходе из
секций объемным методом. Все эксперименты были проведены в стационарных
условиях.
В работе исследовалась возможность применения диализа для выделения
аминокислоты из растворов с минеральными компонентами, изучением
переноса
фенилаланина
с
дигидрофосфатом
калия
через
сульфокатионообменную мембрану МК-40 с профилированной поверхностью.
Сравнительным анализом данных по диффузионному переносу фенилаланина и
дигидрофосфата калия через мембрану МК-40 из индивидуальных и
смешанных эквимолярных растворов установлено сопряжение потоков при
диализе смеси аминокислоты с минеральным компонентом.
Поток из индивидуального раствора биполярного иона фенилаланина
через
катионообменную
мембрану МК-40
превышает
поток
из
индивидуального раствора электролита (рис. 1). Причина этого является
различная сорбционная способность мембраны по отношению к исследуемым
веществам. Различие особенно велико для водородной формы мембраны
вследствие эффекта ускоренного транспорта биполярных ионов аминокислоты,
образующих с противоионами водорода катионы. Анализ сопряженных
потоков показал, что присутствие минерального компонента уменьшает поток
аминокислоты через катионообменную мембрану.
110
Рис.1 Зависимость потоков фенилаланина при диализе через
мембрану МК-40 в водородной форме индивидуального раствора Рhe и
эквимолярной смеси Рhe(КН2РО4): С0(Рhe)=С0(КН2РО4)=2,5*10-2 М.
Рис.1 Кинетическая зависимость потоков дигидрофосфата калия при
диализе через мембрану МК-40 в водородной форме индивидуального
раствора
КН2РО4
и
эквимолярной
смеси
КН2РО4(Рhe):
-2
С0(Рhe)=С0(КН2РО4)=2,5*10 М.
Присутствие фенилаланина в растворе, в свою очередь, оказывает
значительное влияние на массоперенос дигидрофосфата калия через мембрану
в водородной форме (рис. 2). Потоки электролита через мембрану в
присутствии фенилаланина ниже, чем при диффузии из индивидуального
раствора. Возможное объяснение этому явлению заключается в стерических
затруднениях транспорта дигидрофосфата калия в мембране в связи с тем, что
часть противоионов водорода заменена объемными катионами аминокислоты.
111
Различная природа компонентов и взаимное влияние потоков привело к
тому, что диффундирующие из эквимолярной смеси фенилаланин и
дигидрофосфат калия в растворе, выходящем из приемной секции диализной
ячейки, имеют различающиеся концентрации. В качестве критерия
эффективности разделения двух компонентов в мембранных процессах принят
фактор разделения SF, который определяется как отношение концентраций
вытекающих растворов из приемной секции С2 к поступающим в исходную
секцию С1:
C2 ( A) С1 ( А)
(1)
SF
:
C2 (G ) С1 (G )
Зависимость фактора разделения фенилаланина и электролита от времени
при их совместной диффузии через профилированную мембрану МК-40 в
водородной форме представлена на рис. 3.
Рис.3 Кинетическая зависимость фактора разделения фенилаланина
и
дигидрофосфата
калия
при
диализе
эквимолярной
смеси
-2
С0(Рhe)=С0(КН2РО4)=2,5*10 М через мембрану МК-40 в водородной форме.
Сопряжение потоков аминокислоты и минерального компонента в
сульфокатионообменной мембране приводило к уменьшению эффективности
разделения со временем, однако при диализе эквимолярных растворов
величина фактора разделения оставалась достаточно высокой SF = 7,5.
При изучении возможности гидродинамической интенсификации диализа
фенилаланина и дигидрофосфата калия выявлен значительный рост
коэффициента разделения с увеличением скорости подачи исходного раствора.
Для создания оптимальных условий диффузионного переноса и выделения
рекомендованы гетерогенные катионообменные мембраны в водородной форме
с геометрически неоднородной профилированной поверхностью.
Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ,
проект 09-03-97567- р_центр_а.
112
СИНТЕЗ ЭФИРОВ 1-АРИЛЦИТОЗИН-5-КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
И ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДО[4,5-D]ПИРИМИДИНТРИОНА
Воронкова В.А., Баранин С.В., Дорохов В.А.
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Среди производных цитозина, являющегося одним из важнейших
нуклеиновых
оснований,
известны
медицинские
препараты
противоопухолевого, антивирусного, антибактериального, противогрибкового
и анти-ВИЧ действия. В настоящее время значительный интерес проявляется к
соединениям ряда цитозина, содержащим заместители в положении 5
пиримидинового кольца. Нами найдено, что реакция эфиров 2(диаминометилиден)-3-оксоалкановых кислот 1 с арилизоцианатами приводит к
образованию соответствующих мочевин 2, которые под действием алкоголятов
Na циклизуются в эфиры 1-арил-6-R-цитозин-5-карбоновых кислот 3.
O
H2N
NH2
ArNHCNH
2
O
N
O
N
O
COOR2
Ar
R1
OR2
1
NH2
2
R ONa, R OH
ArNCO
O
O
NH2
R1
OR2
2
R1
3
R1 = Me, Ph; R2 = Me, Et
Соответственно, из пиримидинов 3 и арилизоцианатов по аналогичной
схеме впервые получены 3,6-диарил-5-метилпиримидо[4,5-d]пиримидин2,4,7(1Н,3Н,6Н)-трионы 5.
Структура соединений подтверждена спектральными данными, в том
числе двумерными спектрами ЯМР {1H – 1H} COSY, {1H – 13C} HSQC и HMBC.
113
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ 5-АРИЛ-4-АЦИЛ-3-ГИДРОКСИ-1КАРБОКСИАЛКИЛ-3-ПИРРОЛИН-2-ОНОВ
С НУКЛЕОФИЛЬНЫМИ РЕАГЕНТАМИ
Гейн В.Л., Гейн Л.Ф., Кылосова И.А.
Пермская государственная фармацевтическая академия
С целью поиска новых биологически активных соединений нами было
изучено
взаимодействие
5-арил-4-ацил-3-гидрокси-1-карбоксиалкил-3пирролин-2-онов с анилином, п-, м-, о-толуидином, п-анизидином, пфенетидином, мочевиной и гидразингидратом. В реакциях с мочевиной были
получены 3-аминопроизводные 3-пирролин-2-онов, тогда как при
использовании гидразингидрата в качестве нуклеофильного реагента нами была
получена конденсированная система пирроло[3,4-с]пиразола.
При изучении взаимодействия 1-замещенных 5-арил-4-ароил-3-гидрокси3-пирролин-2-онов с ароматическими аминами обнаружено, что реакция
протекает при кипячении реагентов в уксусной кислоте в течение 1,5 – 2 часов и
приводит к 3-ариламино-5-арил-4-ароил-1-карбоксиалкил-3-пирролин-2-онов
(I). Константы соединений представлены в табл. 1.
OH
ArCO
NH
ArCO
O
N
R2
NH2
+
R2
O
N
(CH2)nCOOH
R1
R1
(CH2)nCOOH
I
n = 1, 2, 5
R1 = Н, 4-Br, 4-Cl, 4-NО2
R2 = Н, 4-Br , 4-F, 4-ОСН3
Полученные соединения (I) представляют собой желтые кристаллические
вещества, растворимые в этаноле, уксусной кислоте, ДМСО, ДМФА и
нерастворимые в воде.
В спектрах ИК соединений I присутствуют полосы поглощения лактамной
карбонильной группы при 1687 – 1688 см-1, кетонной карбонильной группы при
1649 – 1670 см-1, поглощение, обусловленное карбонилом карбоксильной
группы, при 1706 – 1720 см-1, а также полоса поглощения NH-группы при 3075
– 3122 см-1.
В спектрах ЯМР1Н соединений I наблюдается сигнал метинового протона
в положении 5 гетероцикла при 5,72 – 5,22 м.д., мультиплеты протонов
метиленовых групп в положении 1 гетероцикла при 4,32 – 3,58 м.д. и при 3,50
– 2,71 м.д., мультиплет ароматических протонов в положении 5 гетероцикла и
114
боковой цепи при 7,35– 7,02 м.д., сигнал протона NH-группы при 9,22 – 8,22
м.д.
Все полученные соединения не дают реакции со спиртовым раствором
хлорида железа III. Данные спектров и отрицательная качественная реакция
свидетельствуют о существовании соединений I в енаминной форме.
В продолжение изучения свойств 3-пирролин-2-онов нами была
исследована реакция последних с мочевиной и установлено, что сплавление
эквивалентных количеств реагентов при температуре 190 – 200 оС приводит к
3-амино-4-бензоил-1-карбоксиалкил-5-фенил-3-пирролин-2-онам.
OH
PhCO
NH2
PhCO
+ H2NCONH2
O
O
N
N
(CH2)nCOOH
(CH2)nCOOH
II
n = 1, 2, 3, 5
Образование соединений II, по-видимому, объясняется разложением
мочевины до аммиака в условиях проведения реакции, который затем
реагирует с пиррол-2,3-дионом.
Полученные
соединения
II
представляют
собой
кремовые
кристаллические вещества, растворимые в этаноле, уксусной кислоте, ДМСО,
ДМФА и нерастворимые в воде.
В спектрах ЯМР1Н соединений II наблюдается сигнал метинового
протона в положении 5 гетероцикла при 5,54 – 5,49 м.д., мультиплеты протонов
метиленовых групп в положении 1 гетероцикла при 3,71 – 3,53 м.д. и 2,95 – 2,69
м.д., мультиплет ароматических протонов в положении 5 гетероцикла и
боковой цепи при 7,43 – 7,34 м.д., сигнал протонов NH2-группы при 11,17 –
11,06 м.д.
Все полученные соединения II не дают реакции со спиртовым раствором
хлорида железа III, что свидетельствует о замещении атома кислорода
карбонильной группы в положении 3 гетероцикла. Данные спектров и
отрицательная качественная реакция свидетельствуют о существовании
соединений I в енаминной форме.
Синтезированные нами 5-арил-4-ацил-3-гидрокси-1-карбоксиалкил-3пирролин-2-оны содержат при атомах С4 и С3 реакционоспособные
карбонильные группы, которые, как было установлено ранее в ряду 3пирролин-2-онов принимают участие в реакциях с бинуклеофильными
реагентами и могут быть использованы в качестве исходных веществ для
получения разнообразных конденсированных гетероциклических систем.
115
В связи с этим нами было изучено взаимодействие последних веществ с
таким бинуклеофилом как гидразингидрат.
При
изучении
взаимодействия
5-арил-4-ацил-3-гидрокси-1карбоксиалкил-3-пирролин-2-онов с гидразином, нами было обнаружено, что
при кипячении в ледяной уксусной кислоте эквимолярных количеств реагентов
образуются 5-(5-карбоксипентил)-3-метил-4-арилпирроло[3,4-с]пиразол-6-оны
II и 5-(5-карбоксипентил)-3,4-диарилпирроло[3,4-с]пиразол-6-оны III. Исходя
из уже имеющихся литературных данных на первой стадии, очевидно,
образуется соответствующий гидразон, который затем циклизуется в
конденсированную систему пирроло[3,4-с]пиразола III.
OH
R1CO
R1
+
O
NH
H2NNH2 * H2O
O
N
R2
N
N
(CH2)nCOOH
R2
(CH2)nCOOH
III
n=5
R1 = С6Н5, СН3, 4-NО2С6Н4, 4-ClС6Н4
R2 = Н, 4-ClС6Н4, 2-ClС6Н4, 4-FС6Н4
Полученные соединения III представляют собой бесцветные или
желтоватые кристаллические вещества, растворимые в этаноле, ацетоне,
ДМФА, ДМСО и нерастворимые в воде.
В спектрах ИК соединений III присутствуют полоса поглощения
лактамной карбонильной группы при 1670 – 1690 см-1, поглощение,
обусловленное карбонилом карбоксильной группы, при 1700 – 1710 см-1, а
также полоса поглощения NH-группы при 3060 – 3125 см-1.
В спектрах ЯМР1Н полученных соединений III присутствуют сигналы
протонов метиленовых групп при 3,64 – 3,19 м.д. и 2,66 – 2,06 м.д., синглет
метинового протона в положении 5 гетероцикла при 6,09 – 5,42 м.д., группа
сигналов ароматических протонов при 7,43 – 7,29 м.д., синглет протона NHгруппы в гетероцикле при 14,19 – 13,93 м.д.
116
НОВОЕ В МЕТОДОЛОГИИ РАЗРАБОТКИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ
МЕТОДИК АНАЛИЗА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Голубицкий Г.Б. e-mail: [email protected]
ОАО «Фармстандарт-Лексредства»
Введение. Здоровье – бесценное богатство, подаренное человеку
природой. Все, что направлено на сохранение этого невосполнимого дара,
имеет в жизни человека первостепенное значение. С древнейших времен и до
наших дней неузнаваемо изменились способы и средства лечения болезней. Но
на всем этом долгом и трудном пути незаменимыми и верными помощниками
врача были и остаются лекарственные препараты. Можно с уверенностью
утверждать, что и химия как наука зародилась как искусство синтеза и анализа
лекарственных препаратов. Теперь это современная фармацевтическая химия.
Литература по фарманализу очень обширна. Большое место в этом ряду
занимают работы с использованием наиболее мощного современного метода
анализа сложных многокомпонентных смесей – хроматографии. Среди них –
фундаментальные
монографии,
отражающие
общетеоретические
и
практические основы метода [13; 19; 26], теоретические работы о механизме
разделения [12], статьи, посвященные разработке методик анализа того или
иного препарата [2; 15; 18; 23]. Анализ литературы позволяет сделать вывод,
что в современном фармацевтическом анализе при помощи хроматографии
можно выделить два принципиально разных подхода – два принципиально
различных направления.
Так, ряд
исследователей-хроматографистов
утверждает о возможности разработки и использования неких «универсальных»
методов и приборов. Они считают, что с помощью стандартного
хроматографического метода, основанного на подвижной фазе (ПФ)
определенного состава – постоянного, или изменяющегося во времени, можно
разделить и количественно проанализировать практически любую смесь
лекарственных средств. Для этой цели ими предлагаются «хроматографические
анализаторы», работающие по заранее определенной, «зашитой» в них
программе [14]. Мы полагаем, что многообразие существующих и вновь
разрабатываемых лекарственных веществ столь огромно, что нельзя быть
заранее уверенным в разделении любой сложной смеси с помощью
«универсального» метода. В то же время, неприемлема и другая крайность, то
есть разработка для каждой новой многокомпонентной системы лекарственных
веществ совершенно новой методики с использованием колонки
принципиально иного типа и ПФ другого состава с другим рН. По нашему
мнению, целесообразен подход, когда для методик анализа широкого круга
многокомпонентных лекарственных препаратов вводится один, два или
несколько общих факторов. При этом при разработке методики новой
многокомпонентной системы не следует варьировать и изменять сразу все
факторы. Необходим тщательный анализ влияния каждого из этих факторов,
117
после чего следует произвести необходимый минимум изменений. Приведем
конкретный пример. Анализ многочисленных публикаций и наш практический
опыт позволяет сделать вывод, что в абсолютном большинстве случаев для
анализа методом ВЭЖХ многокомопонентных лекарственных препаратов
приемлемо использование в составе ПФ буферного раствора на основе фосфата
калия. В рассмотрение не принимается анализ с использованием массспектрометрического детектирования, требующего использования в составе ПФ
только летучих компонентов, так как этот метод используется в серийном
анализе редко. В то же время, используются буферные растворы самого
различного состава: ацетатные, формиатные, перхлоратные и др., причем в
большинстве случаев такой выбор не обоснован. В абсолютном большинстве
случаев в качестве модификатора ПФ может быть использован ацетонитрил,
однако столь же часто используют метанол, причем единственной причиной
является относительная дешевизна последнего [28].
По нашему мнению, одной из причин такого положения является
недостаточная изученность практической применимости некоторых важных
факторов оптимизации хроматографической селективности. Нами проведено
теоретическое и экспериментальное изучение этих факторов и доказаны
возможности
их
практического
использования
при
разработке
хроматографических методик анализа на фармацевтическом предприятии. Цель
настоящей работы – краткое изложение результатов проведенной работы.
Аппаратура и реактивы. Хроматографический анализ проводили на
хроматографе Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором Waters
2996. Использовали колонки размерами 150 3,9 мм, заполненные сорбентами
Nova Pak C18 (4,0 мкм), Symmetry C18 (5,0 мкм), Nova Pak CN HP (4,0 мкм),
100
4 мм Chromolith Performance C18 и др. Для контроля рН элюентов
использовали рН-метр-милливольтметр рН-673М со стеклянным индикаторным
электородом и хлорсеребряным электродом сравнения.
Для приготовления ПФ использовали ацетонитрил «для градиентной
хроматографии», метанол «для хроматографии», (Мерк, Германия) и
сверхчистую воду из установки Direct-Q (Миллипор, Франция). Все остальные
использованные реактивы имели квалификацию не ниже «чда». Исследовали
лекарственные вещества фармацевтического качества, проверенные отделом
контроля качества предприятия, соответствующие требованиям нормативной
документации по всем показателям.
Роль состава ПФ. Данные, полученные нами при разработке методик
анализа выпускаемых на предприятии многокомопонентных препаратов,
позволяют сделать вывод, неожиданный с точки зрения общепринятой
практики. Речь идет о том, что для ряда систем, содержащих компоненты с
сильно различающимися свойствами, ионная сила буферной составляющей ПФ
может играть более значительную роль, чем концентрация органического
модификатора. Этот фактор может быть использован как для оптимизации
хроматографической селективности, так и для определения таких важных с
практической точки зрения свойств обращенно-фазовых сорбентов, как
остаточная силанольная активность и гидрофобность. Нами показано, что
118
влияние этого фактора на удерживание органических оснований, например
кодеина и эфедрина на колонках с типов Nova Pak C18 и Symmetry C18
противоположно по направлению. В качестве тест-вещества нами предложен
гидрохлорид дифенгидрамина. Удерживание этого вещества в обращеннофазовой системе зависит от содержания калия фосфата однозамещенного в ПФ,
а направление и степень этого влияния характеризует остаточную силанольную
активность и (или) гидрофобность сорбента [8]. Эта зависимость также
использована нами при разработке методик анализа многокомпонентных
лекарственных препаратов – «Пенталгин ICN», «Пенталгин Н» и «Неотеофедрин» для надежного отделения кодеина и эфедрина от остальных
компонентов [6; 7]. Учитывая, что очень многие лекарственные средства
являются органическими основаниями, значение сделанных выводов велико.
На примере ряда других многокомпонентных систем лекарственных
средств, в которых фактор ионной силы не играет столь значительной роли,
нами показано, что и здесь подход «универсальных» методик не совсем
применим. Речь идет о том, что для оптимизации разделения сложных смесей в
градиентном режиме в ряде случаев целесообразно изменять не только наклон
градиента в целом, но и наклон отдельных его участков. В частности, такой
подход использован нами в методике анализа аэрозоля «Оксиметазолин» [5].
При разработке методики анализа многокомпонентного поливитаминного
препарата нами доказано, что для одновременного определения таких сильно
различных по гидрофобности компонентов, как водо- и жирорастворимые
витамины, возможно использование сложного градиента с изменением состава
ПФ от водного раствора к смеси органических растворителей [9]. В литературе
нет аналогичных подходов: описанные методики предусматривают раздельное
определение этих групп витаминов. Кроме того, в литературе описано
использование использование градиентного элюирования с изменением рН ПФ
в течение анализа [27]. Однако имеющаяся информация в основном отражает
общие подходы к рассматриваемой технике, конкретных примеров ее
использования для анализа многокомпонентных препаратов в литературе нами
не найдено. Нами разработана методика анализа нового многокомпонентного
препарата от простуды, в которой изменение рН ПФ в течение анализа явилось
более мощным и более удобным инструментом, чем изменение концентрации
органического модификатора и позволило надежно отделить действующие
вещества от вспомогательных [1].
Сравнительное исследование режимов элюирования. Хорошо
известно о широких дополнительных
возможностях оптимизации
хроматографической
селективности,
представляемых
градиентным
элюированием [26]. Однако в многолетней практике аналитиковхроматографистов сложилось устойчивое мнение о более низкой точности
результатов, получаемых при работе в градиентном режиме по сравнению с
изократическим [19]. По нашему мнению, этот вывод связан с широким
применением приборов устаревшей конструкции, до настоящего времени
используемых во многих лабораториях мира. Обзор литературных данных
показал, что практически нет работ по сравнительному исследованию двух
119
режимов элюирования для анализа реальных лекарственных препаратов. Мы
полагаем, что при использовании современного прибора, настроенного в
соответствии с руководством по эксплуатации и соответствующего паспортным
техническим характеристикам, градиентный режим не уступает по точности
результатов
изократическому.
Эксперимент
подтвердил
данное
предположение: при анализе таблеток «Проходол форте» и сиропа «Кларисенс»
нами подтверждена равноценность этих режимов по точности, а для таблеток
«Кофицил Плюс» и «Ко-тримоксазол» результаты для градиента точнее.
Полученные результаты могут быть объяснены улучшением разделения и
формы пиков при переходе от изократики к градиенту [17].
Сравнительное исследование сорбентов различной полярности.
Анализ литературных данных показывает, что в большинстве случаев анализ
многокомпонентных лекарственных препаратов проводят в обращенно-фазовом
режиме с использованием сорбентов с привитыми группами октацедил- или
октилсилана [28]. Гораздо реже используют более полярные сорбенты,
например, с привитыми нитрильными группами [15]. В литературе практически
нет публикаций, посвященных сравнительному исследованию возможностей
использования сорбентов разной полярности для анализа реальных
многокомпонентных лекарственных препаратов. В то же время выбор сорбента
определенной полярности является мощным фактором оптимизации
хроматографической селективности и сокращения времени анализа, поэтому
такое исследование представляет научный и практический интерес. Нами
показано, что при анализе многокомпонентных таблеток «Беллалгин» [20] и
«Аскофен П» [22] использование колонки с полярным сорбентом с привитыми
нитрильными группами позволяет примерно в два раза снизить
продолжительность хроматографического разделения или вдвое уменьшить
расход дорогостоящего органического растворителя при сохранении времени
анализа. При этом точность и достоверность результатов не ухудшаются.
Исследование нагрузки на колонку. Существует два подхода к анализу
многокомпонентных лекарственных препаратов, содержащих компоненты в
микро- и макроколичествах (различие содержаний в 30 и более раз). Первый
подход связан с анализом растворов двух разных концентраций: разбавленного
раствора
для
макрокомпонентов
и
концентрированного
–
для
микрокомпонентов [2]. При использовании второго подхода анализируют один
испытуемый раствор [6, 7, 15]. Есть публикации, отражающие недостатки
работы, связанной с перегрузкой колонки, что приводит к искажению формы
хроматографических пиков [24] . В то же время, в литературе нет работ по
сравнительному исследованию этих двух подходов. Мы предположили, что на
примере анализа реального многокомпонентного лекарственного препарата
можно показать, что работа в условиях перегрузки приводит к снижению
достоверности
количественных
результатов.
Действительно,
при
хроматографическом анализе таблеток «Пенталгин Н» в градиентном режиме
повышение концентрации испытуемого раствора в два раза приводит к
увеличению средней относительной погрешности определения в несколько раз,
при дальнейшем повышении концентрации показатели достоверности также
120
снижаются. Показано, что при росте концентрации растворов ухудшается
форма хроматографических пиков, что отрицательно сказывается на точности
расчета их площадей [4].
Исследование проблемы влияния вспомогательных веществ на
достоверность результатов анализа. Селективность хроматографической
методики в равной степени зависит от стадий пробоподготовки и
непосредственного разделения. Однако, в большинстве опубликованных
методик вспомогательные вещества, присутствующие в препарате,
рассматриваются как балласт, возможность их взаимодействия с
определяемыми активными компонентами препарата не учитывается. На
примере реально выпускаемого на предприятии многокомпонентного
лекарственного препарата (таблетки «Нео-теофедрин») нами показано, что
физико-химическое взаимодействие определяемого компонента может
приводить к получению заниженных результатов анализа. Методами ВЭЖХ и
ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье доказано, что один из
компонентов этого препарата – гидрохлорид эфедрина взаимодействует со
вспомогательным веществом кросскармеллозой натрия, переходя в
нерастворимое состояние. В то же время, подкисление испытуемого раствора
или добавление калия фосфата однозамещенного предотвращает данный
процесс и обеспечивает достоверность результатов анализа [3].
Изучение оптимальных способов пробоподготовки и анализа
препаратов, содержащих нестабильные лекарственные вещества. Есть
много публикаций по изучению стабильности в растворах анальгина и
аскорбиновой кислоты, например [10; 25]. По нашему мнению, представляет
практический интерес изучение эти факторов применительно к методикам
анализа конкретных многокомпонентных лекарственных препаратов. В связи с
этим нами проведена оптимизация состава растворителя для анализа реально
выпускаемых препаратов, содержащих анальгин или аскорбиновую кислоту.
Показано, что скорость разложения анальгина в водно-органическом растворе
снижается при добавлении сульфита натрия и ацетонитрила. Оптимальные
концентрациями этих компонентов составляют около 5,0 мг/мл и около 5 об. %
соотвественно. Дальнейший рост содержания органического растворителя
нежелателен, так как приводит к ухудшению формы хроматографических
пиков и, как следствие, к снижению точности анализа [16]. Стабильность
аскорбиновой кислоты максимальна в кислой среде, а зависимость этого
показателя от рН растворителя имеет максимум. Добавление органического
растворителя (ацетонитрил, метанол) также повышает стабильность
растворенного вещества [21].
Два подхода к определению продуктов разложения нестабильных
лекарственных веществ. В абсолютном большинстве опубликованных работ
при определении примесей не учитывают возможность разложения веществ в
испытуемом растворе. При этом фактически определяют суммарное
содержание продукта разложения, образовавшееся при хранении препарата и
после его растворения [10]. Для повышения достоверности такого анализа
перспективен кинетический способ, использованный нами для определения
121
продукта разложения анальгина – 4-метиламиноантипирина (4-МААП) в
таблетках «Пенталгин ICN» и «Пенталгин Н». Показано, что зависимость
скорости образования 4-МААП от времени в первые 30 мин после растворения
линейна. В связи с этим, по разности площадей пика 4-МААП на первой и
второй хроматограммах, можно рассчитать «площадь» в нулевой момент
времени, по которой рассчитать содержание примеси до растворения пробы.
Таким образом, значительно повышается достоверность результатов [11].
Выводы. Результаты исследования свойств обращенно-фазовых
сорбентов, роли буферной составляющей ПФ, обоснование кинетического
способа к определению продуктов разложения могут быть использованы при
анализе объектов любой природы и назначения. Методологический подход к
исследованию взаимодействия между компонентами лекарственного препарата
может быть также использован при разработке технологии многокомпонентных
лекарственных форм для обеспечения их стабильности и при исследовании
биодоступности действующих веществ. Обоснование оптимальной полярности
используемых хроматографических сорбентов, наиболее выгодных режимов
элюирования, определение допустимой нагрузки на колонку позволит ускорить
получение результатов анализа и повысить их достоверность. Все это, в
конечном итоге, должно способствовать решению одной из важнейших задач
фармацевтической промышленности – обеспечить высокое качество и
безопасность выпускаемых многокомпонентных лекарственных препаратов.
Литература
1. Анализ многокомпонентного препарата от простуды «Максиколд»
методом ВЭЖХ с градиентом рН подвижной фазы / Г.Б. Голубицкий,
А.В. Иванов, Е. М. Басова, В. М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2007. – Т. 62,
№ 9. – С. 969–972.
2. Вергейчик, Е.Н. ВЭЖХ в анализе сложных препаратов, содержащих
пропифеназон / Е.Н. Вергейчик, Н.С. Онегова // Фармация. – 2001. –Т. 50, № 3.
– С. 24–26.
3. Взаимодействие гидрохлорида эфедрина с кросскармеллозой натрия и
его учет при анализе эфедринсодержащих препаратов / Г.Б. Голубицкий,
Е.В. Будко, Е.М. Басова, В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2008. – Т. 63, №
2. – С. 179–183.
4. Голубицкий, Г.Б. Влияние нагрузки на колонку на правильность
результатов анализа таблеток «Пенталгин Н» методом градиентной
высокоэффективной жидкостной хроматографии / Г.Б. Голубицкий,
Е.М. Басова, В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2008. – Т. 63, № 3. – С.
279–283.
5. Голубицкий, Г.Б. Возможности градиентной ВЭЖХ при анализе
некоторых многокомпонентных лекарственных форм / Г.Б. Голубицкий,
Е.М. Басова, В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2008. – Т. 63, № 9. – С.
962–968.
122
6. Голубицкий, Г.Б. Количественное определение компонентов
лекарственных
препаратов
жаропонижающего,
анальгезирующего,
противопростудного действия методом градиентной высокоэффективной
жидкостной хроматографии / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко // Хим.-фарм. журн.
– 2006. – Т. 40, № 11. – С. 52–56.
7. Голубицкий, Г.Б. Количественный анализ таблеток «Пенталгин Н»
методами градиентной и изократической высокоэффективной жидкостной
хроматографии / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко, В.М. Иванов // Журн. аналит.
химии. – 2006. – Т. 61, № 1. – С. 74–79.
8. Голубицкий, Г.Б. Метод оценки остаточной силанольной активности
обращенно-фазовых хроматографических сорбентов / Г.Б. Голубицкий,
В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2008. – Т. 63, № 4. – С. 388–395.
9. Голубицкий, Г.Б. Одновременное количественное определение водо- и
жирорастворимых витаминов и консервантов с использованием колонки нового
типа Chromolith / Г.Б. Голубицкий // Заводск. лаборатория. Диагностика
материалов. – 2008. – Т. 74, № 3. – С. 10–14.
10. Грешных, Р.Д. Исследование химических свойств анальгина в 50%
водном растворе для инъекций / Р.Д. Грешных, Н.Н. Храковская, В.Е. Чичиро //
Хим.-фарм. журн. – 1979. – Т. 13, № 3. – С. 68–73.
11. Кинетико-хроматографическое определение 4-метиламиноантипирина
в таблетках «Пенталгин Н» и «Пенталгин ФС» / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко,
Е.М. Басова, В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2007. – Т. 62, № 7. – С.
733–739.
12. Киселев, А.В. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии /
А.В. Киселев, Д.П. Пошкус, Я.И. Яшин. – М. : Химия, 1986. – 269 с.
13. Количественный анализ хроматографическими методами. / Э. Грушка,
Э. Йенсен, С. Хатиб и др. ; ред. Э. Кэц. – М. : Мир, 1990. – 320 с.
14. Новые возможности ВЭЖХ в фармакопейном анализе / Г.И. Барам,
Д.В. Рейхарт, Е.Д. Гольдберг и др. // Бюл. экспер. биол. и медицины. – 2003. –
Т. 135, № 1. – С. 75–79.
15. Оптимизация условий анализа таблеток сложного состава
аналгезирующего и спазмолитического действия / С.Г. Ларионова,
Н.Н. Дементьева, Е.Б. Нечаева и др. // Фармация. – 2002. – Т. 51, № 1. – С. 16–
19.
16. Разложение анальгина в водно-ацетонитрильных растворах /
Г.Б. Голубицкий, А.В. Костарной, Е.В. Будко и др. // Журн. аналит. химии. –
2006. – Т. 61, № 10. – С. 1081–1085.
17. Сравнение воспроизводимости площадей пиков последовательных
инжекций при анализе некоторых многокомпонентных лекарственных
препаратов методами изократической и градиентной ВЭЖХ / Г.Б. Голубицкий,
Е.В. Будко, Е.М. Басова, В.М. Иванов // Журн. аналит. химии. – 2007. – Т. 62,
№ 3. – С. 277–280.
18.
Стандартизация
препарата
«Аданол»
/
А.Ю.
Петров,
С.А. Дмитриченко, А. Л. Коваленко, Л. Е. Алексеева // Фармация. – 2002. – Т.
51, № 6. – С. 11–13.
123
19. Схунмакерс, П. Оптимизация селективности в хроматографии / П.
Схунмакерс – М. : Мир, 1989. – С. 316.
20. Удерживание анальгина и анестезина на сорбентах разной
полярности. Анализ таблеток «Беллалгин» методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко, Е.М. Басова и др. //
Журн. аналит. химии. – 2007. – Т. 62, № 2. – С. 170–174.
21. Устойчивость аскорбиновой кислоты в водных и водно-органических
растворах для количественного определения / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко,
Е.М. Басова и др. // Журн. аналит. химии. – 2007. – Т. 62, № 8. – С. 823–828.
22. Хроматографическое разделение парацетамола, кофеина и аспирина
на сорбенте с привитыми нитрильными группами и анализ таблеток «Аскофен
П» / Г.Б. Голубицкий, Е.В. Будко, Е.М. Басова и др. // Журн. аналит. химии. –
2007. – Т. 62, № 6. – С. 636–640.
23. Эпштейн, Н.А. Одновременное определение триметоприма,
сульфаметаксазола, метил- и пропилпарабенов в суспензиях типа «Котримоксазола» методом ВЭЖХ» / Н.А. Эпштейн // Хим.-фарм. журн. – 2002. –
Т. 36, № 12. – С. 37–41.
24. Gritti, F. Physical origin of peak tailing on C18-bonded silica in reversedphase liquid chromatography / F. Gritti, G. Guiochon // J. Chromatogr. A. – 2004. –
V. 1028, N. 1. – P. 75–88.
25. Iwase, H. Determination of ascorbic acid in food by column liquid
chromatography with electrochemical detection using eluent for prerun sample
stabilization. Technical note / H. Iwase, I. Ono // J. Chromatogr. A. – 1998. – V. 806,
N. 2. – P. 361–364.
26. Jandera, P. Gradient elution in column liquid chromatography: Theory and
practice / P. Jandera, J. Churáček. – Amsterdam : Elsevier, 1985. – 510 p.
27. Kaliszan, R. pH gradient high-performance liquid chromatography: theory
and applications / R. Kaliszan, P. Wiczling, M. J. Markuszewski // J. Chromatogr. A.
– 2004. – V. 1060, N. 1–2. – P. 165–175.
28. USP30 – NF25. The United States Pharmacopeia & National Formulary /
The United States Pharmacopeial Convention, 2006.
124
ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ
ПЛЕНОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОТИТОВ
Гончарова О.Г., Ерофеева Л.Н., Завьялов Ф.Н., Афонина Н.Д., Медведева О.А.,
Филиппова О.Э. e-mail: [email protected]
Курский государственный медицинский университет
Лечение хронического воспаления среднего уха является одной из
наиболее важных проблем оториноларингологии. Гнойно-деструктивные формы
хронического среднего отита (эпитимпано-антральный хронический гнойный
средний отит, холестеатома среднего уха) своими проявлениями не только
значительно ухудшают качество жизни (периодическая или постоянная оторея,
снижение остроты слуха), но и являются причиной грозных осложнений:
менингита, энцефалита, абсцесса головного мозга, тромбоза сигмовидного
синуса, сепсиса, лабиринтита. Социальная значимость хронического гнойного
среднего отита обусловлена развитием тугоухости, затрудняющей общение
людей друг с другом, ограничивающей профессиональную деятельность. Рост
числа больных, страдающих хроническим гнойным средним отитом,
несостоятельность консервативной терапии, которая связана с малым
ассортиментом лекарственных препаратов, применяемых при перфоративном
отите, присутствием в их составе ототоксических антибиотиков (неомицина,
гентамицина), консервантов, угнетающих мукоцилиарный транспорт, делают
актуальной проблему создания новых, современных лекарственных средств и
методов лечения. Для лечения гнойных отитов перспективно применение
полимерных биорастворимых пленок с антимикробными средствами, выбор
которых проводился с учетом чувствительности микрофлоры больных ЛОРотделения Курской областной клинической больницы № 1. Установлена
высокая чувствительность выделенных за последние 5 лет микроорганизмов к
цефалоспоринам и ципрофлоксацину.
Цель исследования – изучение стабильности биорастворимых
лекарственных пленок с ципрофлоксацином и их эффективности при лечении
хронических гнойных средних отитов.
Оптимальное содержание действующего вещества в пленках определяли с
использованием данных литературы, с учетом минимальной подавляющей
концентрации и отсутствия негативного влияния на транспортную активность
мерцательного эпителия слизистой оболочки. В результате проведенных
исследований выбрано содержание ципрофлоксацина 0,5 мг/см2.
В качестве основы пленок изучены разрешенные к медицинскому
применению
водорастворимые
производные
целлюлозы:
оксипропилметилцеллюлоза марки Methoсel 65 Hg-50 (ОПМЦ), метилцеллюлоза
марки МЦ-100 (МЦ), натрий-карбоксиметилцеллюлоза фирмы Cekol (Nа-КМЦ)
и полимер голландской фирмы Hercules Blanose Cellulose Gum Type 7M31CF
(Бланоза). Выбор оптимального полимера-носителя проводили в два этапа:
методом диффузии в агар при микробной нагрузке 10 млн микробных тел в 1 мл
125
в отношении тест-микроорганизмов Escheriсhia coli ATCC 25922, Staphylococcus
aureus АТСС 209 Р и Bacillus subtilis АТСС 6633 и с использованием теста
«Растворение». В качестве среды растворения использовали 500 мл воды
очищенной, скорость вращения корзинки 100 об/мин. В процессе определения
поддерживали температуру (37±1)º С. Через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 минут
отбирали пробы раствора объемом 5 мл, которые восполняли водой очищенной.
Для дальнейших исследований разработана УФ-спектрофотометрическая
методика количественного анализа по собственному поглощению на
спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при
длине волны 278 нм. Содержание лекарственного вещества в среде растворения
и в пленках рассчитывали по уравнению калибровочного графика, полученного
методом наименьших квадратов: D = 0,1051 · C – 0,0040.
Методом диффузии в агар установлена высокая антимикробная
активность полимерных пленок (зоны угнетения роста микроорганизмов
превышают 30 мм), но не выявлено достоверной разницы в антимикробной
активности пленок на разных полимерах-носителях.
При исследовании пленок в приборе «вращающаяся корзинка»
установлено, что наиболее быстрое и полное высвобождение наблюдается из
МЦ (через 5 минут 99% вещества). Постепенное растворение и, следовательно,
пролонгированное действие обеспечивается при использовании в качестве
полимеров-носителей ОПМЦ (через 10-15 минут в раствор переходит 77-78 %
ципрофлоксацина и далее концентрация поддерживается на достигнутом
уровне), Na-КМЦ (максимум растворения 92-98% наблюдался через 45-60
минут) и Бланозы (максимум растворения 82-88 % - через 30-60 минут).
На выбранных основах (ОПМЦ и Na-КМЦ) в асептических условиях
изготовлены пленки методом испарения растворителя. Пленки представляют
собой белые, тонкие, однородные, круглые эластичные пластинки размером 0,5
см2. Для обеспечения стерильности изучена возможность стерилизации пленок
УФ-светом в течение 20, 40 и 120 минут. Показана стабильность пленок с
ципрофлоксацином после стерилизации в течение 3 месяцев (срок наблюдения).
С
использованием
физико-химических,
химических
и
микробиологических методов анализа установлена стабильность основных
показателей качества полимерных пленок (внешний вид, средняя масса, время
растворения, подлинность, количественное содержание, антимикробная
активность в течение 12 месяцев хранения (срок наблюдения) в защищенном от
света месте при комнатной температуре и в холодильнике.
Пленки применяли после операции на среднем ухе 1 раз в сутки в
течение 6-7 дней с добровольного информированного согласия пациентов.
Выбор пленки для каждого пациента проводился после определения состава
микрофлоры, выделенной у больного из среднего уха, и еѐ чувствительности к
антимикробным средствам. Использовались пленки с антибиотиком, к
которому чувствительна микрофлора.
Проведено комплексное обследование и лечение 39 пациентов
хроническим гнойным средним отитом в ЛОР-отделении Курской областной
клинической больницы, которым под интубационным наркозом была
126
выполнена санирующая операция (или санирующая операция +
тимпанопластика 2 или 3 типа). В основную группу (19 человек) вошли
пациенты,
которым
выполнена
эндауральная
санирующая
аттикоантромастоидотомия с частично интактной задней стенкой и
укладыванием в послеоперационную полость антибактериальных полимерных
плѐнок с ципрофлоксацином. В контрольной группе проводились операции по
открытой методике без облитерации: 8 больным выполнена эндауральная
трансмеатальная санирующая аттикоантромастоидотомия с удалением задней
стенки; 12 пациентам – санирующая мастоидотомия со вскрытием антрума,
аттика и удалением задней стенки заушным подходом, после чего согласно
обычной схеме лечения в послеоперационную полость вводился тампон с
раствором фурациллина. На 12-е сутки, через 6 месяцев и через 1 год
проводился анализ отдалѐнных клинических результатов у всех больных,
перенесших операции на среднем ухе.
В послеоперационном периоде на 12-е сутки у больных в основной
группе наблюдалось меньшее количество раневого отделяемого в
трепанационной полости, чем в контрольной; отсутствовали оторея, гиперемия
и инфильтрация слизистой барабанной полости. Начало активного
гранулирования послеоперационной полости в первой группе происходило на
8-9 сутки, в то время как во второй - на 12-13 сутки. При отомикроскопии в
основной группе наблюдали появление признаков эпидермизации на 12 сутки, в
контрольной группе – на 20-22 день послеоперационного периода.
В течение 6 месяцев у пациентов основной группы отмечалось
отсутствие раневого отделяемого в трепанационной полости, отореи,
гиперемии и инфильтрации слизистой барабанной полости, при этом
послеоперационная полость эпидермизировалась полностью. В группе с
традиционным ведением в течение 6 месяцев отмечались неоднократные
гноетечения, инфильтрация слизистой сохранялась, появлялись лишь первые
признаки эпидермизации послеоперационной полости, неоднократно возникало
такое осложнение, как «болезнь трепанационной полости».
Через год у пациентов основной группы наблюдалась небольших
размеров послеоперационная полость, полная еѐ эпидермизация, а также
отсутствие такого осложнения как ―болезнь трепанационной полости‖. У
пациентов с традиционным ведением послеоперационного периода в анамнезе
отмечались неоднократные рецидивы гноетечения, а также участки с
отсутствием эпидермизации послеоперационной полости.
Выводы:
1. Метод лечения хронических гнойных средних отитов с использованием
антимикробных
полимерных
пленок
характеризуется
клинической
эффективностью и удобством.
2. Установлена стабильность пленок с ципрофлоксацином в течение 12
месяцев хранения.
127
НАПРАВЛЕННЫЙ ПОИСК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
В РЯДУ ЗАМЕЩЕННЫХ КУМАРИНОВ
Григорьева О.А., Никишин А.Ю., Федотова О.В.
e- mail: [email protected]
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
Проведена проверка адекватности использования разработанной нами
оригинальной системы IrraNOVA с использованием нейронных сетей на основе
дескрипторов, рассчитанных исходя из трехмерной структуры молекул, для
предсказания биологических свойств в ряду полиоксосоединений (замещенных
кумаринов) и продуктов их превращений на примере антифаговой активности;
получены экспериментальные подтверждения эффективности созданной
программы.
Синтез полиоксосоединений и гетероциклов на их основе осуществлялся
в соответствии с приведенной схемой:
O
Me
O
Me
O
OH
O
N
HCONH2
2
NH2OH HCl
O
O
i-PrOH
Me
O O
N N
N2H4
AcOH
Me OH
O
5
O
1
AcONH4
NH
O
i-PrOH
Me
O
O
O
4
3
Интерес к выбранному исходному субстрату 3-ацетоацетилхромен-2-ону
(1) обусловлен наличием кумаринового (бензопиран-2-онового) фрагмента
который входит в состав препаратов обладающих широким спектром
биологического действия. Известно их использование в качестве
антиоксидантов, антимикробных, антивирусных и противоопухолевых
препаратов. Дикумарол был предложен как антикоагулянт для лечения и
профилактики тромбозов и тромбофлебитов. На его основе получены
препараты с высокими антикоагулянтными свойствами. Известны также
фурокумарины с противоопухолевой активностью. Это действие связывают с
их способностью тормозить рост опухолевых клеток и оказывать влияние на
разные стадии митоза. Некоторые кумарины и фурокумарины обладают
бактериостатическим и противогрибковым действием.
Функциализация кумаринов путем введения азота придает им новые
свойства и позволяет переходить к новым практически важным соединениям.
128
Установлено, что в формамиде, выступающем в качестве реагента и
растворителя, 3-ацетоацетил-2H-хромен-2-он (1) через стадию енолизации
ацетильного карбонила подвергается полукетализации (35%) до нового типа
линеарной системы – 10a-гидрокси-2-метил-4H-пирано[2,3-b]-10aH-хромен-4она (2) .
Показано, что взаимодействие субстрата 1 с ацетатом аммония в
условиях реакции Чичибабина приводит к нуклеофильной атаке по атому
углерода карбонильной группы в положении 1 заместителя и образованию с
выходом 57% 3-(3-гидрокси-1-имино-2-бутенил)-2H-хромен-2-она (3) .
Выделение имина 3 подтверждает тенденцию 3-замещенных кумаринов к
сохранению 2H-хромен-2-онового фрагмента в реакциях со слабыми
мононуклеофильными реагентами.
Нами найдено, что реакция с бинуклеофильными реагентами –
гидроксиламином и гидразином носит общий характер и протекает с участием
карбонильных групп, находящихся в положениях 1 и 3 алифатической части
молекулы, с формированием новых гетероциклических систем – 3-(5-метил-4Нпиразол -3-ил)- (4) и 3-(5-метил-4H- изоксазол -3-ил)-2H-хромен-2-онов (5) с
выходом 47% и 63 % соответственно.
Строение вновь синтезированных соединений доказано данными ЯМР1Н
спектроскопии.
В спектрах ЯМР 1Н соединений 2-5 наблюдается мультиплет
ароматических протонов в области 6.99-7.81 м.д. и синглет протонов метильной
группы при 2.27 м.д. Кроме того, в ЯМР 1Н спектре полукеталя 2 отмечен
сигнал протона полукетального гидроксила при 3.56 м.д. Сигналы винильных
протонов проявляются при 6.19 и 8.12 м.д.
В ЯМР 1Н спектре имина 3 по сравнению со спектром исходного
триоксосоединения 1 добавляется единственый сигнал иминного протона при
11.71 м.д.. Влияние иминной группы проявляется в смещении сигналов
винильных протонов в область сильного поля: при С4 2H-хромен-2-онового
фрагмента на 0.51 м.д., в заместителе на 0.31 м.д. Для 3-замещенных
2H-хромен-2-онов 4 и 5 отмечены сигналы винильных протонов при 8.50 м.д. и
8.43 м.д. соответственно. Протон гетероциклической системы изоксазола
проявляется при 6.83 м.д.
Одним из перспективных направлений развития современной химической
науки является установление количественной взаимосвязи между структурой
химических соединений и их активностью (QSAR). Современные достижения в
области прикладной математики, компьютерной техники и искусственного
интеллекта привели к появлению инновационных программных технологий,
позволяющих создавать эффективные экспертные системы рационального
конструирования лекарственных средств. Использование подобных систем
фармацевтическими компаниями приводит к значительной экономии времени и
средств. Современные модифицированные методы математической статистики
позволяют с той или иной степенью достоверности устанавливать спектр
биологической активности вновь полученных и еще не синтезированных
соединений; производить поиск наиболее активных представителей ряда
129
веществ со сходным строением; проводить отбраковку соединений,
обладающих высокой токсичностью. Анализ полученных данных позволяет
сделать вывод относительно структурных особенностей молекул, приводящих к
изменению любого вида активности.
Построенная нами нейросетевая модель позволила произвести
тестирование синтезированных соединений на антифаговую активность и
осуществить ее корреляцию с экспериментальными исследованиями (табл. 1).
Таблица 1.
Антифаговая активность синтезированных соединений
Соединение
Структура
Рассчитанная
активность, %
Найденная
активность, %
87,55
78
90,75
-
97,70
87
89,84
80
104,41
93
O
1
Me
O O
O
O
2
Me
O
OH
NH
O
3
Me OH
O
N N
4
O
Me
O
O
Me
5
O
N
O
O
Полученные результаты подтвердили возможность использования
разработанной программы для количественной оценки связи «структурабиологическая активность» на основе трехмерного строения молекул,
предварительно рассчитанного методом квантовой химии. Определены
перспективы применения вновь синтезированных соединений как антифаговых
препаратов и сред для хранения штаммов бактерий в различных
коллекционных центрах.
130
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К НОВОЙ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОЙ
СИСТЕМЕ - ПИРАЗОЛО[5,1-C]ПИРИДО[4,3-E][1,2,4]ТРИАЗИНУ
Диденко В.В., Леденѐва И.В. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Разработка подходов к созданию биологически активных веществ
составляет одну из приоритетных задач синтетической химии. Большой интерес
в поиске потенциальных лекарственных средств представляют трициклические
азолоазины [1-4]. Проводимые in vitro исследования пиразоло[1,5-a]пиридо[3,4e]пиримидин-6-онов показали наличие у этого класса соединений
противомикробной активности [5, 6]. Структурно схожие с ними пиразоло[5,1c]пиридо[4,3-e][1,2,4]триазины, как деазааналоги, могут оказаться не менее
привлекательными субстратами в плане изучения их физиологических и
фармакологических свойств.
Нами было разработано несколько подходов к синтезу новой
гетероциклической матрицы - пиразоло[5,1-c]пиридо[4,3-e][1,2,4]триазину - с
использованием пиразол-3(5)-диазониевой соли в качестве билдинг-блока.
N
O
R
N
N
N
R
R
DMF DMA
N
N
N
NH3
N
N
DMF
Ph
2a-d
N
N
Ph
3a-c
4a, b
AcOH
N
N
R1 = Me, Ph
Ph
DMF DMA
DMF
R1 = NHAr
O
N
O
X-NH2
R1 = OEt
O
R1
R
N
O
HN
N
NH
_
N2 Cl
+
O
X
OH
N
N
N
2: R = Me (a); Ph (b); OEt (c); NHAr (d)
N
EtOH
3: R = Me (a); Ph (b); OEt (c)
Ph
Ph
1
5a-d
4: R = Me (a); Ph (b)
5: R1 = H; X = H (a);
R1 = H; X = Alk (b);
R1 = H; X = Ar/Het (c);
R1 = Me; X = H (d)
131
Азосочетанием хлорида 3-метил-4-фенил-1Н-пиразол-3(5)-диазония (1) с
метиленактивными β-дикарбонильными соединениями (ацетилацетоном,
бензоилацетоном,
ацетоуксусным
эфиром,
ацетоацетанилидами)
и
последующей циклизацией образующихся гидразонов [7-9] получены
соответствующие пиразоло[5,1-c][1,2,4]триазины 2a-d.
Региоселективное аминометиленирование продуктов по CH-активной
метильной группе при кратковременном нагревании с диметилацеталем
диметилформамида (DMF DMA) привело к образованию гетероциклических
енаминов 3 a-c с Е-конфигурацией двойной связи.
В результате циклизации енаминокетонов 3a, b при длительном
нагревании с избытком ацетата аммония в уксусной кислоте были
синтезированы
первые
два
представителя
новой
трициклической
гетероароматической системы – пиразоло[5,1-c]пиридо[4,3-e][1,2,4]триазина 4a,
b.
Синтетический путь к аннелированным 2-пиридонам 5a-c возможен при
взаимодействии диметиламиновинилпроизводного 3с с N-нуклеофилами
(аммиак, алифатические, ароматические и гетероциклические амины) в
уксусной кислоте. Эта реакция протекает с высокими выходами (75-90%) через
стадию
переаминирования
и
последующего
внутримолекулярного
амидирования и на данных объектах описана нами ранее [10].
Высокоэффективный
встречный
синтез
пиразоло[5,1-c]пиридо[4,3e][1,2,4]триазин-6(7H)-онов 5c можно также провести, минуя стадию выделения
интермедиатов типа 3, при циклоконденсации пиразолотриазинов 2d с
диметилацеталем диметилформамида.
Ещѐ одним альтернативным способом построения целевой системы
является азосочетание соли пиразолдиазония 1 с производным α-пиридона. В
этом случае реакция также протекает без выделения промежуточного гидразона
и приводит к соединению 5d.
Идентификация промежуточных и целевых соединений проводилась
методами РСА, ЯМР 1H спектроскопии, масс-спектрометрии и элементного
анализа.
Все синтезированные вещества были подвергнуты виртуальному
скринингу in silico с помощью программы PASS [11]. Как следует из
результатов прогноза, из ~1000 видов биологической активности,
прогнозируемых в настоящее время программой PASS, 10 предсказаны с
вероятностью, превосходящей 70%. Наиболее вероятные виды активности:
антиневротическое,
анксиолитическое,
ингибитор
передачи
сигнала
проводящих
путей,
нейропротектор,
антагонист
высвобождения
кортикотропного фактора.
Подводя итог данного исследования, можно отметить, что разработанные
нами препаративные подходы к новым пиразоло[5,1-c]пиридо[4,3e][1,2,4]триазинам могут оказаться полезными при выборе доступных и
экономически выгодных путей синтеза как указанных соединений, так и их
132
аналогов. Кроме того, полученные системы весьма перспективны для
биологического скрининга.
Литература
1.
Stevens M. F. G. in Progress in Medicinal Chemistry, Ellis G. P., West
G. B. Eds., North-Holland Publishing Company: Toronto, vol. 13, 1976, 205.
2.
Choiidliari B. P., Muhvad V. V., Indian J. Chem., 45B, 2006, 309.
3.
Ciciani G., Coronello M., Guerrani G., Selleri S., Castore M., Failli P.,
Bioorg. Med. Chem., 16, 2008, 9409.
4.
Ali T. E., Eur. J. Med. Chem., 44, 2009, 4385.
5.
Bruni F., Selleri S., Costanzo A., Guerrani G., Casilli M. L., Farmaco,
51, 1996, 451.
6.
Bruni F., Selleri S., Costanzo A., Guerrani G., Ciciani G., Costagli C.,
Farmaco, 52, 1997, 639.
7.
Диденко В. В., Воронкова В. А., Шихалиев Х. С., Мат-лы
междунар. науч. конф. «Фундаментальные и прикладные проблемы
современной химии в исследованиях молодых учѐных», (Астрахань, 10-12
сентября 2006 г.), Астрахань, 2006, 64.
8.
Крыльский Д. В., Шихалиев Х. С., Диденко В. В., в кн.
Азотсодержащие гетероциклы, под ред. В. Г. Карцева, ICSPF, Москва, т. 2,
2006, 159.
9.
Диденко В. В., Воронкова В. А., Шихалиев Х. С., Журн. Орг. Химии,
45, 2009, 223.
10. Диденко В. В., Шихалиев Х. С., Медведева С. М., Леденѐва И. В.
Вестник ВГУ. Сер. Химия, Биология, Фармация., 2008, 26-28.
11. Poroikov V. V., Filimonov D. A. in PASS: Prediction of Biological
Activity Spectra for Substances, Predictive Toxicology, Helma C. Ed., Taylor &
Francis: N.-Y., 2005, 459.
133
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ГЛИЦИНА НА КЛИНОПТИЛОЛИТОВОМ ТУФЕ
До Тхи Лонг1, Черенкова Ю.А.1, Котова Д.Л.1, Крысанова Т.А.1, Бекетов Б. Н.2,
Лукин А.Н.1 e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Тюменская государственная медицинская академия
Природные цеолиты, в частности клиноптилолитовый туф, в настоящее
время все шире применяются в качестве активного вещества при изготовления
препаратов сорбционно-детоксикационого действия (энтеросорбентов),
показавших свою эффективность при хирургическом и консервативном
лечении инфекционных, онкологических, иммунологических и некоторых
других заболеваний. Использование алюмосиликата в качестве носителя
лекарственного вещества позволяет получить двойную выгоду: увеличить
длительность действия препарата и предотвратить его преждевременное
выведение [1-3]. В данной работе представлены результаты исследования
равновесных характеристик сорбции глицина на клиноптилолитовом туфе.
Исследуемый природный сорбент Люльинского месторождения
представляет собой многофазовую смесь[4], основной фазой которого является
клиноптилолит (KNa2Ca2(Si29Al7O79)*12H2O (68%)), прошел клиническое
испытание и применяется в качестве энтеросорбента ―Климонт‖. Удельная
поверхность природного туфа, измеренная по парам воды, составляет 107,90
м2/г. Средний размер пор и каналов определен с помощью метода сканирующей
зондовой микроскопии и равен соответственно 0,35-0,43 нм и 1,50-200 нм. В
работе использовали глицин производства фирмы ―Reanal‖ (Венгрия),
классификации «ч.д.а.».
Сорбцию алифатической аминокислоты на природном сорбенте фракцией
0,02 – 0,06 мм проводили в статических условиях [5] при температуре 295 К из
водных растворов аминокислоты с рН = 5,8 ± 0,2, где глицин присутствовал в
виде цвиттерионов.
Изотерма сорбции алифатической аминокислоты на клиноптилолитовом
туфе имеет S-образный вид (рис.1). Такой вид изотермы, может быть
обусловлен изменениями в механизме взаимодействия не только в фазе
сорбента, но и в фазе внешнего раствора. Установлено, что максимальный
сорбционный параметр по глицину составляет 2,30 ммоль/г при концентрации
внешнего раствора 30,0 ммоль/л.
Катионы, заполняющие полости клиноптилолитового туфа, окружены
гидратными оболочками и участвуют в ионном обмене. Их суммарная
концентрация в фильтрате служит мерой ионообменной составляющей
сорбции. Для глицина эта величина составляет 13,7 % от обменной емкости,
определенной по ионам аммоний. При сорбции алифатической аминокислоты
из концентрированных растворов (более 12,5 ммоль/л) характерно возрастание
сорбционного параметра, при этом количество аминокислоты, сорбированной
по ионообменному механизму, не изменяется. Наблюдаемый резкий рост
134
сорбционной способности клиноптилолитового туфа к аминокислоте может
быть обусловлен как сорбцией аминокислоты в виде ассоциатов, образованных
за счет диполь-дипольного взаимодействия цвиттерионных групп, так и
образованием аквакомплексов между алюминием каркаса и азотом
аминогруппы аминокислоты[6].
Qсорб. , ммоль/г
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Сравн. , ммоль/л
0,0
0
10
20
30
40
Рис.1 Изотерма сорбции цвиттерионов глицина (рН=5,8 ± 0,2) на
клиноптилолитовом туфе
Методом электронной микроскопии исследована поверхность исходного
клиноптилолитового туфа и содержащего аминокислоту. Установлено, что
клиноптилолитовый туф имеет сложный рельеф микроповерхности,
образованный микрокристаллами и агрегатами различных минеральных фаз.
Средний размер полостей и каналов природного минерала колеблется от 5 до
200 нм, тогда как после иммобилизации глицина он уменьшается и составляет
1-90 нм. Отсутствие полостей и каналов большого размера в образце,
содержащем аминокислоту, указывает на то, что аминокислота закрепляется в
данных местах в виде ассоциатов.
Анализ АСМ-изображений позволил установить наличие в каркасе
природного сорбента больших каналов и пустот, которые значительно
различаются как по размерам, так и по форме. Средний диаметр пор исходного
клиноптилолитового туфа составляет для самых мелких 0,66 нм, для самых
крупных пор - 2,32 нм, глубина пор изменяется от 150 до 400 нм.
Иммобилизация глицина не приводит к изменению структуры сорбента, но
проявляется в изменении размера пор. Для образца, содержащего глицин,
диаметр пор уменьшается и составляет 0,34 – 1,29 мкм. Глубина пор для самых
мелких пор равна 40 нм, для крупных – 220 нм. Полученные результаты
позволяют предположить, что закрепление аминокислоты происходит как на
поверхности, так и в порах сорбента.
Отмечается, что иммобилизация глицина на природном сорбенте
приводит к изменению рельефа поверхности образца минерала. Для исходного
образца сорбента структурными единицами поверхности являются блоки, тогда
135
как для сорбента, содержащего глицин, таковыми являются линейные цепочки,
образованные ассоциатами аминокислоты.
На образование ассоциатов глицина при сорбции на клиноптилолитовом
туфе свидетельствуют данные ИК спектроскопии. Появление дополнительных
полос поглощения в области 2700–2500см-1 и максимума при 3120 см-1
соответственно для глицина, характерных для связи COO-…+NH3 указывают на
образование ассоциатов в структурной матрице сорбента. Кооперативный
характер закрепления алифатической аминокислоты на клиноптилолитовом
туфе находит подтверждение в большем сорбционном параметре биполярных
ионов (в 2,5 раз) по сравнению с катионами исследуемой аминокислоты.
Доказательством
образования
комплексов
в
структуре
клиноптилолитового туфа с участием аминокислоты служат следующие факты:
1) достаточно высокие значения константы устойчивости данных комплексов
(Al3+ с глицином lgβ1-3 = 19,40); 2) изменение спектральных характеристик
раствора, содержащего соль алюминия и алифатическую аминокислоту, по
сравнению с индивидуальными веществами; 3) смещение частот валентных
колебаний Si-O- Al (1060→1040 см-1) и NH3+ (3129→3070 см-1) в область
низких значений [7,8].
Литература
1. Uekama R., Hirayama F., Irie T. // Ibid. 1998. V. 98. №5. P. 2045.
2. Phan T.N.T., Bacquet M., Morcellet M. // Reactive and Functional
Polymers. 2002. V. 52. №2. P. 177.
3. Ali M.B., Kalfat R., Sfihi H. // Sensors and Actuators. 2000. V. 62. №3. P.
233.
4. Черенкова Ю.А. Сорбционные и физико-химические свойства цеолита
приполярного Урала югры / Ю.А. Черенкова и [др.] // Сорбционные и
хроматографические процессы. – 2006. – Т.6. вып. 6. Ч.4. – С.1455–1459.
5. Полянский Н.Г., Горбунов В.Г., Полянская Н.Л. Методы исследования
ионитов. М.: Химия, 1976. 208с.
6.
Власова
Н.Н.
Адсорбция аминокислот
на поверхности
высокодисперсного кремнезема / Н.Н. Власова, Л.П. Головкова // Кололоидный
журнал. – 2004. – Т.66, № 6. – С.733–738.
7. Баличева Т.П. Электронные и колебательные спектры неорганических
и координационных соединений / Т.П. Баличева, С.А. Лобанева. − Л.: Изд.
ЛГУ, 1983. − 117 с.
8. Jackovitz J.F. Infrared Absorption Spectra of Metal-Amino Acid
Complexes. V. The Infrared Spectra and Normal Vibrations of Metal-Leucine
Chelates / J.F. Jackovitz, J.L. Walter // Spectrochim. Acta. − 1996. − V. 22, № 8. − P.
1393− 1396.
136
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА 6-МЕРКАПТО(ГИДРОСЕЛЕНО)-2-ОКСО-5ЦИАНОПИРИДИН-3-КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Доценко В.В.1, Фролов К.А.1, Кривоколыско С.Г.1, Литвинов В.П. 2
e-mail: [email protected]
1
Восточноукраинский национальный университет им. Владимира Даля
2
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Известно, что сама никотиновая кислота (ниацин, витамин РР) и многие
ее производные обладают широким спектром биологической активности –
обьнаруживают
гиполипидемический,
гипохолестеринемический,
нейропротекторный и др. эффекты. Для получения новых производных
меркаптоникотиновой
кислоты
мы
использовали
реакцию
анилинометилиденового
производного
кислоты
Мельдрума
(1)
с
цианотиоацетамидом (2) в сильноосновной среде:
O
NH2
O
S
O
O
NHPh
+
O
O
NH2
1
O
KOH
S
O
N
CN
N
O
2
S
O
O
NH2
O
O
O
O
CN
O
CN
O
O
N
O H
S
HCl
H
O
N
H
S
CN
O
O
N
H
SH
3
6-Меркапто-2-оксо-5-цианопиридин-3-карбоновая кислота образуется с
выходами 60-65% после подкисления реакционной смеси. Кислота 3
алкилируется алкилгалогенидами в присутствии основания селективно по
атому серы. Отмечено, что строение продуктов зависит от строения
акцепторного заместителя в алкилирующем агенте: в случае сильных
акцепторов реакция не останавливается на стадии образования пиридинов 4 и
приводит к продуктам изомеризации по Торпу-Циглеру – тиенопириднам 5.
Соединение 4 (R = аллил) под действием I2 в EtOH при нагревании с высоким
выходом (90%) превращается в дигидротиазоло[3,2-а]пиридин 6. При
окислении соединения 3 в мягких условиях (H2O2, KOH, 20 ºC, 50%-ный EtOH)
получен дисульфид 7.
137
O
O
O
H
O
O
N
H
7
O
S
O
H
R = allyl
CN 1) RBr, KOH, EtOH
O
2) I2, EtOH, t°
R
O
CN
2
O
H
NH3+
CN
HalCH2R
O
N
H
3
SH
S
N
H
5
EtOH, KOH
O
CN
O
O
N
S
H
I
O
6
R
S
N
H
4
Строение соединения 6 доказано методом РСА (рис. 1). Некоторые из
тиенопиридинов 5 были идентифицированы (Bioorg.
Med. Chem. Lett. Vol 17 (2007) 3729–3732) как
умеренно сильные ингибиторы С-терминальной
гидролазы L1 убиквитина (ubiquitin C-terminal
hydrolase-L1
(UCH-L1))
и
таким
образом,
представляют интерес с точки зрения терапии рака и
болезни Паркинсона.
Аналогичным
образом
нами
были
синтезированы
селенсодержащие
аналоги
вышуказзанных
соединений.
Реакцией
енаминодикетона 1 с селеноамидом 8 было получено
6-гидроселеновое производное никотиновой кислоты 9. Реакции кислоты 9 с
алкилгалогенидами подчиняются в целом тем же закономерностям, что и для
серных аналогов – в случае, если R – электроноакцепторный заместитель
(CONH2, CONHAr, C(O)R, CO2Alk, CN etc) – образуются селенофенопиридины
10, тогда как в случае донорных или слабоакцепторных R (Н, алкил, винил,
фенил) образуются продукты алкилирования по атому селена – пиридины 11:
O
O
O
NHPh
O
O
O
O
1
O
+
H
Se
NH2
N
NH3+
R
O
CN
HalCH2R
O
N
H
9
SeH
N
H
Se
10
EtOH, KOH
O
CN
O
8
H
O
N
H
11
138
Se
R
НОВЫЕ МНОГОКОМПОНЕТНЫЕ РЕАКЦИИ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ
ЦИАНОТИОАЦЕТАМИДА: РАЗЛИЧНЫЕ ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ
ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДО[4,3-B][1,3,5]ТИАДИАЗИНА
Доценко В.В.1, Фролов К.А.1, Кривоколыско С.Г.1, Литвинов В.П. 2
e-mail: [email protected]
1
Восточноукраинский национальный университет им. Владимира Даля
2
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Со времен Юстуса Либиха, впервые получившего производное 1,3,5тиадиазина (1848 г.), наблюдается неуклонный рост интереса к данной
гетероциклической системе. В настоящее время химия 1,3,5-тиадиазина
переживает настоящий ренессанс, причины которого во многом связаны с
интересным профилем биологической активности тиадиазинов. Многие из них
обнаруживают заметное антибактериальное, противогрибковое, антивирусное
действие; особое значение 1,3,5-тиадиазины приобрели в агрохимии:
соединения, известные под торговыми марками Бупрофезин и Дазомет (тиазон,
басамид, карботиальдин) активно используются в качестве селективных
инсектицидов в составе многих синергических смесей. Одним из наиболее
удобных и эффективных решений проблемы построения 1,3,5-тиадиазинового
цикла является аминометилирование дитиокарбаматов и родственных
субстратов; конденсированные аналоги легко доступны по двойной реакции
Манниха с 2-меркаптоазолами и -азинами. Продолжая исследования в области
химии цианотиоацетамида, мы обнаружили ряд простых способов (А-D)
получения производных ранее неизвестной гетероциклической системы,
пиримидо[4,3-b][1,3,5]тиадиазина 1 [1, 2].
Способ А основан на аминометилировании -цианотиоакриламидов 2
первичными аминами и НСНО. Данный метод дает стабильные результаты,
однако его применение ограничено набором непредельных тиоамидов 2.
Более удобным представляется способ В, предусматривающий
образование тиоакриламида in situ из альдегида и цианотиоацетамида, и
позволяющий достичь более высоких выходов. Следует особо отметить
преимущества метода В – так, акрилтиоамиды 2 с R = H или алкил в литературе
до сих пор не описаны ввиду препаративных трудностей получения и
склонности к димеризации и самоконденсации, потому соединения 1 с
алкильными заместителями в положении С(8) не могут быть получены по
методу А. Мы установили, что алифатические альдегиды (акваналь, пропаналь,
октаналь, изобутираль и др.) вступают в эту реакцию, однако выходы целевых
продуктов 1 невелики и, как правило, не превышают 50%.
Нетривиальным является метод С, основанный на рециклизации 4Нтиопиранов 3 в условиях реакции Манниха. Предполагаемый каскадный
механизм включает стадию N-аминометилирования тиоакриламида с
образованием интермедиата 4 и последующим приращением пергидро-1,3,5тиадиазинового цикла. Наконец, способ D – основан на рециклизации
139
тетрагидропиридин-2-тиолатов 5-7. Будучи стабильными аддуктами Михаэля,
получаемыми обработкой тиоакриламидов типа 2 1,3-дикарбонильными
соединениями, они способны как к дальнейшей дегидратации, так и к реакции
ретро-Михаэля.
Именно
последний
сценарий
реализуется
при
аминометилировании тиолатов 5-7 – вместо ожидаемых производных
биспидина или пиридо[1,2-a][1,3,5]тиадиазина получены пиримидо[4,3b][1,3,5]тиадиазины 1. Способ D не имеет препаративной ценности, поскольку
выходы целевых продуктов низки и колеблются в диапазоне 5-28%. В
настоящее время изучается профиль биологического действия полученных
пиримидо[4,3-b][1,3,5]тиадиазинов 1.
NH2
S
ArCHO
+
Et3N
B
EtOH, t°
RNH2
R
N
30-70%
S
N
R
R
H2N
S
R2NH2
+
N
- H2C(CN)2
2
+ H2C(CN)2
O
R
RNH2,
HCHO
Ar
N
N
1
Ar
CN
N
NH
- H2O
4
HCHO
N
H
NH2
R2
R = R1 = CH3
O
CH3
1
1 R = H, R =
R
R = H, R1 = Et
R = H, R1 = n-C7H15
R
H
Ar
R
N RNH2,
HCHO
N
S
O
N
H
- 2H2O
SH
CN
1
5 R1 = EtO
Ph
6 R1 = Ph
HO
O
S
H2N
S
R
RNH2
+
3
morpholine R
N
EtOH, t°
HCHO
3
+
10-60%
B
R
20-65%
2
CHO
N
H2N
S
one of R = H, other Ar;
2
C
or R+R = (CH2)5
Ar
N
N
RNH2
1
R
CN
EtOH, t°
5-40%
HCHO
R
A
EtOH, t°
R
1
HCHO
R
N
N
H
N
H
B = N-methylmorpholine
RNH2
HCHO
CN
Ar
Ar
H
CN
Ph
H 3C
HO
S
BH+
N
H
7
Ar = 2-ClC6H4;
B= piperidine
S
BH+
R
S
N
N
N
1
R
R = Ar, CH2Ph
[1] V. V. Dotsenko, K. A. Frolov, S. G. Krivokolysko, A. N. Chernega, and V. P.
Litvinov // Monatshefte fur Chemie, Vol. 137, No. 8, pp. 1089–1098 (2006)
[2] В. В. Доценко, С. Г. Кривоколыско, В. П. Литвинов. // Известия РАН,
Сер. Хим., №7, стр. 1420-1422 (2007)
140
1
АНАЛИЗ ПОДЛИННОСТИ И ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ
СВОЙСТВ СЫРЬЯ ТРАВЫ ХВОЩА ПОЛЕВОГО
(HERBA EGUISETI ARVENSIS)
Дурнова Н.А., Школина А.Н.
Саратовский государственный медицинский университет
им. В.И.Разумовского
Хвощ полевой (Equisetum arvense L., сем. Equisetaceae) — официнальное
лекарственное
растение,
используемое
в
качестве
мочегонного,
кровоостанавливающего и противовоспалительного средства. Однако
основным его фармакологическим свойством до настоящего времени считается
диуретическая активность. В последнее время ведется активный поиск его
новых фармакологических свойств, например, доказана гепатопротекторная и
антимутагенная активность (Коломиец и др., 2006).
Для использования в медицине из видов семейства Equisetaceae
разрешена заготовка только хвоща полевого. Другие виды рассматриваются в
качестве возможных фальсификатов (Коломиец и др., 2007), т.к. могут быть
ошибочно заготовлены в качестве ЛРС из-за схожих морфологических
признаков. Поэтому их
идентификация по морфологическим и
микроскопическим признакам затруднена. Поскольку некоторые виды имеют
совмещенные ареалы и местообитание, фальсификация травы хвоща полевого
может возникнуть на этапе заготовки, когда ошибочно собирают хвощ
болотный, лесной, луговой, приречный. Проведенные исследования по
определению подлинности аптечного сырья хвоща полевого (Коломиец, 2006)
показали, что далеко не все образцы соответствуют требованиям ГОСТ.
Задачами настоящей работы явились: установление подлинности
образцов сырья травы хвоща полевого(Herba Eguiseti arvensis), представленных
на фармацевтическом рынке; исследование антимикробной активности водного
экстракта.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для выявления возможных фактов фальсификации сырья хвоща полевого
было проанализировано 9 образцов промышленных партий сырья травы хвоща
полевого: «Хвоща полевого трава» пак. 50 г следующих фирм-производителей:
ЗАО «Здоровье» серии 010209, «Фито-ЭМ» серии 060208, ООО «ЛекС+» серии
011208, ЗАО «Иван-чай» серии 022013, Микроген НПО серии 010409,
«Фитофарм» серии 031108; Хвоща полевого трава пак.-фильтр 1,5 г №20 ОАО
«Красногорсклексредства» серии 30609; «Арфазетин сбор» пак. ООО «ЛекС+»
серии
010508;
«Арфазетин
сбор»,
пак.-фильтры
ОАО
«Красногорсклексредства» серии 50709.Сырье приобреталось в аптеках
различных аптечных сетей г. Саратова. Определение подлинности сырья
проводилось путем внешнего осмотра и методом микроскопии согласно ГФ XI
статьи 50 «Трава Хвоща полевого». Важнейшими диагностическими
признаками хвоща полевого при микроскопическом анализе являются
141
парацитные, слегка погруженные устьица с характерной складчатостью
кутикулы, расположены обычно в 3 ряда, реже в 4, 2 или 1.
Антимикробную активность настоя травы хвоща полевого изучали
методом серийных разведений в отношении стандартных штаммов S. aureus
АТСС 29213, P. aerugenosa АТСС 27853, E. coli M-17. Штаммы
предоставленны кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии СГМУ
им. Разумовского. В каждой серии было 4 опытных и 1 контрольный посев.
Настой травы хвоща полевого готовили по стандартной методике. Для
приготовления инокулята суточные культуры исследуемых штаммов
суспензировали
в
стерильном
физиологическом
растворе,
доводя
5
концентрацию до 2*10 КОЕ/мл. Два мл полученной взвеси вносили в каждый
серийный раствор, содержащий МПБ и водный экстракт хвоща полевого в
отношении 1:1, 1:2, 1:4, 1:16. Посевы инкубировались в термостате при t=37°С
в течении суток. Результаты учитывали путем визуального контроля задержки
роста микроорганизмов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований подлинности сырья
установлено, что образцы трех фирм-производителей не соответствуют
заявленному качеству: в образце «Хвоща полевого трава» пак. 50 г фирмы ООО
«ЛекС+» обнаружены элементы хвоща полевого и болотного, в образце фирмы
«Фито-ЭМ» – элементы хвоща болотного и зимующего, в образце фирмы
«Микроген НПО» – хвощ болотный, который, как известно, считается
ядовитым.
В ходе проведенного микробиологического исследования было
установлено, что водный экстракт травы хвоща полевого не проявляет
антимикробную активность в отношении данных штаммов.
Анализ серийных образцов ЛРС «Трава хвоща полевого», реализуемых в
г.Саратове показал, что из 9 образцов 3 не соответствуют требованиям
нормативной документации по подлинности сырья. В результате проведенного
микробиологического исследования антимикробная активность водного
экстракта травы хвоща полевого в отношении тест-штаммов кишечной
палочки, синегнойной палочки и стафилококка не выявлена.
Литература
1. Коломиец Н.Э., Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е., Зиновьева А.М.
Проблема фальсификации сырья хвоща полевого // Фармация. 2006., №2 С. 3742
2. Коломиец Н. Э., Сапронова Н. Н., Калинкина Г. И., Дмитрук С. Е.
Анатомическое строение растений рода хвощ // Фармация. 2006. № 1. С.19-21.
3. Коломиец Н. Э., Калинкина Г. И. Вопросы стандартизации травы
хвоща полевого // Фармация. 2007. № 1. С.11-14.
4. Коломиец Н. Э., Калинкина Г. И. Определение кремния в хвощах //
Фармация: Научно-практический журнал. 2009. № 3. С.13-15.
142
ЭКСТРАКЦИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫМИ ПОЛИМЕРАМИ
ВИТАМИНОВ – АКТИВАТОРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО
МЕТАБОЛИЗМА
Ерина О.В., Хохлов В.Ю., Селеменев В.Ф., Шаталов Г.В.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Водорастворимые витамины являются одними из важнейших
биологически активных веществ, играющих ключевую роль в процессах
окислительного
метаболизма.
Они
незаменимы
для
нормального
функционирования организма и находят все более широкое применение при
производстве новых лекарств и пищевых добавок.
Разделение смесей биологически активных веществ и селективное
определение индивидуальных компонентов является приоритетной задачей
аналитической химии, для решения которой широко применяются
хроматография, электрофорез, экстракция. К настоящему времени разработаны
многочисленные способы экстракционного разделения и концентрирования
биологически активных веществ – аминокислот, некоторых витаминов с
применением в качестве экстрагентов спиртов, алкилацетатов, кетонов и других
органических растворителей. Однако, данные экстрагенты обладают
значительной токсичностью, что делает необходимым введение стадии
реэкстракции или иного способа выделения извлекаемого компонента из
органической фазы.
Применение водорастворимых полимеров, обладающих
малой
токсичностью является одним из перспективных направлений жидкостной
экстракции.
Приведены результаты исследования экстракции рутина, фолиевой
кислоты, аскорбиновой кислоты и никотиновой кислоты водорастворимыми
полимерами из водных растворов, насыщенных различными солями с целью
подбора эффективных и экологически чистые систем для извлечения
витаминов.
Проведено экстракционное извлечение рутина, фолиевой кислоты,
аскорбиновой кислоты и никотиновой кислоты из водно-солевых растворов с
помощью водных растворов полимеров при различных рН и соотношении фаз.
Коэффициенты распределения (D) и степени извлечения (R) аскорбиновой и
никотиновой кислот в системах с поли-N-винилпирролидоном (ПВП)
приведены в табл. 1 и 2.
143
Таблица 1.
Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R)
аскорбиновой кислоты поли-N-винилпирролидоном при различных рН
Высаливатель
(нас. р-р)
(NH4)2SO4
Na2SO3
(NH4)2SO3
pH
1,5
5,8
11,4
1,5
5,4
11,4
1,3
5,7
11,3
Соотношение фаз
10:1
D
R,%
0,03
21
0,08
65
0,05
25
1,27
48
6,60
91
12,25
88
0,77
48
2,49
75
1,94
70
Соотношение
фаз 5:1
D
R,%
0,01
25
0,28
69
0,07
28
1,00
50
8,26
92
8,22
88
0,82
49
9,80
98
2,47
75
Таблица 2.
Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R)
никотиновой кислоты поли-N-винилпирролидоном при различных рН
Высаливатель
(нас. р-р)
(NH4)2SO4
Na2SO3
(NH4)2SO3
pH
1,4
6,7
11,6
1,4
6,7
11,5
1,3
6,5
11,2
Соотношение
фаз 10:1
D
R,%
0,77
58
4,83
88
5,70
83
0,40
50
10,83
95
0,35
92
0,03
25
2,09
95
0,17
70
Соотношение
фаз 5:1
D
R,%
0,15
18
17,75
96
12,00
95
0,14
34
9,80
90
0,19
39
0,09
52
20,90
98
0,31
78
Результаты экстракционного извлечения рутина поли-N-винил-Nметилацетамидом (ПВКЛ) приведены в табл. 3. Результаты экстракционного
извлечения фолиевой кислоты поли-N-винил-N-метилацетамидом (ПВМА)
приведены в табл. 4.
144
Таблица 3
Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R) рутина
поли-N-винилкапролактамом при различных рН
Высаливатель
(нас. р-р)
(NH4)2SO4
Na2SO3
(NH4)2SO3
pH
2,0
6,6
11
2,0
7,6
9,5
2,0
6,6
9,5
Соотношение
фаз 10:1
D
R,%
0,14
23
0,29
38
0,20
35
0,02
3
0,05
10
0,03
5
0,38
50
3,38
90
1,61
88
Соотношение
фаз 5:1
D
R,%
0,26
30
0,43
42
0,31
38
0,05
10
0,15
20
0,15
20
0,75
59
3,8
95
2,47
93
Таблица 4.
Коэффициенты распределения (D) и степень извлечения (R)
фолиевой кислоты поли-N-винил-N-метилацетамидом при различных рН
Высаливатель
(нас. р-р)
(NH4)2SO4
Na2SO3
(NH4)2SO3
pH
1,4
6,2
11,5
1,7
6,8
11,3
1,3
5,9
11,3
Соотношение
фаз 10:1
D
R,%
0,57
47
1,1
70
0,63
50
0,28
33
0,82
45
0,29
38
0,95
60
1,13
76
1,05
62
Соотношение
фаз 5:1
D
R,%
0,7
66
2,38
79
1,00
71
0,5
53
0,91
67
0,68
61
1,5
75
3,20
82
1,87
77
Максимальные степени извлечения наблюдаются, в интервале рН 5,8 –
7,5 при соотношении фаз 5:1 и применении в качестве высаливателя
насыщенного раствора (NH4)2SO3. Для никотиновой и аскорбиновой кислот
максимальная степень извлечения (R=98 %) достигается при экстракции ПВП.
Максимальная степень извлечения рутина водным раствором ПВКЛ составляет
95 %, а фолиевой кислоты раствором ПВМА составляет 82 %.
Таким образом, применение в качестве экстрагентов экологически
безопасных водорастворимых полимеров, позволяет достичь более высоких
степеней извлечения витаминов по сравнению с достаточно токсичными
145
органическими растворителями. Экстракционные системы на основе
водорастворимых полимеров поли-N-виниламидного ряда могут быть
рекомендованы для селективного извлечения водорастворимых витаминов из
водных растворов фармацевтической, пищевой и микробиологической
промышленности.
146
РЕАКЦИИ ЦИКЛОПРИСОЕДИНЕНИЯ В РЯДУ СТЕРОИДОВ В
УСЛОВИЯХ ВЫСОКИХ ДАВЛЕНИЙ
Заварзин И.В., Седишев И.П., Аксенов А.Н., Жаров А.А.
e-mail: [email protected]
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Стероиды – обширный класс веществ, широко распространенных в
природе, обладающих тетрациклическим углеродным скелетом. В зависимости
от строения (сочетания функциональных групп и боковых цепей) стероиды
проявляют различные физиологические свойства и широко используются в
терапии. Химическая модификация природных продуктов позволяет получать
соединения с самым широким спектром биологической активности. Одно из
таких
направлений
трансформации
обеспечивают
реакции
циклоприсоединения. Проблема их применения в ряду природных стероидов
состоит в том, что чаще всего, функции не позволяют получить продукты с
удовлетворительными выходами. Именно поэтому нами было использовано
высокое давление (ВД). ВД является мощным инструментом ускорения
органических реакций и часто обеспечивает проведение процессов, которые
практически невозможны при обычном давлении. Перспективность
использования ВД в реакциях циклоприсоединения, как согласованном
процессе, в самом приближенном виде можно пояснить, исходя из принципа
Ле-Шателье. Система за счет образования новых связей и уменьшения числа
молекул будет компенсировать внешнее давление, т.о. процесс будет
смещаться в сторону образования продуктов.
В качестве доступного стероида нами был использован ацетат 16дегидропрегненолона (I), содержащий активированную карбонильной группой
двойную связь в 16 положении (кольцо D). Реакции 1,3-диполярного
циклоприсоединения проводили с органическими азидами (IIa-с). Получены
триазолиновые производные (IIIа-с) с удовлетворительными выходами при
давлениях 10-15 кбар. Следует отметить, что проведение реакции в запаянной
ампуле между стероидом (I) и азидами (IIa-с) выше 100о С даже в течение 50 ч
давало лишь следовые количества продукта. Кроме того, высокая температура в
этих условиях способствовала разложению азида, что приводило к взрыву
части ампул. Синтез в условиях высокого давления проводили на установке
типа «поршень-цилиндр», реакционную смесь загружали в тефлоновую ампулу,
которую помещали в металлический реактор. Давление в реакторе создавали
прессом, обогрев обеспечивала электропечь.
Гетеродиеновая система в стероиде (I) включает связь С=О, поэтому для
нее характерно обращенное по полярности взаимодействие (НСМО диена с
ВЗМО диенофила). Наиболее перспективными диенофилами в этом случае
могут быть непредельные системы с донорными заместителями. Однако,
виниловые эфиры и енамины (IVa-d) также дают следовые количества
продукта [4+2] циклоприсоединения со стероидом (I) при атмосферном
147
давлении. Лишь применение ВД позволяет получить целевые продукты (Va-d)с
удовлетворительными выходами.
O
I
AcO
X
a R= SiMe3 ; b R= CH2COOEt ;
IIa-c
10-15 kbar
c R= CH2Ph
O
N
Y
RN3,
a X= EtO , Y=Z=H ;
b X= BuO , Y=Z=H ;
c
z
IVa-d X=
d
Y=Z=(CH2)3
N
Y=Z=(CH2)4
N
O
X
Y
N
R
z
IIIa-c
AcO
AcO
45-76 %
38-69 %
Va-d
Таким
образом,
ВД
успешно
применено
для
реакций
циклоприсоединения в ряду стероидов. Следует подчеркнуть, что перспективой
развития данного направления может служить как использование других
диполярных реагентов и диенофилов для изученного ацетата 16дегидропрегненолона, так и дальнейшее распространение этой реакции в
стероидах с подходящей структурой или целенаправленно модифицированных.
148
ТРЕХКОМПОНЕНТНЫЙ СИНТЕЗ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ИМИДАЗО[1,2-b]ПИРАЗОЛОВ – ПОТЕНЦИАЛЬНО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Замигайло Л.Л., Колос Н.Н. e-mail: [email protected]
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина
Высокая физиологическая активность производных барбитуровой
кислоты общеизвестна. Барбитураты используются как снотворные, препараты
гипнотического и седативного действия; анестетики кратковременного и
пролонгированного действия в зависимости от заместителей, в первую очередь,
в положении 2 гетероцикла.
Известно, что барбитуровые кислоты выступают типичными
гетероциклическими СН-кислотами (рКа ~ 4) и легко образуют 5арилиденпроизводные в реакциях с ароматическими альдегидами.1,2 Ранее нами
была
проведена
конденсация
Кневенагеля
при
участии
1,3диметилбарбитуровой кислоты (1) и арилглиоксалей (2a–g) с образованием
соответствующих фенацилиденпроизводных 3.3 Соединения 3 отноосятся к
поляризованым олефинам, виниленовая связь которых находится под влиянием
двух
электроноакцепторных
фрагментов:
карбонильной
группы
экзоциклического фрагмента и амидных групп пиримидинтриона, что создает
интригу при исследовании направленности их взаимодействия с
бинуклеофилами.
Химические сдвиги в спектрах ЯМР 13С атомов экзоциклического
енонового фрагмента енонов 3a–c
Сα
Сβ
С=О
151.9
151.9
151.9
125.3
125.2
125.3
194.6
194.4
194.8
Кетоны 3 оказались удобными синтетическими эквивалентами в синтезе
спиропиримидинов, производных тиазола и имидазолинтиолов. Эти продукты
были получены и однореакторной трикомпонентной конденсацией 1,3диметилбарбитуровой кислоты, арилглиоксалей и (тио)мочевин.
Целью
нашего
исследования
стало
изучение
продуктов
трехкомпонентной конденсации на основе 1,3-ДМБК, арилглиоксалей и 5амино-4-N-арилкарбоксамидов,
которую
проводили
при
кипячении
эквивалентных количеств исходных реагентов в этаноле в течение 1-1.5 ч.
149
Строение синтезированных соединений (4a-d) было подтверджено
классическими физико-химическими методами (данные 1H, 13С ЯМР и ИК
спектры), состав установлен на основе элементного анализа. Так, в спектрах
1
H ЯМР в области слабого поля присутствуют три синглета с химическими
сдвигами ~ 8.2, 9.5 м.д., а также 12.5 м.д. Два последних сигнала подвергаются
дейтерообмену при добавлении D2O. Это позволяет их идентифицировать как
сигналы NH-амидной группы (9.5 м.д.) и енольной OH-группы (12.5 м.д.).4
Сигнал при 8 м.д. был отнесен к СH-протону в положении 3-пиразольного
цикла. Необходимо заметить, что в спектре ЯМР 1H отсутствует сигнал NHпротона имидазольного цикла, который обменивается с молекулами воды,
присутствующей в дейтерорастворителе – ДМСО-d6. Следовательно, это
свидетельствует об образовании 3-(6-гидрокси-1,3-диметил-2,4-диоксо-1,2,3,4тетрагидропиримидин-5-ил)-N-2-диарил-1H-имидазо[1,2-b]пиразол-7-карбоксамидов. Соединие 4d было получено нами и через стадию соответствующего
фенацилиденпроизводного с з 5-аминопиразол-4-N-(п-этоксифенил)-карбоксамидом в аналогичных экспериментальных условиях с выходом, близким к
выходу ‖one-pot‖ синтеза.
Таким образом, нами было подтверждено прохождение реакции через
стадию фенацилиденпроизводного типа 5. Его взаимодействие с амидами (3)
проходит, скорее всего, через образование имина А.
150
Но также нельзя не учитывать и альтернативный путь взаимодействия,
который состоит в присоединении 5-аминогруппы по экзоциклической двойной
святи с последующей конденсацией карбонильной и аминогрупп в положении 1
пиразольного цикла, что приводит к региоизомерному продукту – 2-(6гидрокси-1,3-диметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-N-3диарил-1H-имидазо[1,2-b]пиразол-7-карбоксамиду. Однозначно установить
структуру синтезированных продуктов можно при проведении РСА.
Данные, полученные при помощи программы PASS5 4 показывают, что
приведенный ряд может быть перспективным для проверки на
противоопухолевую активность мозга (Antineoplastic (brain cancer)), также
могут проявлять сосудорасширяющий эффект в области почек (Vasodilator
renal). По данным компьютерного прогноза полученные нами соединения
являются ингибиторами RET – фактора переноса посторонней ДНК внутрь
клетки, т.е. могут блокировать развитие рака, а также как
иммуномодулирующие препараты (Cytokine modulator). Что касается
неоднозначных эффектов, то они связаны с ингибирующим и активирующим
воздействиями на ферменты, задействованные в энергообеспечении и
транспорте клетки: CDK9/cyclin T1 inhibitor и CIP2C19 Inducer.
Таким образом, результаты виртуального скрининга свидетельствует о
перспективности синтезированных производных имидазо[1,2-b]пиразола (4)
для углубленного изучения их биологической активности.
Литература
1. Егорова А.Ю. Синтез арилиденовых производных 1-арил-3Н-пиррол-2онов / А.Ю. Егорова, В.В. Нестерова. // ХГС. – 2004. – № 8. – С. 1163–1168.
2. One pot synthesis of Monoalkylated and mixed, dialkylated Meldrum’s acid
derivatives / U.V. Desai, D.M. Pore, R.B. Mane [et al.] // Synthetic communications.
– 2004. – Vol. 34. – No 1. – P. 25–32.
151
3. A rapid and facile synthesis of new spiropyrimidines from 5-(2arylethylidene-2-oxo)-1,3-dimethylpyrimidine-2,4,6-triones / L.L. Gozalishvili,
T.V. Beryozkina, I.V. Omelchenko, R.I. Zubatyuk, O.V. Shishkin and N.N. Kolos. //
Tetrahedron. – 2008. – Vol. 64. – P. 8759–8765.
4. Воловенко Ю.М. Ядерний магнітний резонанс / Ю.М. Воловенко,
О.В. Туров. – К.: Ірпінь, 2007. – 480 c.
5. Бородина Ю.В. / Предсказание активности пролекарств с помощью
компьютерной системы PASS // Хим. фарм. журн. – 1996. – Т. 30. – № 12. – С.
39–42.
152
ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСНОГО
ФИТОПРЕПАРАТА ПРОСТАНОРМ МЕТОДОМ ВЭЖХ
Захарова Н.Г., Белобородов В.Л., Савватеев А.М., Колхир В.К.,
Воскобойникова И.В. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
ЗАО «ФПК ФармВИЛАР»
Простанорм — оригинальное отечественное средство лечения
хронического простатита [1]. Простанорм — комбинированный фитопрепарат,
получаемый из смеси лекарственного растительного сырья - травы зверобоя
(ГФ ХI, вып. 2,ст. 52) травы золотарника канадского (ФС 42-2777-91), корня
солодки (ГФ Х, ст. 573), корневищ с корнями эхинацеи пурпурной (ТУ 64-4122-95) в равных соотношениях в виде водно-спиртового извлечения, а также
сухого экстракта. Простанорм выпускается в двух лекарственных формах:
экстракт жидкий для приема внутрь и таблетки по 0,2 г, (разработка и
производство ЗАО «ФПК ФармВИЛАР»).
Многокомпонентность состава комбинированного препарата, наличие
комплекса биологически активных веществ различной химической природы
обусловливает сложность его анализа и стандартизации. Существующие
методы стандартизации препарата Простанорм включают качественные
реакции на фенольные соединения, метод ТСХ с характеристикой цвета зон
адсорбции для каждого вида лекарственного сырья и спектрофотометрическое
определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин и не включают анализ
индивидуальных соединений.
Цель исследования: разработка селективной методики анализа
компонентов препарата Простанорм методом ВЭЖХ и их идентификация.
Материалы и методы: объекты исследования – Простанорм экстракт
жидкий (НПО «Вирион» г. Томск), стандартные образцы флавоноидов,
фенолокислот и других соединений, ацетонитрил и метанол «для ВЭЖХ»,
уксусная и фосфорная кислоты «осч», дистиллированная и деионизованная
вода. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Cary 100 (Varian).
Хроматографический анализ осуществляли на жидкостном хроматографе
Prostar 230 с УФ-детектором Prostar 325 (Varian).
Результаты и обсуждение: Водно-спиртовые экстракты (70% этанол)
указанных выше четырех составных частей растительного сырья
предопределяют
многокомпонентность состава препарата Простанорм и
сложность его анализа. Метод ВЭЖХ применялся для анализа и
стандартизации экстрактов эхинацеи [2], солодки [3], зверобоя [4].
Компоненты, определенные в данных исследованиях, а также других
литературных источниках, использовались нами в качестве «свидетелей» при
установлении состава фитопрепарата. При разработке универсальной
хроматографической
методики
определения
компонентов
препарата
использовали
два
типа
сорбентов
—
октадецилсилановые
и
153
цианопропилсилановые как в изократических, так и градиентных режимах
элюирования. Спектрофотометрический анализ «свидетелей» показал, что
большинство из них имеют полосы поглощения или «плечо» в области 240-270
нм и 310-330 нм, что предопределило выбор аналитических длин волн 255 и
320 нм. Использование различных вариантов пробоподготовки экстракта
Простанорма для анализа, включающих жидкостную экстракцию неполярными
и полярными растворителями и твердофазную экстракцию на различных по
природе сорбентах в градиентных условиях элюирования, показало что ни
одним из способов не удается извлечь и фракционировать всю сумму
компонентов фитопрепарата. Поэтому для хроматографического анализа
использовали непосредственно жидкий экстракт Простанорма, который
разбавляли в 50 раз 50% этанолом и вводили в хроматограф.
Выбор подвижной фазы осуществляли в условиях обращенно-фазового
варианта по нескольким направлениям — выбор органического компонента,
кислотного
модификатора,
условий
градиентного
элюирования.
Удовлетворительные хроматографические условия были достигнуты на
октадецилсилановом сорбенте при использовании подвижной фазы А - CH3CN,
В - 0,1% H3PO4 с градиентным повышением доли ацетонитрила от 5% до 95%
за 45 минут. Вместе с тем критерий разделения некоторых пиков оказался не
оптимальным. Оптимизация хроматографических условий достигнута
некоторой модификацией подвижной фазы, а именно, введением в
первоначальный момент в состав подвижной фазы дополнительно 5% метанола
и использованием фосфатного буфера (0,1% H3PO4 и 0,02 М KH2PO4, рН 3).
Применение буферного раствора с данной кислотностью среды позволяет
подавить диссоциацию фенольных и карбоксильных групп исследуемых
объектов, что приводит к улучшению формы пиков и разрешающей
способности.
На хроматограммах образцов экстрактов препарата Простанорм
наблюдается 92 пика, большинство из которых характеризуется низкой
интенсивностью.
Для идентификации компонентов фитопрепарата применили следующий
подход. Использовали и те и другие указанные выше хроматографические
условия. В образцы экстракта Простанорма вводили внутренний стандарт —
ванилин. Во-первых, это позволило использовать относительные времена
удерживания (tRx/tRстандарт), которые менее подвержены изменениям при
переходе от одной к другой разгонке. Во-вторых, современные способы
детектирования (диодно-матричный детектор или детекторы, позволяющие
проводить одновременный анализ на двух и более аналитических длинах волн в
процессе хроматографической разгонки) позволяют дополнительно применить
для идентификации такой критерий как спектральное отношение. В нашем
случае спектральное отношение определяли для каждого из свидетелей в одних
и тех же хроматографических условиях как отношение оптических плотностей
А250/А320. Результаты хроматографического анализа представлены в табл.1.
154
Таблица 1
Идентификация компонентов препарата Простанорм экстракт жидкий
1
Относительное
время удерживания
tRx/tRст.
0,2063
Спектральное
отношение
А250/А320
1,54
2
0,532
13,43
3
4
5
6
7
8
9
10
0,373
0,764
0,825
0,876
0,905
0,926
1,0745
1,0525
0,657
0,351
0,778
0,372
0,3707
0,3677
0,532
0,9035
11
1,376
0,805
12
13
14
15
16
1,4478
1,481
1,738
1,845
1,87
0,742
2,445
44,5
0,687
3,52
2,153
нет полосы
поглощения при 320
нм
№
пика
17
Идентификация пика
аскорбиновая кислота
3,4-дигидроксибензойная
кислота
хлорогеновая кислота
кофейная кислота
Гиперицин
Гиперозид
Рутин
ликвиритин
транс-феруловая кислота
нарингенин-5-гликозид
2-гидроксикоричная
кислота
Ликуразид
Кверцетин
коричная кислота
нарингенин
Кемпферол
Глицирам
Выводы: Разработана методика идентификации и анализа компонентов
фитопрепарата
Простанорм
с
использованием
обращенно-фазового
градиентного
варианта
метода
ВЭЖХ.Идентифицирован
комплекс
биологически активных веществ, входящих в состав фитопрепарата.
Литература
1. С.А. Вичканова, В.К. Колхир, Т.А. Сокольская и др. Лекарственные средства
из растений (опыт ВИЛАР). – М.: АДРИС, 2009. // Простанорм, средство лечения
хронического простатита. – С. 220-239.
2. В.Л. Багирова, Е.Б. Нечаева, А.С. Осипов и др. Применение современных
методов анализа для стандартизации лекарственных препаратов эхинацеи //
Матер. VIII Междунар. Съезда «Актуальные проблемы создания новых лек.
преп. природн. происхождения» ФИТОФАРМ Миккели, - 2004. - С. 221-229.
3. Г.Г. Запесочная, В.А. Быков. Комплексная технология переработки солодки
GLYCYRRHIZA L. // Труды ВИЛАР. М.: - 2000. - С. 135-144.
4. А.М. Власов, К.И. Эллер, Е.В. Чукарина и др. Индикаторные компоненты
водных извлечений травы зверобоя. // Фармация. - 2006. - №4. - С41-43.
155
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА Β-N-ЗАМЕЩЕННЫХ
АЛКИЛАЦИЛГИДРАЗИДОВ 4-АРИЛ-2-ГИДРОКСИ-4-ОКСО-2БУТЕНОВЫХ (АРОИЛПИРОВИНОГРАДНЫХ) КИСЛОТ
Зверева О.В., Милютин А.В., Мосова У.В.
Пермская государственная фармацевтическая академия
Ранее было показано, что β-N-ацилзамещенные гидразиды 4-арил-2,4диоксобутановых кислот (ароилпировиноградных кислот - АПВК) проявляют
анальгетическое,
противосудорожное,
противовоспалительное
и
противомикробное действие при достаточно низкой токсичности [1,2,3]. К
настоящему времени разработан удобный препаративный метод синтеза
гидразидов АПВК [3], который может быть использован для получения β-Nзамещенных алкил-, гетерил- и арилгидразидов АПВК.
В продолжение исследований в области β-N-замещенных гидразидов
АПВК нами были синтезированы алкилацилгидразиды АПВК. Синтез
соединений осуществлен дециклизацией 5-арил-2,3-дигидрофуран-2,3-дионов
при действии на них алкилгидразидов в среде абсолютного диоксана.
O
O
+
R
O
O
NH2NH C
R1
NHNHCOR1
R
O
O
H
O
R = H (Iа-д), 4-CH3 (IIа-в),4-OC2H5 (IIIа,б), 4-Cl (IVа-г), 4-Br (Vа);
R1 = (CH2)3CH3 (Iа, IIа), CH2CH(CH3)2 (IIб, IVа, Vа), (CH2)6CH3 (Iб, IVб),
CCl3 (Iв, IVв), CBr3 (Iг, IIв, IIIа), (CH2)3Cl (Iд, IIIб, IVг)
Соединения I-V белые или белые с желтоватым оттенком
кристаллические вещества, не растворимые в воде, трудно растворимые в
хлороформе, бензоле, растворимые при нагревании в этаноле, диоксане,
ДМФА, ДМСО. Подобно другим производным ароилпировиноградных кислот
полученные соединения дают красное окрашивание со спиртовым раствором
хлорида трехвалентного железа, что свидетельствует о наличии енольного
гидроксила [4].
Структура полученных соединений подтверждена данными ПМР- и ИКспектроскопии. В ПМР-спектрах, снятых в ДМСО-d6, присутствуют все
сигналы протонсодержащих фрагментов молекул в ожидаемых областях.
Так сигналы протонов ароматических колец наблюдаются в области от
7,3 до 8,2 м.д., сигналы аминогрупп в области от 9,1 до 9,7 м.д. и в области от
10,8 до 10,85 м.д. Наличие в спектре синглета метинового протона в области от
7,0 до 7,1 м.д., говорит об енолизации соединений [4].
В ИК-спектрах соединений присутствуют полосы поглощения,
обусловленные валентными колебаниями NH- гидразидных групп в области
156
3220-3410 см-1 и в области 3690 см-1. также в спектре присутствуют полосы
поглощения гидразидных карбонилов в области 1650-1700 см-1 и γ-кетонного
карбонила в области 1590-1620 см-1. Понижение частоты колебаний γкетонного карбонила по сравнению с колебаниями карбонила в обычных β,βдикетонах свидетельствует о вовлечении его во внутримолекулярную
водородную связь Н-хелатного типа.
Полученные алкилацилгидразиды АПВК представляют интерес как
потенциально биологически активные вещества для изучения их
противовоспалительной, противосудорожной и антимикробной активности, а
также могут быть использованы для получения соответствующих
аминопроизводных.
№
R
R’
Tпл., С
129-131
Выход,
%
78
Брутто
формула
C15H18N2O4
Iа
H
-(CH2)3-CH3
Iб
H
-(CH2)6-CH3
121-123
82
C18H23N2O4
Iв
H
CCl3
175-177
76
С12H9N2O4Cl3
Iг
H
CBr3
121-122
84
С12H9N2O4Br3
Iд
H
(CH2)3Cl
132-134
82
С14H15N2O4Cl
IIа
4-CH3
-(CH2)3-CH3
135-137
82
C16H20N2O4
IIб
4-CH3
-CH2-CH-(CH3)2
121-123
84
C16H20N2O4
IIв
IIIа
IIIб
IVа
IVб
IVв
IVг
Vа
4-CH3
4-C2H5O
4-C2H5O
4-Cl
4-Cl
4-Cl
4-Cl
4-Br
CBr3
CBr3
(CH2)3Cl
-CH2-CH-(CH3)2
-(CH2)6-CH3
CCl3
(CH2)3Cl
-CH2-CH-(CH3)2
119-120
128-129
124-125
128-130
120-122
166-168
160-162
158-160
71
78
81
81
79
75
87
85
С13H11N2O4Br3
С14H13N2O5Br3
С16H19N2O5Cl
C15H17N2O4Cl
C18H22N2O4Cl
С12H8N2O4Cl4
С14H14N2O4Cl2
C15H17N2O4Br
Экспериментальная часть. ИК спектры синтезированных соединений
записаны на спектрометре UR-20 (Германия) в виде пасты в вазелиновом масле.
Спектры ПМР сняты на спектрометре ВS-567 А (рабочая частота 100 Мгц).
β-N-трихлорацетил гидразид 4-бензоил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновой
кислоты (Iв). К теплому раствору 0,005 моль (0,87 г) 5-фенил-2,3дигидрофуран-2,3-диона в 30 мл абсолютного диоксана приливают теплый
раствор 0,005 моль (0,88 г) гидразида трихлоруксусной кислоты. Выпавший
при охлаждении осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси
ацетонитрил – вода 2:1. Выход 76%. tпл. = 175-177 °С. ИК-спектр, νmax, см -1:
157
3400, 3690 (NH); 1660, 1740 (CONH); 1590 (γC=O). ПМР-спектр, δ, м.д.: 7,1-8,0
(м, HAr, CH=); 9,1 (с, 1H, NH); 10,8 (с, 1H, NH).
Соединения I-V получают аналогично.
Литература
1.
О.В. Зверева, А.В. Милютин, Т.Ф. Одегова и др., Хим.-фарм. журн.,
2 (38), 32-33 (2004).
2.
О.В. Зверева, А.В. Милютин, О.В. Бобровская и др., Хим.-фарм.
журн., 3 (39), 21-22 (2005).
3.
А.В. Милютин, Н.В. Сафонова, В.П. Чесноков и др., Хим.-фарм.
журн., 5 (30), 26-28 (1996).
4.
Л.И. Курковская, Н.Н. Шапетько, Ю.С. Андрейчиков и др.,
Ж.структ.химии, 13 (6), 1026-1032 (1972).
158
АМАРАНТОВОЕ МАСЛО В ДИЕТОТЕРАПИИ
САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА
Золоедов В.И.1, Офицеров Е.Н.2, Коренская И.М.3, Мирошниченко Л.А.4
1
2
Воронежская государственная медицинская академия
Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева
3
Воронежский государственный университет
4
ООО «Русская олива»
Среди
растительных
источников
наибольшее
содержание
физиологически активного соединения - сквалена обнаружено в амарантовом
масле.
Сквален С30Н50 - природный ациклический тритерпен с шестью двойными
(ненасыщенными)
связями,
а
именно:
2,6,10,15,19,23-гексаметил2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен [1].
Структура углеводородного скелета сквалена сходна с изопреном (2метилбутандиеном).
СН3
│
СН2═С─СН═СН2
В природе встречается много соединений, называемых терпенами,
структуру атомов каждого из которых можно разбить на ряд фрагментов,
сходных с изопреном. К ним относятся многие эфирные масла (гераниол,
цитраль, камфора, пинен), различные растительные пигменты, в том числе
каротины, ликопин, а также витамин А и сквален из животных тканей. Сквален
- углеводород с открытой цепью, являющийся промежуточным продуктом
биосинтеза холестерина. Эндогенный сквален синтезируется в организме путем
последовательных реакций из мелавоната, экзогенный сквален поступает из
пищи и транспортируется с помощью липопротеидов очень низкой плотности
по всему организму в различные ткани. Наибольшая концентрация сквалена
обнаруживается в коже, значительные количества этого вещества
накапливаются в печени и жировой ткани, где 80% сквалена находится в каплях
жира, а остальные 20% - в микросомальных мембранах. Установлено, что
только 10% синтезируемого в организме сквалена используется на синтез
холестерина, а остальные 90% накапливаются в жировых каплях в печени,
жировой ткани и коже.
Целью исследования, проведенного на кафедре эндокринологии
Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко, было
изучение клинической эффективности лечения сахарного диабета (СД) типа 2 в
сочетании с артериальной гипертонией АГ модификацией диетотерапии
включением амарантового масла В результате проведенной работы
установлено, что модификация диетотерапии добавлением в нее масла
159
амаранта (с содержанием сквалена 600 мг/сутки) способствует улучшению
клинической картины заболевания (уменьшение жажды, сухости во рту, общей
слабости) при СД 2 типа в сочетании с АГ. Применение нерафинированного
прессового масла амаранта в лечении СД 2 типа повышает эффективность
антигипертензивной терапии за счет более длительного сохранения эффекта
антигипертензивных препаратов []. Использование нерафинированного
прессового
амарантового
масла помогает
улучшению
параметров
гликемического профиля и снижению уровня гликированного гемоглобина. Так
при приеме нерафинированного прессового масла амаранта (с содержанием
сквалена 600 мг/сутки) установлено статистически значимое снижение
гликемии в 8 часов утра, в 11, 13 и 21 час, что повышает гипогликемический
эффект базисного лечения сахарного диабета 2 типа. Масло, полученное из
амаранта, методом холодного отжима (с содержанием сквалена 600 мг/сутки)
приводит к уменьшению протромбина на фоне возрастания показателей
фибриногена, АЧТВ, МНО, тромбинового и протромбинового времени, что
показывает положительное влияние комплексной терапии диабета с
включением масла амаранта на показатели свертывающей системы крови у
больных сахарным диабетом второго типа. Нерафинированное прессовое
амарантовое масло положительно воздействует на нарушенный липидный
обмен за счет достоверного снижения уровня триглицеридов и общего
холестерина. Применение в диетотерапии амарантового масла приводит к
уменьшению вторичной иммунной недостаточности у больных СД 2 типа на
фоне артериальной гипертензии в результате устранения гиперфункции
иммунной системы по IgА и улучшению значений фагоцитарного показателя. В
соответствии с данными проведенного исследования было предложено для
коррекции нарушений липидного обмена у больных сахарным диабетом 2 типа
назначение нерафинированного прессового амарантового масла [2]. Для
повышения эффективности традиционной антигипертензивной терапии,
устранения или уменьшения нарушений углеводного обмена, коррекции
вторичной иммунной недостаточности у больных сахарным диабетом типа 2
было показано, что в диетотерапию этого заболевания лучше включать масло
амаранта или композицию нерафинированного прессового амарантового масла
с нерафинированным прессовым подсолнечным маслом [3].
Рекомендуемой дозой и курсом лечения нерафинированным прессовым
маслом амаранта является прием его в количестве 10 мл натощак, утром, в
течение 14 дней. Кроме того, учитывая, что растительные масла обладают
определенной ретардацией действия, возможно, назначение их в течение
нескольких месяцев и лет, что служит основанием для проведения дальнейших
научных исследований в этом направлении.
Литература
[1] Макеев А.М. Амарантовое масло – уникальное природное
лекарственное средство. / А.М. Макеев, А.А. Кунин, И.М. Коренская [и др.] //
160
IV международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и
перспективы их использования». - М. : Пущино. -2001. - С. 255-265.
[2] Мирошниченко Л.А. Влияние диетотерапии с использованием
подсолнечного масла и масла амаранта на показатели иммунной реактивности у
больных сахарным диабетом типа 2 / Л.А. Мирошниченко, В.И. Золоедов, А.П.
Волынкина, С.Н. Кулакова // Вопросы питания. – 2009. – т. 78, № 4. – С. 30-36.
[3] Zoloedov V.I. The influence of dyetotherapy with amaranth and sunflower
oils on the lipid and carbohydrate exchange of diabetic patients with obesity / V.I.
Zoloedov, L.A. Miroshnichenko, A.P. Volynkina, S.N. Kulakova, D.M. Martirosyan //
Functional Foods for Chronic Diseases. Volume 4. Edited by Dr. Danik M.
Martirosyan. – D&A Inc/FF Publishing. – 2009. – P. 55-66.
161
НОВЫЕ ЛИНЕЙНО СВЯЗАННЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ
N-АРИЛМАЛЕИМИДОВ
Зорина А.В., Маурина Л.Е., Потапов А.Ю., Шихалиев Х.С.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Ранее в работе [1] был описан синтез 2,3-дигидро-1Н-имидазо[1,2а]бензимидазола 1. По аналогичной методике мы осуществили синтез 1,2,3,4тетрагидропиримидо[1,2-а]бензимидазола 2 (схема 1).
Схема 1.
OH
OH
N
n
N
n
N
SO3 H +
H
N
N
H
NH2
H
SOCl2
Cl
N
n
n
N
N
H
N
N
H
n=1, 2
N
H
1, 2
Полученные бензимидазолы мы ввели во взаимодействие с Nарилмалеимидами (схема 2). Подтвердилось, что реализуется единственно
возможное направление данной реакции, а именно присоединение кратной
связи N-арилмалеимида по NH-группе бензимидазола 1,2 по типу реакции
Михаэля, подобно работе [2]. Оптимальными условиями осуществления
взаимодействий N-арилмалеимидов с бензимидазолами 1,2 является их
кипячение в полярных высококипящих растворителях: в диоксане и бутиловом
спирте.
В результате реакции были получены линейно связанные системы: 3-(3,4дигидропиримидо[1,2-а]бензимидазол-1(2Н)-ил)-1-арил-2,5-пирролидиндионы
3а,б
и
3-(2,3-дигидро-1Н-имдазо[1,2-а]бензимидазол-1-ил)-1-4-арил-2,5пирролидиндионы 4а,б.
Схема 2.
O
n
N
+
N
1, 2
N
H
O
n
N
N
N
R
N
O
N
n= 1, 2
R: a - 4-CH3; б - 4-OCH3
162
3а,б
4а,б
O
R
Структура всех полученных соединений подтверждена методом ЯМР 1Нспектроскопии.
Для полученных пирролидиндионов 3,4а,б был осуществлен
виртуальный скрининг с помощью программы PASS, разработанной в ИБМХ
РАМН. На основе скрининга in silico установлено, что пирролидиндионы 3,4а,б
являются
анксиолитиками,
антиконвульсантами,
антиэпилептическими
средствами, а также агонистами GABA A рецепторов.
Литература
1. Пожарский А. Ф., Анисимова В. А., Цупак Е. Б. Практические работы
по химии гетероциклов / А. Ф. Пожарский, В. А. Анисимова, Е. Б. Цупак //
Изд-во Ростовского Университета, 1988, С. 124.
2. Joseph-Nathan P., Mendoza V., Garsia G.E. Aziridine induced
izomerization of isomaleimides to maleimides / P. Joseph-Nathan, V.
Mendoza, G.E. Garsia // Can/J. Chem., 1974,52, P.129/
163
ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ РАСТЕНИЙ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СБОРАХ
Ивановская Н.П., Коренская И.М., Хрусталева А.Н.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
В последние годы значительно возрос спрос на препараты растительного
происхождения. Растения являются источниками получения лекарственных
препаратов, содержащих биологически активные вещества, такие как
алкалоиды, флавоноиды, полисахариды, эфирные масла и др. [1, 2].
Препараты из растений, по сравнению с синтетическими, имеют
преимущества: они содержат много ингредиентов, которые придают им ценные
свойства и обеспечивают многостороннее действие на организм, более сильное,
чем каждое из них в отдельности [3].
Суть понимания механизмов лечебного действия лекарственных форм из
растений может быть кратко изложена в виде следующих двух положений. С
одной стороны на организм могут оказывать влияние содержащиеся в растении
действующие вещества (алкалоиды, фенольные соединения, эфирные масла и
т.д.).
Эти
вещества
обуславливают
фармакологические
эффекты:
болеутоляющий, мочегонный, противовоспалительный и т. д. Но есть и другая
сторона действия растений. Она связана с содержанием в них веществ, не
обладающих выраженной фармакологической активностью: белков, микро- и
макроэлементов, аминокислот, органических кислот и др. Приготовленные из
цельных растений лекарственные формы зачастую оказывают более
существенный эффект, так как лечебное действие связано еще и с
оптимизацией внутриклеточного обмена за счет использования их как
необходимых нутриентов [4].
Как правило, для лечения заболеваний чаще используют не отдельные
растения, а сборы. Возможно, в извлечении из лекарственного сбора между
биологически активными веществами могут возникать взаимодействия,
которые будут усиливать основной фармакологический эффект или ослаблять
нежелательные побочные действия.
Целью настоящей работы явилось предварительное изучение взаимного
влияния биологически активных веществ, находящихся в корнях солодки
(Radices Glycyrrhizae) и листьях мать-и-мачехи (Folia Farfarae), часто входящих
в состав грудных сборов.
Для исследования использовали измельченное сырье с размером частиц
до 1 мм. Из сырья получали: водное и 70% водно-спиртовое извлечения.
Анализ проводили спектрофотометрическим методом с помощью
спектрофотометра СФ - 2000.
Результаты спектрофотометрического анализа представлены на графиках
(Рис. 1, 2).
164
Рис. 1 Спектры поглощения водных извлечений листьев мать –
мачехи, корней солодки, сбора
Рис. 2 Спектры поглощения водно-спиртовых извлечений листьев
мать – мачехи, корней солодки, сбора
Как видно из спектров поглощения max значения оптической плотности для
водного извлечения проявляются при следующих длинах волн.
Таблица 1.
Растительное сырье
Листья
мать – и - мачехи
Корни солодки
Сбор
Водное извлечение
325 нм
265 нм
275 нм, 320 нм
165
Водно-спиртовое
извлечение
255нм, 275 нм, 410 нм
310 нм, 430 нм
255 нм, 275 нм, 310 нм,
420 нм
Анализ
полученных
результатов
показал,
что
происходит
незначительный сдвиг максимумов пиков поглощения в сборе, содержащем
корни солодки и листья мать-и-мачехи, относительно индивидуальных видов
сырья, как в водном так ив водно-спиртовом извлечениях. Это может
свидетельствовать о взаимодействии между веществами разных растений,
которое в свою очередь может влиять на фармакологическую активность сбора.
Литература
[1] Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: учеб. пособие /
под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. – СПб. : СпецЛит, 2004. – 765 с.
[2] Химический анализ лекарственных растений / под ред. Гринкевич
Н.П. – М. : Высшая школа, 1983. – 176 с.
[3] Муравьева Д.А. Фармакогнозия : учеб. / Д.А. Муравьева, И.А.
Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.
[4] Колесова В.Г. Лекарственные растения: мифы и реальность.
Традиционная медицина в объективе науки / В.Г. Колосова, В.А. Марченко,
Н.В. Сыровежко. – СПб. : СПХФА, 1998. – 261 с.
166
ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК В СЕРДЦЕ КРЫС ПРИ АДРЕНАЛИНОВОМ
МИОКАРДИТЕ И ДЕЙСТВИИ ФЕНИЛЭТИЛБИГУАНИДА
НА ФОНЕ ПАТОЛОГИИ
Искусных И.Ю., Попова Т.Н., Тюрин И.А., Мамука Е.В.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Свободнорадикальное окисление и система антиоксидантной защиты,
имея универсальный характер, оказывают значительное влияние на гомеостаз и
определяют возможность развития патологии. Как правило, избыток свободных
радикалов вызывает структурные и функциональные повреждения
биологических мембран. В результате этого в клеточных мембранах
происходит формирование каналов проницаемости, что нарушает
жизнедеятельность клеток и приводит к их гибели. К наиболее
распространенным патологиям, приводящим к высокой смертности, относятся
сердечно-сосудистые заболевания. При нарушении кровоснабжения миокарда
возникает дисбаланс между энергоснабжением сердца и его метаболическими
потребностями. Это приводит к снижению уровня высокоэнергетических
фосфатов, накоплению потенциально токсичных продуктов метаболизма,
включая, свободные кислородные радикалы, приводящие к морфологическому
повреждению и, в конце концов, к гибели кардиомиоцитов. Поэтому,
актуальным является поиск средств, способных повышать резистентность
организма к повреждающему действию свободных радикалов при
патологических состояниях, сопровождающихся апоптозом или некрозом
клеток[1]. В связи с этим, целью настоящей работы явилась оценка степени
фрагментации ДНК в норме, при адреналиновом миокардите и действии
фенилэтилбигуанида на фоне патологии. Эксперимент состоял из экстракции
геномной ДНК фенол-хлороформным методом и еѐ электрофореза в 1%
агарозном геле. Адреналиновый миокардит индуцировали путем введения
крысам (Rattus rattus L., массой 150-200 г.) 150 мкл 0,1% раствора адреналина
на 100 грамм массы тела. Фенилэтилбигуанид вводили на фоне патологии в
концентрации 50 мг на 1 кг веса животного. Фрагменты ДНК из сердца крыс,
подвергнутых адреналиновому миокардиту, образуют характерную апоптозную
лестницу. При исследовании образцов ткани сердца крыс, которым вводили
фенилэтилбигуанид на фоне патологии, установлено, что степень
фрагментации ДНК менее выражена по сравнению с ДНК из миокарда
животных с адреналиновым миокардитом. Таким образом, введение
фенилэтилбигуанида сопровождается усилением адаптационной способности
клеток, что приводит к уменьшению количества клеток, вовлекаемых в апоптоз.
Возможно, это связано со способностью данного гуанидинового производного
проявлять антиоксидантные свойства.
167
Литература
1.
Искусных И.Ю. Влияние тиоктовой кислоты на оксидативный
статус тканей крыс при хронической алкогольной интоксикации/Сафонова
О.А., Т.Н. Попова, Семенихина А.В., Искусных И.Ю., Свиридов
М.М.//Наркология, №11(83),2008г., Москва. – С.44-48.
168
РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ АППЛИКАЦИОННОЙ ФОРМЫ
С ЭКСТРАКТОМ ЛИСТЬЕВ КРАСНОГО ВИНОГРАДА
Каплун М.Б., Дубенцева О.М., Калмыкова Т.П., Суслина С.Н.
e-mail: [email protected]
Российский университет дружбы народов
Лечение хронической венозной недостаточности сегодня является очень
актуальной проблемой, так как эта патология является самым распространенным
заболеванием периферических сосудов. Несмотря на достижения в медицине и
фармации, число больных с ХВН все увеличивается.
Целью нашей работы явилась разработка мягкой лекарственной формы
противоварикозного действия в виде геля с экстрактом листьев красного
винограда и всестороннее его изучение на основании принципов биофармации.
Данная работа выполнялась в соответствии с Федеральной целевой программой
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2010
гг., в рамках реализации мероприятия №1.2.1 «Проведение научных
исследований научными группами под руководством докторов наук», проект
«Биоинженерия как основа мобилизации адаптивного потенциала биообъектов –
суперпродуцентов БАВ» ГК П555\05.08.2009- НК-97П. Все эксперименты
проводились на кафедре «Общей фармацевтической и биомедицинской
технологии» РУДН (зав. каф. академик РАМН и РАСХН В.А.Быков), а так же с
использованием оборудования «Центра коллективного пользования» РУДН
(директор Р.А. Абрамович).
Экстракт листьев красного винограда является новой субстанций и уже
применяется зарубежом в составе твердых и аппликационных форм. Действие
экстракта обусловлено Р-витаминной активностью полифенольных соединений
(в том числе кверцетина, антоцианов, транс-резвератрола).
По описанию субстанция представляет собой гигроскопичный порошок
красно-коричневого цвета со специфическим запахом. Микроскопическое
исследование внешнего вида частичек экстракта проведено при помощи
электронного сканирующего микроскопа JSM-6490. Экстракт представляет
собой частички округлой формы с гладко-выямчатой поверхностью в виде
лунных кратеров размером от 20 до 62 мкм. По сравнению с другими
изученными экстрактами вид его весьма специфичен. Данный показатель в
дальнейшем можно использовать в качестве проведения внутреннего контроля
на фармацевтическом предприятии для оценки качества при производстве
экстракта, а так же для изучения его характеристик при производстве твердых
форм.
Для введения субстанции в лекарственную форму необходимо было
изучить еѐ растворимость в системе растворителей. С биофармацевтической
точки зрения наиболее целесообразным является присутствие действующего
вещества в мазевой форме в виде раствора. В связи с этим, нами были изучена
растворимость экстракта в различных растворителях и системах растворителей в
169
зависимости от условий растворения (при температуре и без). Отмечено, что
наилучшим растворителем является вода очищенная (ВО). Димексид (ДМСО),
пропиленгликоль (ПГ) и их смеси с водой так же являются хорошими
растворителями. В спирте, глицерине, пропиленгликоле (ПЭГ-400) и их смесях
экстракт умеренно растворим даже при нагревании до 60 оС.
По литературным данным известно, что вещества, содержащиеся в
экстракте, являются нестабильными при хранении в водной среде. Для изучения
стабильности экстракта были выбраны системы растворителей, обладающие
наилучшей растворяющей способностью (ВО, ПГ, ПГ:ВО, ДМСО, ДМСО:ВО в
различных концентрациях). Образцы растворов заложены на хранение для
изучения по методу «ускоренного старения» в термостат при t=40oC.
На основании литературных данных для получения геля концентрация
экстракта
выбрана
1%.
Руководствуясь
основными
положениями
биофармацевтической концепции, выбор вспомогательных веществ для
производства геля осуществляли на основании литературных данных и
потребностей производителя. В качестве основы использовали полимер
акриловой кислоты карбопол 940NF. Гели на его основе при нанесении образуют
тончайшие гладкие пленки, обеспечивая пролонгированный эффект препаратов
и равномерно высвобождают лекарственные вещества. Для нейтрализации цепей
полимера использовали триэтаноламин. В качестве консервантов использовали
нипагин и нипазол. Подбор оптимальной концентрации полимера для геля и
изучение его реологических характеристик проводили с использованием
ротационного вискозиметра Брукфильда DV-II+. Установлено, что оптимальная
концентрация структурообразователя в присутствии экстракта листьев красного
винограда в приемлемой системе растворителей (ДМСО:спирт этиловый:вода
3:5:90) составляет 1%.
Высвобождение полифенольных соединений (ПФС) из геля изучали с
помощью метода равновесного диализа по Крувчинскому. Экспериментально
доказано, что высвобождение ПФС из разработанной лекарственной формы
происходит постепенно и в течение трѐх часов достигает 75%.
Для определения подлинности действующих веществ в геле использована
методика, предложенная в ГФ XI - цветная реакция на флавоноиды, а так же УФспектр при 528 нм и цветная реакция на антоцианы. Для стандартизации геля
модифицированы и апробированы методики количественного определения
действующих веществ методом спектрофотометрии при 528 нм для антоцианов
и при 746 нм для полифенольных соединений в пересчете на пирогаллол.
Осуществлена оценка качества геля в соответствии с требованиями ГФ XI
вып.2, статья «Мази» по следующим показателям: внешний вид, однородность
геля, подлинность, количественное определение действующих веществ,
микробиологическая чистота. На основании этих данных разработан проект
ФСП.
Совокупность данных, полученных в результате проведенных
исследований, позволяет говорить о рациональном выборе вспомогательных
веществ при разработке мягкой лекарственной формы виде геля.
170
ЗАВИСИМОСТЬ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ПРЕПАРАТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА ВВЕДЕНИЯ
В ОРГАНИЗМ НА ПРИМЕРЕ ФТОРХИНОЛОНОВ В СВОБОДНОМ
И ИММОБИЛИЗОВАННОМ НА КЛЕТОЧНЫХ НОСИТЕЛЯХ ВИДЕ
Карлов П.М., Сипливая Л.Е.
Воронежский государственный университет
В настоящее время урологические инфекционные заболевания занимают
одно из ведущих мест в клинике инфекционных патологий. Так,
превалирующий в России вид нозокомиальных инфекций (около 40% от
общего числа) – инфекции мочевыводящих путей, этиологическая структура
которых может быть представлена следующими возбудителями: Esherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp и др. Одним из самых
распространенных заболеваний почек в любых возрастных группах является
пиелонефрит, частота которого за последние годы увеличивается и занимает
второе место в структуре заболеваний после острой респираторной вирусной
инфекции. Согласно статистике в среднем 1% людей на земле каждый год
заболевают пиелонефритом.
Препараты группы фторхинолонов внедрены в клиническую практику в
начале 80-х годов, и сегодня они занимают одно из ведущих мест в
химиотерапии различных бактериальных инфекций. Свойства фторхинолонов,
позволившие им занять ведущие позиции в арсенале современных
антибактериальных средств: уникальный механизм действия среди
антимикробных средств – ингибирование фермента бактериальной клетки –
ДНК–гиразы, высокая степень бактерицидной активности, широкий спектр
антимикробного
действия,
включающий
грамотрицательные
и
грамположительные аэробные бактерии (некоторые препараты активны также в
отношении анаэробов), микобактерии, хламидии, микоплазмы,
хорошее
проникновение в ткани и клетки макроорганизма, где создаются концентрации,
близкие
к
сывороточным
или
их
превышающие;
доказанная в контролируемых клинических исследованиях высокая
эффективность при лечении внебольничных и госпитальных инфекций
практически любой локализации (верхних и нижних дыхательных путей,
мочевыводящей системы, кожи и мягких тканей, костей и суставов,
интраабдоминальной, гинекологической, печени и желчевыводящих путей,
желудочно–кишечного тракта, глаз, центральной нервной системы,
заболеваний, передающихся половым путем);
Тем не менее, фторхинолоны проявляют серьезное побочное действие,
которое зависит от состояния больного, от времени лечения препаратами, от
дозы и ряда других причин. Отдельные представители фторхинолонов могут
существенно отличаться по характеру и степени выраженности побочного
действия на различные системы организма. Например, общая частота побочных
171
реакций при назначении спарфлоксацина достигает 13,7–25,3 %, тогда как для
грепафлоксацина она составляет 47%.
Перспективным направлением в терапии различных патологий является
использование технологий направленного транспорта лекарственных средств,
позволяющих значительно снизить их системную токсичность, удлинить время
полувыведения препаратов из организма, уменьшить терапевтическую дозу и
кратность введения. Контролируемая и целенаправленная доставка в организм
антибактериальных препаратов основана на использовании различных
носителей или векторов, обладающих тропностью к определенным органам или
их клеткам. В качестве векторов могут выступать гормоны, ферменты а также
микроконтейнеры: липосомы, капсулы из человеческого альбумина и
аутоклетки крови. Наиболее выгодными с точки зрения биологической
совместимости считаются системы доставки, в которых используются
собственные клетки организма, в частности, эритроциты, лейкоциты и
тромбоциты.
Нами изучено в сравнительном плане влияние фторхинолонов при острой
почечной недостаточности (ОПН), осложненной стафилококковой инфекцией,
на отдельные биохимические и иммунологические показатели при различных
технологиях введения: свободные и клеточные формы.
В работе использованы препараты фторхинолонов: норфлоксацин,
офлоксацин, левофлоксацин. Препараты вводили внутримышечно пятикратно с
интервалом 12 ч в разовых дозах 3 мг/кг. Дозы фторхинолонов, вводимых в ЭН
и ЛН, составляли 6 мг/кг. Эритроцитарные носители (ЭН) и лейкоцитарные
носители (ЛН) с включенными антибиотиками вводили внутривенно двукратно
с интервалом 48 ч. Концентрацию антибиотиков, включенных в клеточные
носители, определяли по разработанной нами спектрофотометрической
методике.
Установлено, что при введении ртути дихлорида в сочетании с
инфицированием, резко повышается уровень мочевины и креатинина, что
свидетельствует о развитии острой почечной недостаточности. У крыс с ОПН,
осложненной стафилококковой инфекцией, снижается интенсивность ГИО на
ЭБ.
В эритроцитах крыс с ОПН, в сочетании со стафилококковой инфекцией
количество антиокислительных ферментов (СОД и ГР) было ниже, а
содержание продуктов ПОЛ (АГП и МДА) выше, чем в группе здоровых
животных (рисунок 1).
Полученные данные свидетельствует о системных нарушениях у
животных с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией.
Введение свободных фторхинолонов нормализовало выделительную
функцию почек на 11-12 день. После введения норфлоксацина, офлоксацина и
левофлоксацина отмечалось усиление угнетения ГИО, ПОЛ и снижение
антиоксидантной защиты эритроцитов.
Введение эритроцитарных форм фторхинолонов нормализовало уровни
мочевины и креатинина на 7-8 сутки и значительно повышало выраженность
ГИО на ЭБ (рисунок 2).
172
Рис. 1. Влияние свободных антибиотиков на показатели
энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов крыс с
пиелонефритом.
Обозначения: 1 – контроль; 2 – ОПН и стафилококк; 3 – ОПН и стафилококк +
левофлоксацин.
Рис. 2. Влияние иммобилизованных в ЭН и ЛН фторхинолонов на
показатели энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов
крыс с пиелонефритом.
Обозначения: 1 – контроль; 2 – ОПН и стафилококк; 3 – ОПН и стафилококк + ЭН с
левофлоксацином; 4 – ОПН и стафилококк + ЛН с левофлоксацином
Таким образом, использование эритроцитарных и лейкоцитарных
носителей с целью транспорта фторхинолонов является эффективным.
Результаты экспериментальных исследований показали, что в качестве
носителей фторхинолонов при ОПН и ОПН в сочетании с инфицированием
стафилококком, наиболее обосновано использование клеток белой крови,
учитывая их способность быстро накапливаться в области очага острого
воспаления.
173
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ЛЕТУЧИХ
ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИЯХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
МЕТОДАМИ ГЖХ И ХРОМАТО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Климочкин Ю.Н., Головин Е.В., Смирнов В.А., Леонова М.В.
e-mail: [email protected]
Самарский государственный технический университет
Контроль
остаточного
содержания
различных
органических
растворителей в субстанциях лекарственных средств является необходимой
составной частью фармакопейного анализа.
Нами был осуществлен анализ более 500 образцов 20 различных
фармацевтических субстанций (Лоперамида гидрохлорид, Каптоприл,
Эналаприла малеат, Ципрофлоксацина гидрохлорид, Индапамид, Аскорбиновая
кислота, Ранитидин, Фамотидин, Триметазидина дигидрохлорид, Ацикловир,
Клотримазол, Симвастатин, Нитроглицерин с глюкозой, Омепразол,
Флуконазол, Амитриптилина гидрохлорид, Офлоксацин, Амброксола
гидрохлорид, Рибавирин, Азитромицин)
методом газо-жидкостной
хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора (ГЖХПИД) в соответствии с нормативными требованиями. Контроль этих же
образцов методом хромато масс-спектрометрии (ГХ/МС) на приборе Thermo
Finnigan Trace DSQ показал, что в ряде случаев обнаруживаются примеси,
содержание которых не было нормировано, либо отдельные примеси
невозможно обнаружить или точно определить их содержание методом ГЖХПИД из-за наложения с пиками сопутствующих примесей. Кроме того
пламенно-ионизационный детектор обладает очень низкой чувствительностью
по отношению к галогенорганическим содинениям. Метод хромато массспектрометрии в свою очередь лишен этих недостатков и позволяет с высокой
достоверностью проводить количественный анализ до 30 примесей
одновременно даже при использовании стандартной капиллярной колонки с
неполярной полидиметилсилоксановой фазой. Проблема неразрешенных пиков
решается путем проведения количественного анализа по отдельным ионам или
группам ионов, принадлежащих только данному соединению. Это позволяет с
высокой точностью и достоверностью определять содержание примесей,
которые не могут быть обнаружены ГЖХ-ПИД. Кроме того при таком способе
обработки данных значительно возрастает отношение сигнал/шум:
RT: 1.00 - 2.20
RT: 1.00 - 2.20
NL:
7.51E7
TIC MS
OF_Simva
statine_03
1.17
100
95
RT: 1.00 - 2.20 SM: 15B
NL:
7.57E6
Base Peak
m/z=
31-32 MS
OF_Simva
statine_03
1.32
100
95
90
95
90
80
80
80
75
75
75
70
70
70
65
65
65
60
60
60
50
45
40
55
50
45
40
35
1.32
30
25
20
Relative Abundance
85
55
15
1.37
1.23 1.25
5
1.03 1.07 1.11
1.42
1.50 1.51
1.53 1.58
1.62 1.68 1.73 1.78 1.81 1.85 1.91
2.08 2.09
2.15
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Time (min)
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
исходная хроматограмма
40
30
25
0
1.0
45
35
20
15
10
1.36 1.42 1.43
5
0
50
25
10
1.96 1.98
55
30
15
10
85
35
20
1.34
NL:
3.48E5
Base Peak
m/z=
83-84+
85-86 MS
OF_Simvast
atine_03
2.09
100
85
Relative Abundance
Relative Abundance
90
1.02 1.05
1.0
1.13
1.47 1.52 1.58 1.61 1.67
1.19 1.19 1.27
1.76
1.84 1.86 1.90 1.96 2.01 2.01
5
1.13
1.03 1.07
2.11 2.14
1.21 1.23
1.32 1.34
1.2
1.3
1.39
1.44
1.53 1.53 1.55
1.65 1.68 1.72
1.78 1.82
1.88 1.92
2.00 2.02
1.9
2.0
2.14
0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Time (min)
1.7
1.8
1.9
2.0
после обработки
(компонент метанол)
174
2.1
2.2
1.0
1.1
1.4
1.5
1.6
Time (min)
1.7
1.8
2.1
2.2
после обработки
(компонент хлороформ)
Сравнительная оценка результатов статистической обработки данных
полученных методами ГЖХ-ПИД и ГХ/МС показала, что последний метод
обладает рядом неоспоримых преимуществ: высокой линейностью во всем
диапазоне определяемых концентраций, высокой чувствительностью, не
зависящей от химической природы примесей, возможностью идентификации
неизвестных примесей и их количественного определения.
175
ПРИМЕНЕНИЕ КОЛЛАГЕНА В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ
И ПРОТЕКТОРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ
Ковалева Т.А., Макарова Е.Л.
Воронежский государственный университет
В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию
лекарственных препаратов со сниженной токсичностью и аллергенностью.
Иммобилизация энзимов способствует решению проблемы направленного
транспорта лекарств в организме и пролонгированному действию
ферментных препаратов по сравнению с лекарственными соединениями
традиционных форм.
Для
получения
иммобилизованных
ферментов
используют
многочисленные носители различной природы.
В настоящее время особую значимость приобретают работы по
изучению структурно-функциональных свойств белков соединительной
ткани, в том числе коллагена и его производных. Интерес исследователей к
носителям белковой природы вполне обоснован, так как они обладают высокой
химической прочностью, достаточной проницаемостью для фермента и
субстрата, большой удельной поверхностью, возможностью получения в виде
удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран), легкой
активацией, высокой гидрофильностью, невысокой стоимостью.
Применение природных биополимеров, полностью утилизируемых
организмом, то есть перевариваемых и замещаемых собственными тканями,
исключает опасность накопления матрицы носителя в организме человека.
Среди других белков коллаген обладает наименьшей иммуногенностью и его
уникальные физико-химические свойства удовлетворяют многочисленным
требованиям, предъявляемым к носителям при создании новых лекарственных
препаратов.
Активные функциональные группы в коллагене и сложная молекулярная
структура, склонная к образованию фибрилл и волокон, способствует как
химическому связыванию, так и адсорбции биологически активных и
лекарственных (низко- и высокомолекулярных) веществ.
По сравнению с носителями синтетического происхождения имеют ряд
преимуществ.
Возможность регулирования лизиса коллагена посредством модификации
его дублением позволяет создавать пролонгированные препараты с различным
сроком действия лекарственных веществ.
Иммунные свойства организма значительно ограничивают использование
белковых препаратов. В этом отношении преимущества на стороне белков
соединительной ткани - коллагена и эластина, обладающих наименьшей
иммуногенностью.
176
Ранее проведенные исследования показали, что значительную активность
имела глюкоамилаза, адсорбционно иммобилизованная на ионитах Биокарб-Т
(93,1 % от каталитической способности нативного энзима), КБ-41 (53,2 %) и
ИА-1 (27,5 %). Однако комплекс глюкоамилаза-ИА-1 не обладал достаточной
механической прочностью и разрушался при гидролизе крахмала, так как
реакция протекала при интенсивном перемешивании субстрата.
В связи с вышеизложенным, нами была проведена сорбционная
иммобилизация глюкоамилазы (α-1,4:1,6 глюкан-4,6-глюкогидролаза, КФ
3.2.1.3) на коллагене, выделенном ферментативным методом из
соединительной ткани крупного рогатого скота с целью расширения
возможностей их применения в области получения фармацевтических
препаратов.
Наши
исследования
показали
что,
глюкоамилаза,
иммобилизованная на коллагене, по сравнению со свободной
глюкоамилазой более стабильна к воздействию внешних факторов.
Объектом исследования послужил фермент глюкоамилаза из Аspergillus
awamori, препарат Г20Х производства Ладыжинского завода ферментных
препаратов, подвергнутый специальным методом очистки. Глюкоамилаза (α1,4:1,6 глюкан-4,6-глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3) катализирует реакцию
гидролиза крахмала до глюкозы, атакуя только внешние нередуцирующие
концы цепей полисахаридов, и широко используется в разработке новых
прогрессивных технологий
Для
определения
активности
глюкоамилазы
использовали
глюкозооксидазный метод. Принцип метода заключается в том, что глюкоза
окисляется
кислородом
воздуха
при
каталитическом
действии
глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода и глюконата. Возникшую
перекись водорода определяли по реакции окислительного азосочетания с
замещенным фенолом и 4-аминоантипирином, которая катализируется
пероксидазой.
Расчет каталитической активности производили по формуле:
A
a
b 180 10
где а - количество глюкозы, образовавшейся в 1 мл гидролизата, мкг;
b- количество фермента в 1 мл гидролизата, мг/мл;
t- время гидролиза, мин;
180- молекулярная масса глюкозы.
В качестве субстрата использовали растворимый картофельный крахмал
Для сорбционной иммобилизации фермента использовали коллаген,
выделенный ферментативным методом из соединительной ткани крупного
рогатого скота на кафедре технологии мяса и мясопродуктов Воронежской
государственной технологической академии.
Для осуществления сорбционной иммобилизации 5 г коллагена
оставляли на ночь при комнатной температуре в 25,6 мл ацетатного буфера (рН
4,5). 5 мл раствора фермента (10-5 моль/л) добавляли к суспензии носителя и
перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки в течение 1,5 часа
при температуре 25°С. Центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин, осадок
177
промывали ацетатным буфером (рН 4,5), затем дистиллированной водой до
отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на СФ-26 при
=280 нм). Содержание белка в иммобилизованном ферменте определяли
модифицированным методом Лоури, а каталитическую активность –
глюкозооксидазным методом, причем инкубацию иммобилизованного
фермента с субстратом осуществляли при перемешивании с помощью
магнитной мешалки в течение 30 минут.
Осуществлена иммобилизация глюкоамилазы на коллагене, причем
фермент-носитель сохраняет 67% каталитической активности свободного
энзима.
Наши исследования показали, что, глюкоамилаза, иммобилизованная на
коллагене, по сравнению со свободной глюкоамилазой более стабильна к
воздействию внешних факторов.
Исследованы физико-химические свойства глюкоамилазы, адсорбционно
связанной с коллагеном. Установлено, что иммобилизованный фермент
проявляет максимальную каталитическую активность при температуре 55 0С,
что на 50С выше, чем для свободного энзима
При иммобилизации глюкоамилазы на коллагене наблюдается
расширение диапазона значений рН, при которых имеет место максимальная
каталитическая активность.
Адсорбция глюкоамилазы на коллагене является перспективной для
дальнейших исследований с целью разработки оптимальных условий для
получения высокоактивных препаратов пролонгированного действия.
178
ПРИМЕНЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНУЛИНАЗЫ ДЛЯ
ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗЫ – ВАЖНЕЙШЕГО ПРОДУКТА
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПИТАНИЯ
Ковалева Т.А., Холявка М.Г. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Применение гидролитических ферментов в пищевой промышленности и
медицине помогло существенно усовершенствовать многие существующие
способы производства продуктов питания и лекарственных препаратов.
Получение фруктозы из инулинсодержащих культивируемых растений путем
ферментативного гидролиза полифруктозидов является неотъемлемой частью
современной фармацевтической и пищевой индустрии.
В настоящее время одним из широко распространенных продуктов
функционального питания является фруктоза. Фруктозные сиропы могут быть
использованы для профилактики сахарного диабета, кариеса и ожирения.
В настоящее время фруктозно-глюкозные сиропы получают тремя
способами: 1) гидролизом сахарозы и инулина; 2) изомеризацией глюкозы; 3)
трехстадийным ферментативным путем из крахмала.
Гидролиз сахарозы на фруктозу и глюкозу, осуществляемый под
действием β-фруктофуранозидазы, обеспечивает образование инвертного
сахара, в котором фруктоза и глюкоза находятся в эквимолекулярном
соотношении [1].
Получение фруктозы из инулина возможно путем кислотного или
ферментативного гидролиза. При кислотном гидролизе в качестве катализатора
используют минеральные или органические кислоты: серную, соляную,
щавелевую, лимонную и др., которые могут попадать в конечные продукты. К
тому же при производстве необходимо применять специальное
кислотоустойчивое оборудование. Zittan L. (1981) показал, что при гидролизе
инулинсодержащего сырья с помощью фосфорной кислоты среди побочных
продуктов реакции выделяются красящие соединения, ухудшающие товарные
качества фруктозы [2].
Ферментативный гидролиз предпочтительнее кислотного, т. к. является
экологически более чистым и при этом не получают побочных продуктов,
которые усложняют выделение и очистку фруктозы [3].
Производство фруктозы из крахмала ферментативным путем состоит из
нескольких этапов и требует наличия трех различных ферментов: α-амилазы,
глюкоамилазы и глюкоизомеразы [1]. При этом получают 45% фруктозный
сироп. В случае применения инулиназы для расщепления инулинсодержащего
сырья в одностадийном процессе получают конечный продукт – 95%-ный
фруктозный сироп. Перспективным направлением является получение
фруктозы из растительного сырья.
Инулиназа
(2,1-β-D-фруктанфруктаногидролаза,
КФ
3.2.1.7)
специфически
гидролизует
β-2,1-связи
инулина до
фруктозы
и
179
фруктоолигосахаридов в более мягких условиях по сравнению с кислотным
гидролизом, требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой
температуры и применения специального кислотоустойчивого оборудования. В
последние годы проводятся исследования процесса гидролиза инулиназой не
только химически чистого инулина, но и фруктоолигосахаридов, содержащихся
в экстрактах топинамбура [4], цикория [5] и спаржи [6].
В недалеком прошлом топинамбур рассматривался, прежде всего, как
кормовое растение. В последние годы во многих странах его стали исследовать
как ценнейшее техническое сырье, при переработке которого получают
большой набор различной продукции. В настоящее время доказана
перспективность применения различных частей Helianthus tuberosus для
целенаправленного конструирования и сырьевого использования с целью
получения биологически активных добавок, функциональных продуктов
питания и косметических средств. Были выявлены новые свойства экстрактов
из топинамбура: иммуностимулирующая, антитоксическая, антистрессорная,
адаптогенная, антиоксидантная виды биологической активности [7]. Однако,
несмотря на тот факт, что Helianthus tuberosus имеет большой промышленный и
экологический потенциал, его комплексная переработка с целью получения
высокоценных продуктов, в том числе продуктов функционального питания, до
сих пор не решена.
Получение фруктозы из инулинсодержащих культивируемых растений
путем ферментативного гидролиза полифруктозидов является неотъемлемой
частью современной фармацевтической и пищевой индустрии. В связи с этим
целью нашего исследования было разработать на основе иммобилизованной
инулиназы гетерогенный биокатализатор реакции гидролиза инулина,
содержащегося в экстракте топинамбура.
Показано, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы из
Kluyveromyces marxianus на синтетических ионитах АВ-17-2П, КУ-2, ВИОН
КН-1, IMAC-HP, АВ-16-ГС, АМ 21А и PUROLITE степень сохранения
удельной активности нативного фермента составляет соответственно 75,5%,
61,7%, 27,5%, 24,7%, 17,8%, 14,5% и 9,9%.
Установлено, что для иммобилизованной инулиназы оптимальная
температура гидролиза субстрата смещается в сторону более высоких значений
с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного
фермента. Свободная и иммобилизованная на исследуемых ионитах инулиназа
проявляет наивысшую каталитическую способность при pH 4,5-4,7.
Сравнительный анализ значений основных кинетических параметров
реакций гидролиза инулина иммобилизованными препаратами инулиназы из
Kluyveromyces marxianus позволяет нам заключить, что наибольшую
каталитическую активность проявляет инулиназа, адсорбированная на
макропористой анионообменной смоле АВ-17-2П.
Показано, что инулиназа, иммобилизованная на ВИОН КН-1, эффективно
расщепляет содержащийся в экстракте топинамбура (Helianthus tuberosus)
инулин в модельном реакторе пролонгированного действия. Установлено, что
каталитическая активность фермента и содержание белка в иммобилизованном
180
на ВИОН КН-1 препарате, который находился в стадии хранения в
лабораторных условиях, не изменялись на протяжении 2 лет.
Таким образом, полученные нами гетерогенные препараты инулиназы,
вероятно, позволят получать 95%-ные фруктозные сиропы не только из
химически чистого инулина, но и из вытяжек инулинсодержащих растений:
топинамбура, цикория, девясила, одуванчика, спаржи. Иммобилизация на
синтетических полиэлектролитах сделает препарат пригодным для
многократного использования в реакторах непрерывного и периодического
действия, а также упростит процедуру хранения фермента.
При дальнейшем продолжении исследований по нашей теме и
масштабировании экспериментов до уровня пилотных установок и опытных
производств мы, возможно, сможем предложить инновационный гетерогенный
препарат инулиназы для получения фруктозы как одного из важнейших
продуктов функционального питания для детерминированных групп населения,
а также профилактических средств таких заболеваний, как сахарный диабет,
кариес и ожирение.
Литература
1.
Жеребцов Н.А. Биохимия / Н.А. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г.
Артюхов. – Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2002. – 696 с
2.
Zittan L. Enzymatic hydrolysis of inulin - an alternative way to fructose
production / L. Zittan // Die Starche. – 1981. – Vol. 33, № 11. – P.373-377.
3.
Абелян В.А. Иммобилизация микробной инулиназы на различных
носителях / В.А. Абелян, Л.С. Манукян // Прикладная биохимия и
микробиология. – 1992. – Т. 28, № 3. – С. 356-361.
4.
Голубев
В.Н.
Биотехнологические
аспекты
переработки
топинамбура / В.Н. Голубев, В.П. Кулев // Пищевая Промышленность. – 1991. –
№ 9. – С. 52-53.
5.
Enzymatic production of inulo-oligosaccarides from chicory juice / J.P.
Park [et al.] // Biotechnol. Lett. – 1998. – Vol. 20. – № 4. – P. 385-388.
6.
Singh R.S. Partial purification and characterization of exoinulinase from
Kluyveromyces marxianus YS-1 for preparation of high-fructose syrup / R.S. Singh,
D. Rajesh, P. Munish // J. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 17, № 5. – P. 733–
738.
7.
Зеленков В.Н. Многоликий топинамбур в прошлом и настоящем /
В.Н. Зеленков, С.С. Шаин. – Новосибирск: Концерн «ОИТ» - НФТ «АРИС»,
СО РАМН, 2000. – 241 с.
181
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛИПАЗЫ НА РАСТВОРИМЫХ НОСИТЕЛЯХ,
ПРИМЕНЯЕМЫХ В МЕДИЦИНСКОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ
ПРАКТИКЕ
Ковалева Т.А., Беленова А.С., Шаталов Г.В., Сливкин Д.А., Сливкин А.И.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Липаза (КФ 3.1.1.3), осуществляющая гидролиз триглицеридов,
используется в заместительной энзимотерапии, а также в качестве агента,
специфически разрушающего нежелательные продукты обмена веществ в
организме человека [1]. Применение энзиматических препаратов на основе
иммобилизованных ферментов приводит к уменьшению степени аллергенности
и способствует пролонгированию действия лекарств. В связи с этим особую
значимость приобретает поиск новых носителей, которые сами по себе
являются
самостоятельными
лекарственными
средствами.
Поли-Nвинилпирролидон – аморфный линейный полимер, получаемый радикальной
полимеризацией, он входит в состав дезинтоксикантов, а также применяется
для модификации свойств липосом. Создание ноночастиц на основе поли-Nвинилпирролидона с антиангиогенными препаратами белковой (ангиостатин,
эндостатин) и небелковой (силимарин, силибинин) природы позволило
значительно повысить эффективность их противоопухолевого действия [2].
В этой связи нами была проведена иммобилизация липазы на поли-Nвинилпирролидоне.
В
качестве
носителей
использовали
поли-N-винилпирролидон
.
-4
(медицинский) с молекулярной массой 1,0 10 моль/л.
Адсорбционную иммобилизацию липазы осуществляли добавлением к 2
мл раствора липазы (10-3 моль/л) 10 мг носителя и оставляли на 2 часа (250С)
при постоянном перемешивании.
Определение количества белка в препарате свободной липазы
осуществляли методом Лоури, в иммобилизованном ферменте –
модифицированным методом Лоури [3].
Каталитическую активность свободной и иммобилизованной липазы
измеряли при помощи метода Андерсона-Маккарти. За единицу
каталитической активности принимали количество жирных кислот,
образованных в единице объема гидролизата за единицу времени [4].
Активность липазы рассчитывали по формуле:
А = а/t в,
где А – каталитическая активность, ед/мг; а – количество жирных кислот,
мкмоль; t – время гидролиза, мин; в – содержание белка в препарате, мг. При
расчете активности иммобилизованного фермента учитывали содержание белка
в 1 г носителя.
182
Показано, что иммобилизованная липаза сохраняет 79% активности
нативного фермента.
Снижение каталитической активности липазы при иммобилизации может
быть обусловлено уменьшением степени мобильности третичной структуры,
ответственной за образование фермент-субстратного комплекса.
Выявлено (рис. 1), что температурный оптимум свободного фермента
составляет 37 оС. При связывании энзима с носителем оптимальная
температура гидролиза смещается в сторону более высоких значений и
составляет 40 оС.
Рис. 1. Зависимость каталитической активности свободной (1) и
иммобилизованной липазы (2) от температуры гидролиза:
Известно [5, 6], что при иммобилизации фермента происходит фиксация
его каталитически активной конформации. Причем, чем больше возникает
связей, тем выше оптимальная температура ферментативной реакции.
При анализе зависимости каталитической активности свободной и
иммобилизованной липазы от pH субстрата установлено, что свободная и
иммобилизованная
на
поли-N-винилпирролидоне
липаза
проявляет
оптимальную каталитическую активность при pH 7,0 (рис. 2).
Каталитическая активность иммобилизованной липазы достоверно выше,
чем у нативного фермента в диапазоне значений pH от 4,0 до 6,0. Это может
быть обусловлено протонированием группы >C=О пирролидонового цикла
поли-N-винилпирролидона [7], что возможно приводит к изменению
взаимодействий в комплексе липаза-носитель и способствует увеличению
скорости образования фермент-субстратного комплекса при pH 4,0 - 6,0.
183
Рис. 2. Зависимость каталитической активности свободной (1) и
иммобилизованной липазы (2) от pH среды:
Анализ полученных результатов по иммобилизации липазы на поли-Nвинилпирролидоне позволяет считать его перспективным носителем для
иммобилизации ферментов с целью получения растворимых, стабильных по
отношению к низким значениям pH и высокоактивных лекарственных
препаратов пролонгированного действия.
Литература
1. Брокерхоф К. Липолитические ферменты /К. Брокерхоф, Р. Дженсен. –
М.: Мир, 1978. – 396 с.
2. Кирш Ю.Э. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды /
Ю.Э. Кирш. – М.: Наука. – 1998. –252 с.
3. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H.
Lowry, N.J. Rosebrougn, A.L. Farr, R.J. Randall // J Biol Chem. – 1951. – V.193,
№1. – P. 265-275.
4. Anderson M.M. Rapid and sensitive assay for free fatty acids using
rodamine 6G / M.M. Anderson // Anal. Biochem. – 1972. – V.45, №1. – P. 271-276.
5. Иммобилизованные
ферменты.
Современное
состояние
и
перспективы: в 2т. / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинек. – М.:
Изд-во МГУ, 1976. – Т.1. – 296 с.
6. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. – М.: Мир,
1983. - 213 с.
7. Кирш Ю.Э. Роль структуры поли-N-виниламидов в реакции
кислотного гидролиза / Ю.Э. Кирш, Н.В. Семина, Н.А. Януль, Г.В. Шаталов //
Журнал физической химии. – 1997. – Т. 68, №9. – С. 1584-1586.
184
ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ И ПСИХОТРОПНАЯ
АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ХИНАЗОЛИНОНА-4, ПОЛУЧЕННЫХ
НА ОСНОВЕ ГАМК И ЭПСИЛОН-АМИНОКАПРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Кодониди И.П., Кулешова С.А., Арльт А.В., Ротенко А.А., Муцуева С.Х.,
Ивченко А.В., Ивашев М.Н. e-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Целью наших исследований является целенаправленный синтез новых
производных хиназолинона-4 на основе ГАМК и эпсилон - аминокапроновой
кислоты, а также изучение психотропной активности полученных веществ [1].
Анализ результатов прогноза фармакологической активности с помощью
программы
PASS
[2]
свидетельствует
о
наиболее
вероятной
противосудорожной, седативной и психотропной активности для веществ 4-(2фенил-4-оксохиназолил)-бутановая к-та (лаб. шифр QPhGABA) в сравнении с
веществом 4-(2-фенил-4-оксохиназолил)-гексановая к-та (лаб. шифр QPhε-AK)
(табл. 1). Соединение QPhGABA характеризуется более высокой вероятностью
проявления психотропной и противосудорожной активности, что может быть
связано с присутствием в молекуле остатка ГАМК.
Таблица 1.
Прогноз фармакологической активности с помощью компьютерной
системы PASS
Прогнозируемые соединения
Прогнозируемый вид фармакологической активности QPhGABA
Противосудорожная
Седативная
Снотворная
Психотропная
Миорелаксирующая
Анальгетическая
Противовоспалительная
Транквилизирующая
Ноотропная
80
79
56
72
58
55
49
47
43
QPhε-AK
49
66
50
56
62
28
39
39
38
Синтез целевых продуктов осуществлен путѐм замены гетероатома
кислорода на азот в молекуле 2-фенилбензоксазинона-4 взаимодействием с
соответствующими аминокислотами. В качестве аминной компоненты для
синтеза соединения QPhGABA использовалась γ-аминомасляная кислота, а для
QPhε-AK - ε-амино-капроновая кислота.
Первичный фармакологический скрининг осуществлен методом
«открытое поле» и теста, определяющего продолжительность «нембуталового
185
сна» [3]. В качестве препарата сравнения использовался феназепам в дозе,
сопоставимой с суточной дозой для человека [4].
В тесте «открытое поле» вещество QPhGABA достоверно снижало
количество пересеченных секторов на 57,6% относительно контроля, но в
меньшей степени, чем препарат сравнения феназепам (на 73,6%). При введении
QPhε-AK также наблюдалась тенденция к снижению двигательной активности,
но изменения в группе были недостоверны. Все исследуемые вещества
оказывали слабое противотревожное действие в сравнении с феназепамом по
времени нахождения в центре. По числу актов груминга этот эффект был более
выражен на фоне исследуемых веществ (рис 1).
Результаты изучения синтезированных производных хиназолинона-4 в тесте
"Открытое поле"
25
Количество
20
Центр
15
сектора
стойки
10
груминг
дефекации
5
0
контроль
феназепам
0,22мг/кг
QPhGABA
50 мг/кг
QPhe-AK
50 мг/кг
Рис. 1.
В условиях «нембуталового сна» вещество QPhGABA достоверно
относительно контроля пролонгировало сон на 103,7%, в то время как
феназепам увеличивал этот показатель на 46,5%. Вещество QPhε-AK время сна
повышало недостоверно, однако наблюдалась тенденция к увеличению
продолжительности сна на 28,5% в сравнении с контролем (рис 2).
Влияние синтезированных производных хиназолинона-4 на
продолжительность "нембуталового сна"
***##
300
Время сна(мин)
250
**
200
150
100
50
0
контроль
феназепам 0,22 мг/кг
QPhGABA 50 мг/кг
Рис. 2.
186
QPhe-AK 50 мг/кг
Примечание:
**-р<0,01-достоверно относительно контроля;
***-р<0,001-достоверно относительно контроля;
##-р<0,01-достоверно относительно препарата сравнения.
Вывод: результаты первичного фармакологического скрининга в
определенной степени подтверждают компьютерный прогноз биологической
активности синтезированных соединений,
вещество 4-(2-фенил-4 оксохиназолил)-бутановая кислота обладает выраженным психоседативным
действием.
Литература
1.
Э. Т. Оганесян и др. Кубанский научный медицинский вестник.2009.-№2.- С. 37-40.
2.
Филимонов Д.А., Поройков В.В. (2006). Российский химический
журнал, 50 (2), 66-75.
3.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ. – 2-е изд., перераб. и доп./ Под ред. Р.У.
Хабриева. – М.:Медицина,2005. – С.41-47.
4.
Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. –
15-е изд. перераб., испр. и доп. – М.: РИА «Новая Волна», 2007. – С. 76-77.
187
ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ
СУЛЬФОНАМИДОПОЛИХЛОРЭТИЛИРОВАННЫХ ГЕТАРЕНОВ
ДЛЯ ЗАЩИТЫ НАСЕЛЕНИЯ ОТ НАСЕКОМЫХ И КЛЕЩЕЙ
Козлова Ю.А.1 , Никитин А.Я.1 , Кондрашов Е.В.2, Левковская Г.Г.2,
Рудякова Е.В.2, Германт О.М.3, Шашина Н.И.3 e-mail: [email protected]
1
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт
Сибири и Дальнего Востока
2
Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН
3
НИИ дезинфектологии
Дезинсекция химическими соединениями в качестве меры борьбы с
переносчиками возбудителей особо опасных болезней прочно вошла в практику
профилактической медицины. Необходимость поиска новых пестицидов
определяется
рядом
причин:
неизбежностью
возникновения
у
членистоногих резистентности к применяемым ядам, что предполагает
включение в цепи ротации неиспользовавшихся ранее пестицидов;
потребностью общества в переходе к менее опасным для окружающей
среды соединениям и уменьшению себестоимости их производства и т.д.
Появился ряд работ, указывающих на физиологическую активность, в том
числе, наличие свойств пестицидов у производных сульфонамидов,
гетаренов и сульфонамидополигалогенэтилированных гетаренов [1-4].
Нами проведена скрининговая оценка инсектицидной активности 20
сульфонамидополихлорэтилзамещенных гетаренов на двух видах инсектарных
блох и 13 – на самках таежного клеща, собранных в природе. Для синтеза
целевых С-амидополихлорэтилированных гетаренов использованы реакции
высокоэлектрофильных
иминов
полигалогенальдегидов
с
гетероароматическими соединениями, такими как пиразолы, пирролы, индолы,
тиофены.
RSO2NCl2
+
CHCl=CXCl
-Cl2
RSO2N=CHCXCl2
R''
Y
N
R'
RSO2NH CHCCl2X
R'
N
N
N
R'
R'
CHCCl2X
NHSO2R
N
Y
S
RSO2NHCHCCl2X
RSO2NHCHCCl3
R'
Y
N
N
N
R'
R''
R=Ph, 4-MeC6H4, 4-ClC6H4, CF3; X=Cl, H, Ph; R'=Alk, Ar, Bn; Y=H, Alk, Hlg
188
S
Y
Несколько синтезированных образцов обладали либо инсектицидной,
либо акарицидной эффективностью, которая была ниже, чем у коммерческих
пестицидов, использованных в качестве положительного контроля. Один
образец – продукт трифторметилсульфонамидотрихлорэтилирования пиррола,
обладал достаточно высокой инсектоакарицидной активностью. В целом, по
исследованным
гетаренам,
сделан
вывод,
что
сульфонамидополихлорэтилированные производные пиррола несколько
активнее в отношении блох, а индола – клещей.
По существующим нормативам [5] все изученные образцы не подходят
для применения в качестве действующих веществ в средствах индивидуальной
защиты людей от нападения клещей. Вместе с тем, два соединения (Ссульфонамидоалкилированый индол и трифторметилсульфонамидотрихлорэтилированый пиррол) могут быть перспективны для разработки средств
борьбы с таежным клещом в природных биотопах.
До настоящего времени синтез новых пестицидов производится без
предварительного учета возможного механизма их действия на биологические
объекты. К сожалению, отбор лучших пестицидов на основе средних оценок
инсектицидной и акарицидной эффективности химических групп осложняется
высоким внутриклассовым разбросом изучаемых показателей. Однако этап
«накопления» данных о физиологической активности отдельных химических
групп необходим и в перспективе может позволить связать пути поиска новых
инсектоакарицидов с особенностями их молекулярного строения, прогнозом
механизмов биологического действия.
Литература
1. Очиров Ю.Д., Зарубина В.Н., Жовтый И.Ф. и др. Современные аспекты
профилактики зоонозных инфекций. – Иркутск, 1984. – Т. 1. – С. 101-103.
2. Мирскова А.Н., Дроздова Т.И., Левковская Г.Г. и др. Физиологически
активные вещества. – Киев, 1989. – С. 84-86.
3. Грапов А.Ф. Успехи химии. – 1999. – Т. 68. – С.773-784.
4. Никитин А.Я., Дроздова Т.И., Мирскова А.Н. и др. Сибирь-Восток,
Иркутск. – 2005. – № 3. – С. 13-16.
5. МУ 3.5.2.1759–03. – М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004. – 87 с.
189
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА СТЕРОИДНЫХ САПОНИНОВ
ЯКОРЦЕВ СТЕЛЮЩИХСЯ
Козлова О.И., Богачук М.Н. e-mail: [email protected]
НИИ питания РАМН
Возросший в последние годы интерес к изучению стероидных сапонинов
объясняется их широким спектром биологической активности [9]. Многие
фармакологические исследования различных препаратов стероидных
сапонинов, проведенные в последние годы, подтверждают многочисленные
лечебные свойства этих биологически активных веществ, а именно:
гиполипидемическую, фунгицидную, антимикробную, противоопухолевую и
противораковую активность [2].
Несмотря на предпринимаемые усилия, химический состав стероидных
сапонинов изучен недостаточно, а возможность их использования в фармации
не реализована в полной мере. Так препараты стероидных сапонинов в
отечественной медицине представлены «Полиспонином» (экстракт из
корневищ Диоскореи ниппонской) и «Трибуспонином» (экстракт из травы
Якорцев стелющихся) [10], обладающими согласно данным производителя,
антисклеротическим действием. Ограничение производителем только
антисклеротическим действием связано как раз с недостаточной изученностью
химического состава стероидных сапонинов. Также экстракт из корневищ
Диоскореи ниппонской и экстракт из Якорцев стелющихся входит во многие
биологически активные добавки к пище.
Целью нашей работы являлась разработка методики качественного и
количественного определения стероидных сапонинов на основе лекарственного
растительного сырья Якорцев стелющихся методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Методы и материалы:
Для достижения поставленной цели нам был использован обращенофазный вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим и масс-селективным
детектированием.
Была использована следующая хроматографическая система: жидкостной
хроматограф Agilent 1100 Series с дегазатором, насосом, обеспечивающим
одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического
ввода проб (автосемплером), термостатом хроматографических колонок,
диодноматричным детектором и масс-детектором LC/MSD Trap SL (ионная
ловушка с ионизацией электроспреем). Хроматографичекская колонка: Atlantis
C18, 4,6х250 мм, 5мкм.
Для приготовления подвижной фазы использовали следующие реактивы:
ацетонитрил марки Ultra Gradient Grade, бидистиллированная вода,
трифторуксусная кислота (99%) марки «ОСЧ», вода деионизованная (Milli-Q
Academic).
190
Для экстракции стероидных сапонинов использовали метанол марки
ЧДА.
Подготовка проб.
В качестве объектов исследования выступали: трава Якорцев
стелющихся, лекарственное средство «Трибестан», биологически активная
добавка к пище «Триболимп», экстракт травы Якорцев стелющихся.
Объекты исследования измельчались в лабораторной мельнице. Далее
проводилась экстракция стероидных сапонинов 70% метанолом при 80˚С 5
минут, после чего пробу озвучивали в течение 5 минут и охлаждали до
комнатной температуры. Около 1,5 мл полученного экстракта переносили в
пробирку типа «эппендорф» и помещали в центрифугу (14000 об/мин) на 5
минут. Супернатант отбирали во флакон (виалу) и исследовали.
Условия хроматографирования и детектирования.
С учетом физико-химических свойств стероидных сапонинов и
литературных данных [1, 3, 5, 6, 7, 8] для анализа было предложено
использовать обращено-фазовый вариант ВЭЖХ. С целью лучшего разделения
стероидных сапонинов и компонентов матрикса было использовано
градиентное элюирование смесью ацетонитрила и деионизированной воды,
подкисленной трифторуксусной кислотой до рН=3,0. Скорость потока
подвижной фазы составляла 0,9 мл/мин. Объем ввода 5 мкл. Регенерация
колонки занимала 7 мин. Общее время анализа составило 53 минуты.
Подкисление трифторуксусной кислотой осуществляли с целью
улучшения разделения и для достижения оптимальной ионизации на массдетекторе.
С учетом наличия несопряженных двойных связей (одной или двух в
зависимости от вида стероидного сапонина) для детектирования на
спектрофотометрическом детекторе нами была выбрана длина волны 205 нм.
Параметры масс-детектирования: режим сканирования ионов –
позитивный; диапазон масс сканируемых ионов – от 400 до 1500 m/z; Nebuliser
70.0 psi; Dry gas 12.0 l/min; Dry Temp 350ºC.
Идентификацию протодиосцина на хроматограмме осуществляли путем
сравнения со стандартом времени удерживания. Подтверждение протодиосцина
проводилось по основному иону 1031 ([М+Н-Н2О]+) и по характерной
фрагментации этого иона на дочерние ионы.
Результаты и обсуждение.
Стероидные сапонины Якорцев стелющихся отличаются друг от друга в
основном сахарными остатками и радикалами, поэтому их хроматографическое
поведение сходно. Время удерживания основных стероидных сапонинов
составило от 29 минут до 34 минут. Преобладающим компонентом является
протодиосцин. Его время удерживания составило 31,2 минуты.
Использование
масс-спектроскопического
детектора
позволяет
существенно повысить селективность и чувствительность метода. При массдетектировании происходит дробление основного иона протодиосцина 1031
([М+Н-Н2О]+) на дочерние ионы. В результате последовательной потери воды,
остатка глюкозы, двух остатков рамнозы, второго остатка глюкозы образуется
191
набор характерных ионов, молекулярные массы которых (m/z) 397,1; 415,1;
577,2; 723,3; 739,1; 869,1; 885,1.
В результате проведенных исследований был установлен состав
стероидных
сапонинов
Якорцев
стелющихся.
Были
обнаружены:
трибулосапонин В, метилпротодиосцин, террестрозин Н, прототрибестин,
грациллин и др. Содержание стероидных сапонинов в пересчете на
протодиосцин находилось в диапазоне от 0,62 % в траве Якорцев и до 16,2% в
экстракте.
Заключение.
При помощи разработанной методики был установлен состав стероидных
сапонинов в траве Якорцев стелющихся. Большинство стероидных сапонинов
Якорцев стелющихся, были найдены и в продуктах на их основе: экстракте
Якорцев, лекарственном средстве «Трибестан» и биологически активной
добавке к пище «Триболимп».
Это указывает на возможность разработки метода стандартизации
лекарственного растительного сырья Якорцев стелющихся и в препаратов на их
основе на основе предложенной методики. Подобный метод стандартизации
позволит более эффективно проводить контроль качества лекарственного
растительного сырья Якорцев стелющихся и препаратов на их основе.
Литература
1. Bedir, E., Khan, I., 2000. New steroidal glycosides from the fruits of Tribulus
terrestris. J. Nat. Prod. 63, 1699-1701.
2. Cai, L., Wu, Y., Zhang, J., Pei, F., Xu, Y., Xie, S., Xu, D., 2001. Steroidal
saponins from Tribulus terrestris. Planta Med. 67, 196-198.
3. Combarieu, E. De., Fuzzati, N., Lovati, M., Mercalli, E., 2003. Furostanol
saponins from Tribulus terrestris. Fitoterapia 74, 583-591.
4. Conrad, J., Dinchev, D., Klaiber, I., Mika, S., Kostova, I., Kraus, W., 2004. A
novel furostanol saponin from Tribulus terrestris of Bulgarian origin. Fitoterapia 75, 117122.
5. Dinchev, D., Janda, B., Evstatieva, L., Oleszek, W., Aslani, M. R., Kostova, I.,
2008. Distribution of steroidal saponins in Tribulus terrestris from different geographical
regions. Phytochemistry 69, 176–186.
6. Ganzera, M., Bedir, E., Khan, I.A., 2001. Determination of steroidal saponins in
Tribulus terrestris by reversed-phase high-performance liquid chromatography and
evaporative light scattering detection. J. Pharm. Sci. 90, 1752-1758.
7. Huang, J.-W., Tan, C.-H., Jiang, S.-H., Zhu, D.-Y., 2003. Terrestrinins A and B,
two new steroid saponins from Tribulus terrestris. J. Asian Nat. Prod. Res. 5(4), 285–290.
8. Kite, G. C., Porter, E. A., Simmonds, M. S.J., 2007. Chromatographic behavior
of steroidal saponins studied by high-performance liquid chromatography–mass
spectrometry. J. Cromatography A 1148, 177-183.
9. Kostova, I., Dinchev, D., 2005. Saponins in Tribulus terrestris – chemistry and
bioactivity. Phytochem. Rev. 4, 111–137.
10. Государственный реестр лекарственных средств, том I / М.: 2002.
192
СИНТЕЗ ВИЦИНАЛЬНЫХ АЗИДОИОДИДОВ ДЕЙСТВИЕМ СИСТЕМЫ
NAN3-I2 НА АЛКЕНЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ
АКТИВНОСТИ АЗИДОИОДИДОВ
Кокорекин В.А. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
В ходе поиска удобных, экономичных и безопасных методов синтеза
вицинальных азидоиодидов обнаружено, что данные соединения получаются
при комнатной температуре в течение 2-4 часов с выходом до 77%, без
применения
катализаторов
и
дорогостоящих
растворителей
при
взаимодействии алкенов с азидом натрия и иодом в метаноле, в растворе
метанол-вода или в растворе вода-метанол-тетрагидрофуран [1].
В результате из алкенов, стиролов, енол-эфиров и сложных эфиров был
синтезирован ряд вицинальных азидоиодидов, представленных в таблице.
N3
I
N3
I
2
74%
1
74%
I
I
N3
N3
4
77%
3
72%
N3
N3
N3
I
I
I
I
6
76%
5
75%
I
N3
N3
O
O
7
72%
8
71%
O
O
N3
N3
O
9
73%
OMe
N3
OEt
I
I
10
63%
I
11
65%
193
OMe
12
62%
Общая методика синтеза: 0,4 г исходного алкена растворяли в смеси 10
мл MeOH (EtOH в опыте №11) и 3 мл H2O (при необходимости для
гомогенизации добавляли 2 мл тетрагидрофурана). При температуре 20-25 °С
добавляли NaN3 (3-4 моль/1 моль алкена) и затем, при перемешивании, I2 (1-2
моль/1 моль алкена). Перемешивали реакционную массу 2-4 часа, добавляли 50
мл CH2Cl2 и 30 мл H2O, отделяли слой CH2Cl2, промывали 5% водным
раствором Na2S2O5 до обесцвечивания (осторожно, интенсивное выделение N2!)
и снова H2O 2×20 мл. Сушили над MgSO4. Выделяли с использованием
колоночной хроматографии. Строение продуктов подтверждено данными
спектров ЯМР 1Н и 13С, а также методом элементного анализа.
На примере модельных азидоиодидов (1-4) методом диффузии в агар
была определена их антимикробная активность с использованием следующих
тестовых штаммов: Staphylococcus aureus ATCC 29213, mR Staphylococcus
aureus ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Candida albicans CBS 8837 и Aspergillus niger 37а. Установлено,
что данные вещества наиболее активны в отношении тестовых штаммов
Candida albicans CBS 8837 и Aspergillus niger 37а. Минимальная подавляющая
концентрация для всех исследуемых образцов составляет 0,5 мкг/мл. В
отношении Staphylococcus aureus ATCC 29213 и Escherichia coli ATCC 25922
эффект подавления роста незначительный и проявляется при более высоких
концентрациях веществ (5-50 мкг/мл), в отношении mR Staphylococcus aureus
ATCC 43300 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 активность не
наблюдалась.
Литература
1.
Facile Method for the Synthesis of Vicinal Azidoiodides by the Reaction
of the NaN3-I2 System with Unsaturated Compounds / A.O. Terent'ev, I. B. Krylov,
V.A. Kokorekin, G.I. Nikishin // Synthetic Communications. 2008. v.21. p.3797-3809
194
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ
ДИСПЕРСИИ КОМПЛЕКСОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С
РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ
Кондрашина О.В.1, Быков В.А.2, Сливкин А.И.1
e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова
1. Действие ионов редкоземельных металлов (Gd, La, Sm, Nd) на
двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот сопровождается заметным
искажением формы спектра КД; в случае ДНК модифицированный спектр КД
аналогичен спектру Z-формы; высказано предположение, согласно которому
при взаимодействии сильно гидратированных ионов редкоземельных металлов
с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами наблюдается искажение
параметров их вторичной структуры.
2. Молекулы двухцепочечных нуклеиновых кислот, модифицированные
ионами редкоземельных металлов не образуют упорядоченных, оптически
активных, холестерических жидкокристаллических дисперсий при их фазовом
исключении
из
водно-солевого
раствора
нейтрального
полимера
полиэтиленгликоля (ПЭГ).
3. Молекулы нуклеиновых кислот, фиксированные в пространственной
структуре частиц холестерических жидкокристаллических дисперсий
взаимодействуют с ионами различных редкоземельных элементов. При этом
наблюдается двух-трехкратная амплификация аномальной полосы в спектре КД
жидкокристаллических дисперсий комплексов нуклеиновых кислот с ионами
редкоземельных элементов. Причины этого оптического эффекта обсуждаются.
4. Молекулы двухцепочечных нуклеиновых кислот в составе
жидкокристаллических дисперсий, обработанные ионами редкоземельных
металлов, были включены в состав полимерного геля. Аномальная оптическая
активность дисперсий в составе гелей сохраняется в течение длительного
времени. Такие гели могут быть использованы как оптические фильтры для
калибровки дихрометров, а также в качестве биосенсоров для определения
биологически важных соединений.
Учитывая
аналогичный
характер
«оптического
поведения»
использованных нами солей редкоземельных элементов, и принимая во
внимание специфические магнитные свойства ионов гадолиния, были оценены
магнитные свойства именно этих ионов в составе частиц ЖКД дцДНК.
Для этой цели измерена температурная зависимость магнитной
проницаемости (χ = Pm/H) частиц холестерической ЖКД дцДНК,
обработанной GdCl3 (или LaCl3) .Полученный результат говорит о заметном
различии в магнитных свойствах частиц ЖКД, сформированных из дцДНК и
обработанных GdCl3 или LaCl3, соответственно. Такое отличие соответствует
различиям в магнитных свойствах этих ионов. Известно, что магнитная
195
восприимчивость содержит вклады от парамагнитных и диамагнитных центров.
В нашем случае парамагнитными центрами являются ионы Gd 3 +, связанные с
дцДНК в составе частиц ЖКД.
Диамагнитный
вклад, как ожидается,
будет вызван образцами,
3 +
3 +
содержащими свободные ионы Gd
или La
, потому что эти ионы
немагнитны и необходимы для диамагнитной части восприимчивости.
Диамагнетизм
был принят во внимание при вычислении «чистого»
парамагнитного момента Gd3 + ионов [1].
Число парамагнитных центров (N*; N* = 3x k x Ccw / μeff) , то есть
количество
Gd3 + в 4f7-состоянии
было рассчитано на основании
температурной зависимости магнитной восприимчивости, которая измеряли в
диапазоне температур от 50К до 300К, т.е. в диапазоне температур, в которой
наблюдается линейная зависимость от 1/T. Величина Ccw была вычислена по
уравнению: χ=χ0 + Ccw / (T- θ)
с использованием процедуры подгонки
теоретической кривой к экспериментальным данных. Учитывая тот факт, что
эффективный магнитный момент одного иона Gd3 + (μeff ) составляет 7.94 μB, а
константа Кюри - Вейса (Ccw ), рассчитанная из температурной зависимости
магнитного момента, равна 99.6x10-6 эргK/Э2, количество (N *) ионов Gd3 + в
образце составляет 7.64 x1018 штук [2].
Магнитные измерения показали, что концентрация ионов Gd 3 + в
растворе, полученном после промывки частиц ЖКД ДНК, обработанных
GdCl3, была незначительной. Это свидетельствует о том, что ионы Gd3 +
прочно связаны с молекулам ДНК.Однако, мультивалентные ионы Gd3 + не
только экранируют электростатическое взаимодействие между молекулами
ДНК. Эти ионы играют комплексную роль во взаимодействии ДНК и ДНК.
Действительно, появление
не скомпенсированного положительного
поверхностного заряда на молекулах дцДНК стимулирует дополнительное
взаимодействие между соседними молекулами ДНК. Кроме того, появление
поверхностного заряда на частицах ЖКД может приводить к стабилизации
пространственной структуры этих частиц после их обработки GdCl3.
Литература
1.
С.В. Акулиничев, Ю.М. Евдокимов, В.И. Салянов, О.В. Кондрашина,
В.М. Скоркин. Новый биоматериал
на основе частиц холестерической
жидкокристаллической дисперсии комплекса
(ДНК-Gd) . 1. Опрделение
концентрация гадолиния в частицах.//Препринт ИЯИ-1168/2006, июль 2006
2.
В. Н. Никифоров, А.В. Ручкин, О.В. Кондрашина, И.В. Решетов,
Ю.М. Евдокимов. Магнитные свойства Gd3+ ионов в молекулах ДНК,
упорядоченных в частицах жидкокристаллической дисперсии. Медицинские
аспекты применения. Тезисы докладов II-го евразийского конгресса по
медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2005». Россия, г.
Москва, 21-24 июня, 2005, с 58.
196
МАГНИТНЫЕ СВОЙСТВА ГИБРИДНОГО
ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОГО МЕТАЛЛОРГАНИЧЕСКОГО
НАНОСОЕДИНЕНИЯ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО
ВЕЩЕСТВА КАК ВОЗМОЖНОСТЬ УПРАВЛЕНИЯ ЕГО ДИФФУЗИЕЙ
В ТКАНЯХ ОПУХОЛЕЙ
Кондрашина О.В.1, Быков В.А.2, Сливкин А.И.1
e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова
Материал
представляет
собой
частицы
холестерической
жидкокристаллической
дисперсии
комплексов
двухцепочечных
дезоксинуклеиновых кислот с редкоземельным элементом гадолинием (далее
ХЖКД-Gd).
Этому
нанотехнологическому
гибридному
металлорганическому
материалу присущи следующие технические характеристики, позволяющие
использовать его в различных областях техники, а также в биологии и
медицине:
материал является лиотропной холестерической ЖК дисперсией,
характеризующейся аномальной оптической активностью;
материал стабилен во времени, т.е. не утрачивает своих свойств в
течение года;
материал стабилен в температурном интервале от 0 до 50 ºС;
материал нетоксичен, слаборастворим в воде (ПРGdPO4~10-12);
материал
характеризуется
широким
интервалом
условий
существования (концентрация NaCl от 0,001 до 3,0 М, концентрация
полиэтиленгликоля от 0,5 до 200,0 мг/мл;
контролируемое и регулируемое (от 5 до 40%) содержание атомов
металла, локальная концентрация гадолиния в образующихся частицах может
достигать 400 мг/мл и более;
возможность
контроля
свойств
материала
при
помощи
спектроскопии кругового дихроизма (спектр КД);
размер частиц дисперсии (~ 500 нм) достаточен для внутритканевого
введения.
Указанные технические характеристики достигаются за счет того, что
ХЖКД-Gd материал, создается на основе дисперсии двухцепочечных молекул
ДНК низкой молекулярной массы, сформированной в водно-солевом растворе,
содержащем полимер на основе полиоксиэтилена.
В работе [1] высказано предположение, согласно которому частицы
комплекса ХЖКД-Gd могут быть использованы нейтрон-захватывающей
терапии опухолевых заболеваний. Такая возможность основана на том, что
реакция захвата 157Gd (n, ) 158Gd, которая происходит при облучении потоком
197
тепловых нейтронов образцов биоматериала, содержащего Gd, сопровождается
излучением электронов и гамма-квантов. Это вторичное излучение может
разрушить клетки опухоли вблизи частицы биоматериала.
Наночастицы ХЖКД-Gd могут быть иммобилизованы в составе
синтетического слабосшитого полимерного гидрогеля, в частности, гидрогеля
бис-метакрилата полиэтиленгликоля. Гидрогель имеет регулярный сетчатый
рельеф с диаметром ~ 5-20 мкм (статистическое распределение диаметров), что
может моделировать состояние, когда частица ХЖКД-Gd находится в просвете
капилляра в ткани опухоли. Иммобилизованные в гидрогель наночастицы
ХЖКД-Gd получают по методике [2].
Учитывая специфические магнитные свойства ионов гадолиния, было
проведено исследование магнитной восприимчивости частиц и возможности
управления ими с помощью сильного магнитного поля внутри системы,
моделирующей просветы капилляров. Полученный материал помещали в
кварцевую оптическую кювету (высота кюветы 3 см., высота заполнения гелем
с ХЖКД-Gd 1см). Затем осторожно добавляли гель без ХЖКД-Gd методом
наслоения до заполнения кюветы (толщина геля – 0,5 см; СДНК = 20,0 мкг/мл;
CNaCl = 0,3 M; СGd=3·10-4 М; СEu=5·10-14 М).
Европий, давно используемый как флуоресцентная метка, переизлучает с
340 на 618 нм. В этой области волн ни ДНК, ни полиэтиленгликоль не
поглощают, а следовые примеси Eu3+ в ХЖКД-Gd делают ее интенсивно
флюоресцирующей средой. Это приводит к интенсивному свечению нижней
части кюветы при облучении λ=340 нм.
Измерения магнитного момента намагниченного образца проводили на
сквид-магнитометре в магнитном поле 71,29 Тл. Однородное магнитное поле
создавали ниобий-титановой трубкой, находящейся в основной гелиевой ванне.
Магнитное поле измеряли датчиком Холла с точностью 2%, температуру – с
помощью Cu-CuFe термопары с точностью 0,1 К.
Методика изменения намагниченности заключалась в охлаждении
образцов ХЖКД-Gd комплекса в нулевом магнитном поле до температуры
кипения жидкого гелия с последующим включением намагничивающего поля и
измерением намагниченности (в неизменном поле) как функции температуры,
повышающейся вплоть до комнатных температур. После этого температуру
образца понижали и в том же поле регистрировали температурную зависимость
намагниченности вплоть до температуры жидкого гелия.
После двухчасового воздействия на гель с иммобилизованными
частицами снова проверяли флюоресценцию образца. Выяснилось, что
флюоресценция распространилась на участки, где изначально не было ХЖКДGd, т.е. произошла активная диффузия частиц под действием магнитного поля
внутри полимерной стеки.
Таким образом, можно с уверенностью сказать, что перемещением частиц
ХЖКД-Gd можно управлять с помощью сильного магнитного поля, что дает
основание говорить о возможности удерживания частиц в ткани опухоли на
время облучения с помощью постоянного магнита.
198
Литература
1.
Yu.M. Yevdokimov, V.I. Salyanov, O.V. Kondrashina, et. al. Particles of
liquid-crystalline dispersions formed by (nucleic acid – rare earth element)
coumplexes as a potential platform for neutron capture therapy. // Int. J. Biol.
Macromol. 2005. Vol. 37. P.165-173.
2.
Салянов В.И., Евсеев А.И., Попенко В.И., и др. Некоторые
характеристики комплексов гадолиния с линейной и жидкокристаллическими
формами ДНК. // Биофизика.2007. T. 52(3). C.452-459.
199
НОВЫЕ ЗАМЕЩЕННЫЕ КУМАРИНЫ И ФЛАВЕНЫ
НА ОСНОВЕ САЛИЦИЛОВЫХ АЛЬДЕГИДОВ
Коптева Н.И., Гончарова Ю.А., Иванова Н.А.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Замещенные кумарины и флавены вызывают повышенный интерес
исследователей как вещества, обладающие широким спектром биологического
действия.Они
проявляют
диуретическую,
антикоагулянтную,
спазмолитическую, противоопухолевую и другие виды физиологической
активности. Для синтеза таких веществ нами использовыаны замещенные
салициловые альдегиды как полифункциональные соединения с высокой
реакционной способностью. Осуществлено взаимодействие салициловых
альдегидов с замещенными ацетофенонами, в результате чего получены
производные флавена ряда I:
O
H
O
O
+
Y
2
Y
HCl
OH
X
X = H, 3-NO2, 5-NO2, 3-OCH3, 5-OCH3, 5-Br ;
X
O
I
Y = H, NO2, CH3, C2H5, Br, Cl
Y
Синтезированы также новые замещенные кумарины с пептидными и азагруппами по реакции п-арилазосалициловых альдегидов с диамидом и
дианилидом малоновой кислоты, а также морфолидом моноэтилового эфира
малоновой кислоты (соединения II, III, IV):
O
O
X
N N
C2H5OCOCH2CON
NH2
CH2(CONH2)2
O
OH
O
X
N N
O
II
O
N
O
CH2(CONHPh)2
O
NHPh
O
X
N N
O
O
X
N N
O
III
IV
X = H, OCH3, OC2H5, Br, NO2
Структура соединений I-IV подтверждена 1H ЯМР-и ИК-спектроскопии.
200
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОБЕГОВ
CALLISIA FRAGRANS WOOD. И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА
ЕГО ЖАРОПОНИЖАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ
Коренская И.М., Бузлама А.В., Куликова Т.Ю., Колосова О.А.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
В настоящее время в медицине и фармации возрастает интерес к ряду
комнатных растений, обладающих лекарственными свойствами. Callisia
fragrans Wood. (Каллизия душистая, «золотой ус») из сем. коммелиновые –
Commelinaceae культивируемое многолетнее суккулентное растение. Родиной
C. fragrans являются влажные леса юга Мексики, полуострова Юкатан и
Гватемалы. В России оно выращивается как декоративное растение в
домашних условиях, хорошо культивируется в условиях теплицы [1]. На
сегодняшний день в народной медицине известно более ста рецептов с
использованием Золотого уса при различных заболеваниях: масляные вытяжки
и спиртовые настойки, отвары, мази [2]. Экстракт из побегов C. fragrans входит
в ряд биологически активных добавок серии «Золотой ус»: бальзамы для тела
«Золотой ус с муравьиным спиртом», «Золотой ус с сабельником», «Золотой Ус
с пчелиным ядом», «Золотой ус с бодягой», крем Эсобел с экстрактом каллизии
душистой (золотой ус), бальзам для ног « Золотой ус с гинкго», гель для тела
«Золотой ус». C. fragrans не относится к фармакопейным растениям. В научной
литературе практически отсутствуют результаты фармакогностического
изучения и целенаправленных фармакологических исследований данного
растения и его препаратов.
Поэтому, целью настоящего исследования являлось определение внешних
признаков, установление числовых показателей, проведение предварительного
фитохимического исследования C. fragrans и экспериментальная оценка
жаропонижающего действия настоя и настойки из побегов данного растения.
Для фармакогностических исследований использовали облиственные
побеги C. fragrans длинной до 30-50 см. При макроскопическом анализе
исследуемого сырья нами были получены следующие результаты: побеги
различной длины, диаметром 0,5-0,8 см. Стебель зелѐный с чѐткими
междоузлиями, имеет антоциановую окраску. Листья C. fragrans удлиненношироколанцетовидной формы, заостренные на верхушке и пленчатым
основанием. Длина листовой пластинки 10-18 см, ширина 2,5-5 см. Листья
кожистые, гладкие, блестящие, сочные, сидячие, стеблеобъемлющие. Место
отгиба листовой пластинки снабжено тонкими длинными волосками.
Жилкование дугонервное. При разрыве листа жилки, окруженные слизью,
имеют вид тонких длинных тяжей. Цвет верхней поверхности ярко-зеленый,
нижней – светлее. Запах слабый. Вкус горьковатый.
При малом увеличении (х10) видно, что ткань нижнего эпидермиса имеет
пузырчатое строение, жилки утоплены в мезофилле, особенно это видно с
201
нижней поверхности. Край листа имеет узкую беловатую (или красноватую)
кайму с мелкими зубчиками. Основания листа по краю сильно опушено.
Числовые показатели высушенного сырья побегов C. fragrans, при
температуре 45 55 °С были определены в ходе товароведческого анализа:
влажность – 14,4±0,82 %, общая зола 23,9±1,5%, содержание экстрактивных
веществ, извлекаемых водой 20,8±1,8%, извлекаемых 70% раствором этилового
спирта – 15,0±1,2 %.
В ходе предварительного изучения химического состава побегов C.
fragrans, нами были получены следующие результаты: водные извлечения из
побегов содержали органические кислоты, в том числе аскорбиновой кислоты –
0,03±0,01%, полисахаридов – 4,47±0,18%, дубильных веществ – 1,7±0,05%, в
спиртовых извлечениях
тритерпеновые сапонины и флавоноиды
соответственно 0,04±0,01% и 0,35±0,01%. Алкалоиды и антраценпроизводные
гликозиды обнаружены не были.
При проведении фармакологических исследований изучали активность 2х лекарственных форм из побегов C. fragrans – настоя в соотношении 1:20 и
70% спиртовой настойки.
Изучение антипирогенной активность проводили на экспериментальной
модели асептического воспаления, вызываемого субплантарным введением
формалина. Экспериментальную модель воспаления моделировали на 30 белых
беспородных крысах. Формалин в виде 3,0% водного раствора вводили
субплантарно в объеме 0,1 мл под подошвенный апоневроз одной из задних
конечностей крысы. В качестве критерия антипирогенной активности
использовали абсолютное значение ректальной температуры в контроле и в
эксперименте. Измерение ректальной температуры проводили при помощи
электронного цифрового термометра (марки OMRON Eco Temp II, Япония).
Настой и настойку из побегов C. fragrans вводили животным опытных
групп за 1 час до введения формалина, однократно перорально при помощи
металлического желудочного зонда [3]. 70% настойку каллизии, разводили до
3,7% концентрации дистиллированной водой и вводили в дозе 3,3 мг/кг
экстрактивных веществ в объеме 1,0 мл на 300 г массы тела. Настой каллизии
5,0% концентрации (1:20) вводили в объеме 1,35 мл на 300 г массы тела
животного, что соответствовало 0,5 г/кг экстрактивных веществ.
В качестве эталона противовоспалительной активности использовали
диклофенак натрия. Диклофенак натрия вводили однократно внутримышечно в
дозе 8,0 мг/кг также за 1 час до введения формалина.
Перерасчет дозы на миллилитры вводимого препарата проводили
индивидуально для каждого животного с учетом массы тела. Анализ
результатов проводили путем сравнения данных в опытных и контрольных
группах между исходными и последующими показателями объема конечности.
Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи
общепринятых методов медико-биологической статистики с вычислением
средних значений, ошибки среднего, достоверность различий при
параметрическом распределении определяли при помощи критерия Стьюдента.
202
Таблица 1
Сравнительное изучение жаропонижающей активности настоя
и настойки каллизии
Настойка
Настой
Показатель
Контроль Диклофенак 70%
(1:20)
3,3 мг/кг
0,5 г/кг
36,8±0,34 36,8±0,41
36,2±0,17
36,6±0,29
Т°С исходно
37,5±0,28 37,2±0,14
37,4±0,38
36,9±0,40
Т°С 3ч
++
++
+
разница с исходным, % +1,9
+1,1
+3,3
+0,8
разница с контролем, % –
-0,8
+1,4
–1,1
Примечание: + - Р<0,05; ++- Р<0,01 – достоверность различий при
сравнении между опытными и контрольными показателями с исходными
значениями.
При проведении опытов установлено, что средняя для всех групп
животных ректальная температура тела составила 36,6±0,14°С, что
соответствует параметрам средней видовой нормы.
Через 3 часа после введения формалина в контрольной группе выявлено
достоверное (Р<0,01) повышение температуры до субфебрильной на 1,9%, что
составило 37,5±0,28°С. Применение диклофенака предотвратило повышение
температуры на 0,8%.
При использовании настойки не было выявлено жаропонижающего
эффекта, так как средняя температура тела у животных опытной группы не
имела достоверных различий с контролем. Однако, на фоне применения настоя,
было выявлено снижение температуры тела по отношению к контрольной
группе животных на 1,1% – температура тела в данной опытной группе не
превышала значений нормы и составила 36,9±0,40°С.
Таким образом, предварительный фитохимический анализ побегов C.
fragrans выявил, что в спиртовом извлечении преобладают флавоноиды, а в
водном – полисахариды, часто проявляющие противовоспалительную и
антипирогенную активность.
Установлено, что настой побегов C. fragrans обладает умеренной
жаропонижающей активностью, что делает перспективным дальнейшее
изучение противовоспалительных и жаропонижающих свойств данного
растения.
Литература
[1] Семенова Л.В. Каллизия – Callisia fragrans Woodson – выращивание и
использование / Л.В. Семенова, Ю.В. Ямпольский // Лекарственные
экзотические растения. – СПб., 2003. – 125 с.
[2] Куликова М.В. Каллизия душистая – золотой ус / М.В. Куликова. –М. :
Издательский Дом МСП, 2005. – 48 с.
203
[3] Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ / В.П. Фисенко, Е.В. Арзамасцев, Э.А.
Бабаян [и др.].-М. МЗ РФ, ЗАО «ИИА Ремедиум
204
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НАСТОЯ И
НАСТОЙКИ ИЗ ПОБЕГОВ КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Коренская И.М., Бузлама А.В., Куликова Т.Ю., Ивановская Н.П.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Внимание к народным рецептам лечения растениями в наши дни
достаточно высоко. Большой интерес вызывает растение, относящееся к
группе традесканциевых, каллизия душистая (Callisia fragrans Woodson),
больше известное под названием Золотой ус. Родиной Каллизии душистой
является Мексика. Данное экзотическое лекарственное растение было вывезено
русским ученым и ботаником А.Н. Красновым в начале прошлого века. В
последнее десятилетие каллизия душистая используется не только в качестве
декоративного растения, российскими учеными предпринимаются попытки
использования его фитотерапевтических свойств [1, 2].
Аптечный ассортимент биологически активных добавок и лечебной
косметики, содержащий экстракт из побегов каллизии душистой, в основном,
выпускается под торговой маркой «Золотой ус». В аптеках г. Воронежа он
представлен следующими позициями: бальзамы, гели, кремы, рекомендованные
при различных заболеваниях опорно-двигательного аппарата в качестве
противовоспалительных средств.
Однако, в доступной нам литературе отсутствуют сведения, достоверно
доказывающие наличие противовоспалительных свойств у данного растения, в
связи с чем целью настоящего исследования являлось изучение
противовоспалительной активности водного и спиртового извлечений из
побегов каллизии душистой в экспериментальных исследованиях на
лабораторных животных.
Нами была изучена противовоспалительная активность настоя (1:20) и
70% спиртовой настойки из побегов каллизии душистой. Исследование
проводили на модели экспериментального воспаления. Эксперименты
проведены на 28 белых беспородных крысах массой тела 180,0±15,0 г.
Животные были разделены на 4 группы по 7 в каждой. В качестве
флогогенного агента использовали формалин. 3,0% водный раствор формалина
вводили субплантарно в объеме 0,1 мл в одну из задних конечностей
животного, другая конечность являлась интактной и служила контролем.
Величину отека оценивали онкометрически, объем конечности выражали в см3
[3]. В качестве критерия противовоспалительной активности изучаемых
извлечений использовали объем отечной конечности, для чего рассчитывали
процент торможения отека относительно исходного уровня в контроле.
Животным опытных групп водные и спиртовые извлечения из побегов
каллизии душистой вводили за 1 час до введения формалина однократно
перорально (при помощи металлического желудочного зонда).
205
Перерасчет доз на миллилитры проводили индивидуально для каждого
животного с учетом массы тела. В эксперименте изучали сравнительную
эффективность 2-х лекарственных форм: 1 – 70% настойку каллизии (разводили
до 3,7% концентрации дистиллированной водой и вводили в дозе 3,3 мг/кг
экстрактивных веществ в объеме 1,0 мл на 300 г массы тела крысы); 2 – настой
каллизии (использовали в 5,0% концентрации, вводили в объеме 1,35 мл на 300
г массы тела животного, что соответствовало 0,5 г/кг экстрактивных веществ).
В качестве эталона сравнения использовали препарат из группы
классических НПВС – диклофенак натрия, обладающий, как известно,
выраженной противовоспалительной активностью. Диклофенак натрия вводили
однократно внутримышечно в дозе 8,0 мг/кг также за 1 час до введения
формалина.
Для анализа наличия противовоспалительной активности у изучаемых
«препаратов» проводили сравнение данных в опытных и контрольных группах
между исходными и последующими показателями объема конечности.
Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи
общепринятых методов медико-биологической статистики, вычисляли средние
значения и ошибку среднего для каждой из групп животных.
Таблица 1
Сравнительное изучение противовоспалительной активности
настоя и настойки побегов каллизии душистой
Показатель
Объем
исходно, см3
Контроль
конечности 1,36±0,08
Объем конечности 1ч, см3
разница с исходным, %
разница с контролем, %
Объем конечности 3ч, см3
разница с исходным, %
разница с контролем, %
Объем конечности 24ч, см3
разница с исходным, %
разница с контролем, %
Диклофенак
1,76±0,13
1,98±0,11++ 2,32±0,09
++,*
+45,6
+31,8
–
-13,8
1,80±0,14
1,80±0,09
+
+32,3
+2,3
–
-30,1
1,60±0,07
2,20±0,11
+++,**
+17,6
+25,0
–
+7,4
Настойка
Настой
1,67±0,03
1,43±0,06
2,07±0,05
+++
+23,9
-21,7
1,65±0,06
2,13±0,04
-1,19
-33,5
1,90±0,08
+++,*
+13,8
-3,8
+14,0
-18,3
2,13±0,06
+++,***
+49,0
+31,4
+49,0
+3,4
1,63±0,09
Примечание: + - Р<0,05; ++- Р<0,01, +++- Р<0,001– достоверность
различий при сравнении между опытными и контрольными показателями с
исходными значениями; * - Р<0,05, **- Р<0,01, ***- Р<0,001 – достоверность
различий при сравнении между опытными и контрольными показателями.
206
При проведении исходных измерений установлено, что средний объем
здоровой конечности составил 1,52±0,05 см3 и достоверно не различался в
контрольной и опытных группах.
Через 1 час в контрольной группе животных наблюдалось достоверное
увеличение объема конечности, подвергнутой введению формалина, на 45,6%,
что свидетельствует о развитии экссудативной воспалительной реакции. По
истечении 3 часов в контрольной группе степень отечности начала снижаться,
составив 32,4%. Через 24 часа объем конечности превышал исходные
показатели на 17,6% (Табл. 1.).
Применение настойки способствовало снижению отека конечности на
21,7% через 1 час, на 33,5% через 3 часа и на 3,8% через 24 часа по сравнению с
контролем.
Следует отметить, что выраженность антиэкссудативного действия
настойки превышала эффект диклофенака. На фоне применения настоя начало
проявления эффекта наблюдалось через 3 часа – на 18,3%, через 24 часа
антиэкссудативный эффект не наблюдался.
Объем конечности, процент к исходному значению по группам, V %
149,0
150,0
149,0
145,6
140,0
132,3
21,7%
130,0
120,0
33,5%
123,9
117,6
114,0
110,0
100,0
113,8
98,8
90,0
V исходно
Контроль
V1ч
V3ч
настойка каллизии
настой каллизии
V 24 ч
Диклофенак
Рис. 1. Сравнительное изучение противовоспалительной
активности 1:20 настоя и 70% настойки из побегов каллизии
душистой
Таким образом, в результате экспериментальных исследований выявлено
наличие и у настоя, и у настойки из побегов каллизии душистой
противовоспалительных свойств.
Противовоспалительные свойства проявляются в виде противоотечного
эффекта, который по степени выраженности может быть оценен как средний.
Этот эффект развивается через 2 часа (настойка) и через 4 часа (настой) после
однократного перорального введения экспериментальных препаратов.
Динамика воспалительного отека на фоне влияния изучаемых извлечений
каллизии душистой представлена на графике (рис. 1.)
Длительность проявления эффекта настойки в дозе 3,3 мг является
максимальной и сохраняется до 24 часов. Эффект настоя является менее
207
выраженным по сравнению с настойкой, начинает проявляться через 4 часа
после введения препарата и вероятно не превышает 4-6 часов.
Противоотечный эффект настойки более выражен, чем у настоя. Различия
эффективности настоя и настойки могут быть обусловлены различным
составом экстрактивных веществ, например, присутствием в настойке
флавоноидов,
обладающих,
как
известно
выраженными
противовоспалительными свойствами.
Литература
[1] Куликова М.В. Каллизия Душистая – золотой ус / М.В. Куликова. – М.
: Издательский Дом МСП, 2005. – 48 с.
[2] Кедрова М.А. Золотой ус – женьшень на подоконнике / М.А.
Кедрова.–СПб. : Питер, 2006. – 96 с.
[3] Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ / В.П. Фисенко, Е.В. Арзамасцев, Э.А.
Бабаян [и др.].-М. МЗ РФ, ЗАО «ИИА Ремедиум»,2000. – 398 с.
208
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА И
АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА СЕМЯН РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ
АМАРАНТА ГИБРИДНОГО
Коренская И.М., Мирошниченко Л.А., Измалкова И.Е.
e-mail:[email protected]
Воронежский государственный университет
Растение амарант – одно из древнейших зерновых культур на Земле.
Различные виды амаранта из семейства амарантовые (Amaranthaceae) в
последнее время привлекают повышенное внимание специалистов благодаря
своим уникальным свойствам. Семена амаранта содержат комплекс
биологически активных соединений: белок, высокого качества с незаменимыми
аминокислотами, витамины, микро и макроэлементы, крахмал, пектиновые
вещества и ценное масло, содержащее сквален, полиненасыщенные жирные
кислоты, токоферолы [1].
Известно, что белки, особенно их аминокислотный состав, имеют
большое значение для нормальной жизнедеятельности человеческого
организма. В свободном виде они участвуют в процессах связывания,
транспорта и выделения из организма биологических форм азота, способствует
поддержанию азотистого баланса (глутаминовая и аспарагиновая кислоты),
обладают иммуноактивными свойствами и оказывают гиполипидемическое
действие, стимулируют ослабленную сердечную деятельность (метионин). В
растениях аминокислоты участвуют в биосинтезе некоторых алкалоидов,
флавоноидов и других соединений (тирозин и фенилаланин) [2]. Растения,
содержащие аминокислоты, могут быть дополнительными источниками этой
группы соединений и использоваться в медицинской и пищевой
промышленности.
Целью работы явилось изучение содержания общего белка и состава
аминокислот семян различных сортов амаранта гибридного. Объектом
исследования служили семена следующих сортов амаранта гибридного
выращенные в Воронежской области: Ультра 2 (проба 1), Крепыш (проба 2),
Янтарь (проба 3) и Кизлярец (проба 4). Качественное обнаружение
аминокислот проводили в водных извлечениях с помощью нингидриновой
пробы. Для этого 10,0 г измельченного сырья заливали 50 мл
дистиллированной воды и нагревали на водяной бане с обратным
холодильником в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, сырье вновь заливали
водой и операцию повторяли еще дважды. Полученные водные извлечения
объединяли, упаривали под вакуумом до 50 мл и использовали для проведения
качественной реакции. Для этого смешивали равные объемы извлечения и 0,1%
спиртового раствора нингидрина и осторожно нагревали. При охлаждении
наблюдалось красно-фиолетовое окрашивание, что указывало на присутствие
аминокислот в семенах амаранта гибридного [3].
209
Изучение аминокислотного состава протеина семян амаранта проводили
на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-400 производства
компании Ingos (Чехия). Для этого отбирали 5 г сырья, измельчали,
гомогенизировали. Высушенную до постоянной массы навеску измельченных
семян обезжиривали диэтиловым эфиром. Аминокислоты определяли после
кислотного гидролиза. Для этого прибавляли к образцу 6М НС1 и
выдерживали смесь при 110°С в течение 23 ч. Гидролизат охлаждали,
фильтровали, промывали и концентрировали на роторном испарителе.
Количественное разведение гидролизата проводили натрий-цитратным
буферным раствором (pH 2,2) тщательно перемешивая.
Однако, в условиях кислотного гидролиза пептидных связей белков,
нестабильные серосодержащие аминокислоты цистин и метионин частично
разрушаются, поэтому для их полного извлечения используется косвенный
метод окислительного гидролиза надмуравьиной кислотой (Н2О2 : НСООН
= 1 : 9 ) при 4 °С в течение 16 ч с последующим кислотным гидролизом по
стандартной схеме. В результате цистин превращается в цистеиновую кислоту,
а метионин в метионинсульфон, по их содержанию в образце делается
перерасчет на исходные цистин и метионин, соответственно.
Анализ аминокислот проводили на автоматическом аминокислотном
анализаторе, используя в хроматографической колонке сорбент (катионит)
Ostion LG ANB. В качестве стандарта использовали смесь L-a-аминокислот в
0.1N HCl производства Sigma-Aldrich, Inc. Saint Louis, USA. Идентификацию
аминокислот осуществляли накладыванием спектров поглощения стандартных
образцов аминокислот, обладающих максимумом светопоглощения в видимой
области электромагнитного спектра с испытуемыми образцами, используя 2-х
канальное фотометрическое детектирование при mах 570 нм и 440 нм.
Математическая обработка полученных хроматограмм и количественный
расчет содержания аминокислот в образцах проводилась с использованием
программного пакета Chromulan 0.82 Ingos. Расчет осуществляли в наномолях
аликвотной части, непосредственно используемой для анализа. Затем было
рассчитано количественное содержание обнаруженных аминокислот в мг/г.
Результаты представлены в табл. 1. В результате проведенных
исследований в составе семян амаранта гибридного всех испытуемых сортовых
образцов были обнаружены 17 аминокислот, среди которых преобладали
аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Из данных, приведенных в таблице, следует, что в белковой фракции
измельченных в муку семян амаранта различных сортов содержится 8
незаменимых аминокислот: треонин, цистин, метионин, изолейцин, лейцин,
тирозин, фенилаланин, лизин, массовая доля которых составляет 32% от
общего количества аминокислот в сортах Ультра 2 и Кизлярец. В сортах
Крепыш и Янтарь незаменимые аминокислоты составляют 30% и 31%
соответственно. Больше всего лизина, наиболее дефицитной незаменимой
аминокислоты, содержится в сортах Ультра 2 и Кизлярец и составляет
соответственно 6,77% и 7,08% от общего количества аминокислот. Следует
отметить, что согласно данным литературы [3] дефицитной аминокислотой
210
зернобобовых растений является лизин. В семенах амаранта исследуемых
сортов лизина содержится в 2,5 раза больше, чем в других кормовых культурах.
В четырех сортах амаранта гибридного третья часть аминокислотного состава
приходится на аргинин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты.
Таблица 1.
Аминокислотный состав семян амаранта гибридного
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Аминокислоты
1
2
3
4
Ультра 2
1,35
Крепыш
1,71
Янтарь
1,49
Кизлярец
1,21
0,71
1,33
3,95
0,58
1,03
3,08
0,40
0,73
2,14
1,22
1,60
0,88
0,47
0,90
0,49
0,76
1,24
0,68
0,88
0,67
1,33
2,57
0,84
1,38
0,72
0,31
0,76
0,40
0,65
1,06
0,55
0,77
0,58
1,11
2,08
0,35
1,09
0,57
0,20
0,60
0,24
0,52
0,81
0,42
0,61
0,44
0,91
1,60
Asp Аспарагиновая
кислота
Thr Треонин
0,63
Ser Серин
0,93
Glu Глутаминовая
2,91
кислота
Pro Пролин
0,53
Gly Глицин
1,25
Ala Аланин
0,68
Cys Цистин*
0,26
Val Валин
0,72
Met Метионин*
0,39
Ile Изолейцин
0,61
Leu Лейцин
0,97
Tyr Тирозин
0,50
Phe Фенилаланин
0,70
His Гистидин
0,51
Lys Лизин
1,08
Arg Аргинин
1,93
*Серосодержащие аминокислоты
Таким образом, нами было выявлено, что белковая часть семян амаранта,
различных сортов содержит ценный набор аминокислот. Наиболее значимыми
по содержанию аминокислот и в частности лизина, являются сорта Ультра 2 и
Крепыш. Это позволяет использовать семена амаранта гибридного в качестве
источника белка.
Литература
[1] Мартиросян В.В. Пищевая и биологическая ценность семян амаранта /
В.В. мартиросян, У.Н. Диденко // Матер. 1 межд. Научн. – практич. конфер.
Растительные ресурсы для здоровья человека. – М. : «Арес», 2002. – С. 186-188.
211
[2] Броновицкая З.Г. Аминокислоты, их производные и регуляция
метаболизма / З.Г. Броновицкая. – Ростов-на-Дону, 1983. – 112 с.
[3] Дроздова И.Л. Аминокислоты фиалки полевой и донника рослого /
И.Л. Дроздова, И.Л. Бубенчиков // Фармация. – 2003. - № 5. – С. 14-15.
[3] Козловский А.Ф. Технологические аспекты комплексной переработки
семян амаранта / А.Ф. Козловский и др. // Матер. 1 межд. Науч.-практич.
конфер. «Растительные ресурсы для здоровья человека. – М. : «Арес», 2002. –
С. 287-293.
212
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
МАННОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ
Корнеева О.С., Черемушкина И.В., Анохина Е.П., Глущенко А.С.
e-mail: [email protected]
Воронежская государственная технологическая академия
Нарушение
микробиоценоза
кишечника
является
следствием
органической или функциональной патологии, а также неблагоприятного
воздействия факторов внешней среды. На сегодняшний день по данным РАМН
90% населения имеют те или иные проявления дисбактериоза, поэтому
актуальным является поиск и исследование веществ, проявляющих
пребиотическую активность и участвующих в восстановлении нормофлоры
организмов [1,2]. Наиболее распространенные бифидогенные факторы –
аминосахара и нейтральные сахара, к которым относится манноза и
манноолигосахариды.
Манноза – эпимер глюкозы. Этот моносахарид называют витамином М,
он является незаменимым углеводным компонентом [3]. В чистом виде манноза
практически не встречается в пищевых продуктах, а присутствует в виде
гомогенных или гетерогенных полисахаридов (маннанов), которые не
гидролизуются кислотами и ферментами желудочно-кишечного
тракта
человека.
Маннаны – природные полисахариды, которые являются частью
гемицеллюлозной фракции клеточных стенок растений и представляют собой
потенциальный источник маннозы и манноолигосахаридов. Маннаны широко
распространены в природе: найдены в семенах восьми ботанических
семейств, в различных видах водорослей, в некоторых видов лишайников, а
также в большом количестве представлены в древесине хвойных пород
деревьев [4].
Одним из способов получения маннозы и маннозосодержащих
гидролизатов является ферментативная деструкция трудногидролизуемых
маннанов растительного сырья под действием фермента β-маннаназы.
Известные отечественные и зарубежные штаммы – продуценты карбогидраз
представлены комплексами ферментов, которые имеют относительно низкую
активность маннаназы.
На кафедре микробиологии и биохимии Воронежской государственной
технологической академии в рамках Федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный
контракт № 02.512.11.2206 от 26.06.2008 г., разрабатываются биологические
методы получения минорных сахаров, в частности, маннозы, и изучаются их
функциональные
свойства.
Разработана
технология
получения
маннозосодержащих гидролизатов путем ферментативной деструкции
213
маннанов растительного сырья с использованием генно-модифицированного
бактериального штамма с высокой β-маннаназой активностью.
Оценка пребиотической активности маннозосодержащих гидролизатов in
vitro проводилась на эталонных и свежевыделенных штаммах бифидо- и
лактобактерий. Выявленная тенденция положительного влияния различной
концентрации маннозосодержащих компонентов на рост бифидобактерий В.
bifidum
in
vitro
свидетельствует
о
пребиотическом
действии
маннозосодержащих гидролизатов.
В опытах in vivo выявлена бифидогенная и лактогенная активность
маннозосодержащих
гидролизатов.
Применение
маннозосодержащих
гидролизатов в условиях экспериментального дисбиоза у опытных животных
приводило к увеличению количества бифидобактерий и стимулировало рост
молочнокислых бактерий.
Совместное
применение
маннозосодержащих
компонентов
с
коммерческими
пробиотическими
препаратами
«Бифидумбактерин»,
«Лактобактерин» не приводило к значимому клиническому эффекту.
В
результате
проведенных
исследований
по
коррекции
экспериментального дисбиоза с помощью маннозосодержащих гидролизатов
были получены данные, которые свидетельствуют о том, что
маннозосодержащие гидролизаты способствуют восстановлению состава и
численности индигенной кишечной микрофлоры опытных животных, проявляя
тем самым пребиотическую активность.
Полученные результаты позволяют рекомендовать маннозосодержащие
гидолизаты для расширения ассортимента пребиотических препаратов.
Литература
1. Бельмер С. В. Применение пребиотиков для профилактики и лечения
нарушений микрофлоры кишечника. – М., 2005. – 24 с.
2. Михайлов И. Б. Применение пробиотиков и пребиотиков при
дисбактериозе кишечника у детей / И. Б. Михайлов, Е. А. Корниенко. – СПб.,
2004. – 123 с.
3. Failire of short-term mannose therapy of patients with carbohydratedeficient glycoprotein syndrome type 1A // Kjaergaard S. et all. Acta Paediatr 1998
AUG; 87 (8):884-8
4. Moreira L. R. An Overview of mannan structure and mannan-degrading
enzyme systems / L. R. Moreira, E. X. Filho. - Appl Microbiol Biotechnol. – 2008. V. 79. – Р. 165 - 178.
214
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ФУКОЗЫ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ
ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Корнеева О.С., Санина Т.В., Черенков Д.А. e-mail: [email protected]
Воронежская государственная технологическая академия
В настоящее время в мировой науке накоплен обширный материал,
свидетельствующий о важной роли так называемых «минорных» сахаров в
метаболизме человека. Особую биологическую роль играет фукоза. Она входит
в состав углеводной части гормонов, муцинов, иммуноглобулинов,
группоспецифических веществ крови, клеточных рецепторов.
Фукоза (6-Дезокси-L-галактоза) C6H12O5 –моносахарид, относящийся к
дезоксигексозам. Молекулярная масса фукозы составляет 164,2 Да. ОН-группа
у 6-го углеродного атома в молекуле гексозы замещена на атом водорода.
Именно химические свойства фукозы предопределили уникальную
биологическую роль фукозы в живых клетках. Прежде всего, фукоза является
единственным сахаром, присутствующим в клетках млекопитающих в L-форме,
только L-фукоза входит в состав бактериальных и растительных
полисахаридов, гликопротеинов, олигосахаридов молока и других природных
биополимеров. D-фукоза встречается только как минорный компонент
некоторых растительных гликозидов. Другой исключительной характеристикой
фукозы является еѐ присутствие в терминальном положении и отсутствие
внутри олигосахаридных цепей гликоконьюгатов млекопитающих [1].
Фукоза является важным компонентом метаболизма млекопитающих.
Фукоза входит в состав большинства гликопротеинов, особенно много еѐ
содержится в сыворотке крови (469-548 мкМоль/л). Фукоза, являясь
структурным компонентом антигенов крови, служит маркером группы крови.
При этом концентрация фукозы в группоспецифических веществах крови
составляет 16-22%, а в остальных биополимерах не превышает 0,5-1,5% [2].
Гликаны клеточной поверхности представляют собой структуры,
состоящие из линейных и разветвлѐнных цепей полисахаридов, содержащих
фукозу. При полном отсутствии фукозы на клеточном уровне и непоступлении
ее в аппарат Гольджи строятся анормальные гликопротеины, как внутри
клетки, так и в составе клеточных рецепторов. Это приводит к нарушению
функционирования клетки и возникновению аутоиммунного ответа.
Необычайно важна роль молекул фукозы в репродуктивных и иммунных
процессах позвоночных. Установлено, что остатки фукозы сконцентрированы
на определенном участке поверхности яйцеклетки, через который возможно
проникновение сперматозоидов. Сперматозоиды имеют фермент фукозидазу,
локализованный на акросоме. Исследователи предполагают, что с помощью
этого фермента обеспечивается адгезия сперматозоида к оболочке ооцита [3,4].
Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах
онтогенеза и клеточной дифференциации. Исследователями показано, что от
процессов
фукозилирования
зависит
дифференцировка
Т-клеток.
215
Млекопитающие имеют набор ферментов, обеспечивающих синтез и
метаболические превращения фукозы в организме: фукозидазы, фукокиназы и
некоторые другие.
В ряде исследований показана определяющая роль фукозы в реакциях
высокоспецифичных белок-белковых взаимодействий и межклеточного
узнавания. Возможность медикаментозной регуляции именно этих реакций,
крайне важных для организма, и определяет в основном современный интерес к
производству препаратов фукозы [5].
В связи с этим, представляется актуальным проведение исследований,
направленных на получение препаратов чистой фукозы и изучение их влияния
на регуляцию важнейших физиологических процессов млекопитающих:
иммунного ответа и оплодотворения.
На основе литературных данных можно сделать вывод, что применение
фукозы в составе БАД для поддержания и коррекции иммунного статуса, а
также улучшения репродуктивной функции весьма целесообразно. В связи с
этим, представляется актуальным проведение исследований, направленных на
получение препаратов чистой фукозы и изучение их влияния на регуляцию
важнейших физиологических процессов млекопитающих: иммунного ответа и
оплодотворения.
В чистом виде фукоза практически не встречается в природе. Наиболее
богаты фукозой полисахариды бурых водорослей и некоторых морских
беспозвоночных и бактерий. В бурых водорослях фукоза находится в виде
фукоидана – сложного сульфатированного полисахарида, основным
моносахаридным звеном которого является L-фукоза [6]. Однако
использование этих растений в качестве сырья для производства фукозы
затруднено из-за отсутствия простых и недорогих методов расщепления
фукозосодержащих полисахаридов и выделения чистой фукозы. В этом
направлении проводится достаточно большое количество исследований, тем не
менее, производство фукозы остается дорогостоящим и сложным процессом,
промышленное производство фукозы и фукозосодержащих олигосахаридов
отсутствует как у нас в стране, так и за рубежом.
Коллективом кафедры микробиологии и биохимии ВГТА в рамках
федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт №П260 от
23 июля 2009 г) ведется разработка биокаталитической технологии получения
фукозы и исследование ее влияния на иммунный статус и репродуктивную
функцию живого организма.
Результаты данной работы позволят разработать технологию
производства фукозы и сделать выводы о возможности применения препаратов
фукозы в качестве иммуностимуляторов, в составе комплексной терапии для
профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Также результаты
исследований позволят выявить связь между степенью фукозилирования
оболочки ооцита млекопитающих и способностью к оплодотворению. Такие
исследования внесут вклад в профилактику и лечение бесплодия, и возможно
216
приведут к созданию новых препаратов для повышения плодовитости
сельскохозяйственных животных.
Литература
1. Péterszegi, G. Pharmacological properties of fucose. Applications in agerelated modifications of connective tissues / G. Péterszegi, I. Fodil-Bourahla, A.M.
Robert, L. Robert // Biomedicine & Pharmacotherapy. – 2003. – V. 57. – P. 240–245.
2. Хмелевский, Ю.В. Основные биохимические константы человека в
норме и при патологии / Ю.В Хмелевский., О.К. Усатенко - Киев.: Изд-во
«Здоров’я», 1987г. – 160 с.
3. Intra, J. An α-L-fucosidase potentially involved in fertilization is present on
drosophila spermatozoa surface / J. Intra, F. Cenni, M.-E. Perotti // Mol. Reprod. &
Developm. – 2006. – V. 73. – P. 1149–1158
4. Lutjen, P. A role for fucose in human spermatozoa pellucida recognition / P.
Lutjen, M. Witt, A. Hoy // Clin. Reprod. Fertil. – 1986. – V.4. – № 2. – P 185-186.
5. Luther, K.B. Role of unusual O-glycans in intercellular signaling. / Luther
K.B., Haltiwanger R.S.// Int. J. of Biochem. & Cell Biol. – 2009. – V. 41. – P. 1011–
1024
6. Кузнецова Т. В. Сравнительное исследование биологической
активности фукоиданов из бурых водорослей / Т. В. Кузнецова, Н. Н.
Беседнова, А. М. Урванцев и др.// Вестник ДВО РАН. – 2006. – №6 – с. 105-110.
217
ЭЛЕКТРОДИАЛИЗ КАК СТАДИЯ В ПОЛУЧЕНИИ ЧИСТЫХ
ПРЕПАРАТОВ АМИНОКИСЛОТ
Крисилова Е.В., Елисеева Т.В., Орос Г.Ю., Селеменев В.Ф.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Стадии очистки индивидуальных веществ являются очень важными в
схеме производства. Их стоимость составляет более 90% в продажной цене
готового продукта для веществ пищевого и фармацевтического класса чистоты.
Аминокислоты широко используются в индустрии фармпрепаратов и
биодобавок. Смеси аминокислот рекомендованы в рационе усиленного питания
для спортсменов, людей, страдающих анемией. Аминокислоты входят в состав
поливитаминов, мазей, растворов для парентерального питания. Особенно
важны незаменимые аминокислоты, которые обязательно должны поступать в
организм человека извне.
В качестве объектов исследования выбрана группа основных
аминокислот: аргинин, лизин и гистидин. Лизин относится к незаменимым,
аргинин – к условно заменимым аминокислотам, гистидин – к заменимым [1].
Аргинин, лизин и гистидин оптически активны, их L-изомеры найдены во всех
белках. Все исследуемые аминокислоты входят в состав смесей для
парэнтерального питания. Их применяют также для лечения заболеваний
печени. Лизин, гистидин и аргинин используют для нормализации рН
желудочного
сока,
при
лечении
язвенной
болезни
желудка,
двенадцатиперстной кишки [2]. Их соли являются средствами от лейкопении,
анемии и астении, обладают анаболизирующим действием [3]. Производные
лизина и аргинина ускоряют заживление ран и царапин. Производные лизина и
гистидина применяют для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Производные гистидина обладают высокой бактерицидной активностью и
низкой токсичностью и применяются для профилактики и лечения
инфекционных заболеваний.
В работе решены прикладные задачи выделения аминокислот из
растворов различного состава. Метод электродиализа применен как стадия в
получении чистых аминокислот фармакопейного класса.
Ранее нами были описан процесс выделения основных аминокислот из
смеси с тартрат-ионами, используемыми при разделении рацематов,
полученных химическим синтезом [4,5]. Разработан также метод очистки
лизина от нитрата калия, являющегося компонентом производственных
растворов при получении аминокислот методом ферментации [6]. После
очистки от примесей необходимо получить концентрированный раствор, из
которого можно затем выделить аминокислоту в кристаллическом виде. В
настоящей работе электродиализ использован как метод концентрирования
растворов группы основных аминокислот, причем концентрирование может
проводиться одновременно с отделением от тартрат-ионов, в одном аппарате.
218
Эксперименты проводились в семикамерном электродиализаторе.
Применяли катионообменные мембраны МК-40 и биполярные мембраны МБ-3.
Биполярные мембраны использовались для подкисления раствора в секции
обессоливания и интенсификации переноса аминокислоты. За счет
использования биполярных мембран происходило безреагентное подкисление
раствора и образование катионов аминокислоты, которые переносились через
катионообменные мембраны в камеры концентрирования. Приѐмная секция, в
которую осуществляется перенос аминокислоты, делалась непроточной.
Модификацией процесса электродиализного концентрирования раствора
аминокислоты является использование электродиализатора с проточными
камерами концентрирования, скорость протока в которых существенно ниже,
чем в секциях обессоливания. В них подают исходный раствор, а на выходе
получают концентрат – раствор, обогащенный аминокислотой. Применение
проточных камер концентрирования позволяет сделать процесс непрерывным,
дает возможность автоматизации управления и контроля. Концентрирование
происходило за счет различия скоростей в камерах обессоливания и
концентрирования.
Осуществлено концентрирование аргинина, лизина и гистидина из
растворов низких концентраций – 10-2-10-4 моль/дм3.
Для оценки эффективности процесса использовалась величина фактора
концентрирования F = Cконц/С0. Установлено, что фактор концентрирования
растет при увеличении плотности электрического тока и концентрации
исходного раствора. Величина максимально достигнутого фактора
концентрирования
раствора
аминокислоты
возрастает
в
ряду:
лизин<аргинин<гистидин.
Литература
1.
Большая Медицинская Энциклопедия: в 30-ти т. / под ред. Б.В.
Петровского. – М. : Советская энциклопедия, 1980. – Т.13. – 553 с.
2.
Получение и применение аминокислот \ под ред. Р.А. Кукайн и др.
– Рига: «Зинатне», 1970 – С. 141-153
3.
Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека,- М:
Мир, 1993, т.1, 381 с.
4.
Патент №2223946 Способ получения L-лизина / Т.В. Елисеева,
А.Ю. Текучев, В.Ф. Селеменев. пр. 17.10.2002.
5.
Электромембранное разделение аргинина и винной кислоты / Е.В.
Крисилова, А.В. Набокин, Т.В. Елисеева // «Физико-химические процессы в
конденсированном состоянии и на межфазных границах» «ФАГРАН-2004». :
Материалы Всеросс. конф., Воронеж, 2004 г. – С.479-480.
6.
Очистка физиологически активного амфолита от минеральных
примесей методом электродиализа / Е.В. Крисилова, Т.В. Елисеева, В.А.
Шапошник // «Пути и формы совершенствования фармацевтического
образования. Создание новых физиологически активных веществ»: Материалы
конф., Воронеж, 22-24 марта 2007г.– С. 182-184.
219
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ФАРМАКОТЕРАПИИ
ЕДИНИЧНЫХ КИСТ ПОЧЕК
Куликов Ю.А., Сединкина Н.Н.
Воронежский государственный университет
Кисты, особенно почек – одна из распространѐнных форм поражения
внутренних органов. В практическом плане они привлекают внимание
специалистов, в основном, с позиции целесообразности их оперативного
лечения. Единичные (простые) кисты почек (ЕКП), не вызывающие нарушения
их функций, рассматриваются как относительно безобидные и требующие лишь
наблюдения.
В литературе обсуждается концепция механизма образования кист
внутренних органов с позиции дисплазии соединительной ткани (ДСТ) [1],
усиления катаболизма, или нарушения еѐ образования с накоплением
потенциально патогенных субстанций и замедлением их удаления [2,3].
Однако патогенетической фармакотерапии кист почек и других
внутренних органов не существует.
Цель исследования состояла в оценке цитопротекторных возможностей
ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (ИАПФ) эналаприла, а
также магнерота у больных с единичными кистами почек в условиях их
кратковременного курсового применения.
При выборе препаратов учитывалось, что ИАПФ вызывают не только
гипотензивный, но также противовоспалительное действие, торможение
пролиферации и гипертрофии мезангиальных клеток и эпителия почечных
канальцев и фибробластов [4].
Магний, как известно, необходим в синтезе нуклеиновых кислот, а
оротовая кислота обеспечивает фиксацию магния на АТФ в клетке [5].
Материал исследования составили 86 больных ЕКП обоего пола в
возрасте от 20 до 60 лет.
Работа проведена на базе отделения функциональной диагностики
Воронежской городской клинической больницы №20.
Ультразвуковые исследования (УЗИ) почек выполнены на приборах
«Алока 500» и «Vivid 3». Радионуклидные исследования почек с
использованием йод-гиппурана проведены на установке «Гамма».
СМП выделяли методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом и с
использованием спектрофотометра СФ-26 при длине волны 220 нм.
В разработку включены четыре группы больных:
1 – с кистами, расположенными вне почечного синуса (КВПС) и
получающими эналаприл – 22 человека;
2 – с КВПС и получающими магнерот – 21 человек;
3 – с КВПС и получающими оба препарата – 21 человек;
4 – кистами, расположенными в почечном синусе и получающими оба
препарата – 22 человека.
220
Группы не имели статистически достоверных различий по показателям
возраста и артериального давления (АД).
Из исследования исключались больные с клинически определяемыми
признаками хронического пиелонефрита и уровнем гемоглобина ниже 120 г/л.
Эналаприл применялся в дозе 10 мг/сут, а магнерот – 1500 мг/сут в
течение 21 дня.
Контроль эффективности фармакотерапии осуществлялся по показателям
АД систолического (АДс) и АД диастолического (АДд), суточной протеинурии,
плотности мочи, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), длительности
секреторной и экскреторной фаз ренограмм, содержания среднемолекулярных
пептидов (СМП) в плазме крови и в моче.
Все исследования проведены дважды: до приѐма препаратов и спустя 21
день после этого.
Результаты исследования.
В группе №1 имело место статистически достоверное снижение АДс (р
<0,001) и АДд (р<0,05), уменьшение суточной протеинурии (<0,005),
увеличение СКФ (р<0,01) и плотности мочи (р<0,05). Статистически
достоверно уменьшались длительности фаз секреции в почках с кистами (1) и в
почках без кист (2) (р1<0,05 и р2<0,001) и экскреции (р1<0,05 и р2<0,01). Уровни
СМП в плазме уменьшились (р<0,01), а уровни СМП в моче увеличились
(р<0,05).
В группе №2 статистически достоверно увеличилась СКФ (р<0,05),
уменьшились длительности фаз экскреции в почках с кистами (р<0,01) и
увеличилось содержание СМП в моче (р<0,05).
Комбинированное назначение эналаприла и магнерота больным в группах
№3 и №4 сопровождалось статистически достоверным снижением АДс
(соответственно, р<0,01, р<0,05) и АДд (соответственно, р<0,05, р<0,01),
суточной протеинурии (соответственно, р<0,01, р<0,05), уменьшением
длительностей секреторных фаз (соответственно, р<0,05, р<0,001) и
экскреторных фаз ренограмм (соответственно, р<0,001, р<0,001).
У больных КПС (группа №4) под влиянием лечения наблюдалось
статистически достоверное снижение в плазме СМП с ММ от 3 до 5 кДА и их
увеличение в моче (в обоих случаях р<0,01). Установлено, что величины СМП
с ММ от 3 до 5 кДА в плазме крови тесно позитивно коррелировали с
показателем плотности мочи и СКФ, но негативно - со значениями суточной
протеинурии.
Выводы
1. Эналаприл и магнерот, особенно при совместном применении даже в
относительно небольших дозах оказывают нефропротективное действие.
2. Оценку нефропротективного эффекта можно осуществлять по
динамике показателей суточной протеинурии, плотности мочи и СКФ.
3. Уменьшение в крови и увеличение в моче СМП с ММ свыше 3 кДА
является независимым маркѐром нефропротективного эффекта фармакотерапии
ЕКП.
221
Литература
1. Земцовский Э.В. Соединительнотканные дисплазии сердца /Э.В.
Земцовский. – СПб.: ТОО Политекс-Норд-Вест, 2000. – 115с.
2. Лучихина Л.В. Артроз, ранняя диагностика и патогенетическая
терапия/Л.В.Лучихина. – М.: НПО «Медицинская энциклопедия» РАМН, ЗАО
«ШИКО», 2001. – 168с.
3. Патология: Руководство / под ред. М.А.Пальцева и др. – М.: ГЕОТАРМЕД, 2002.–960с.
4. Рациональная фармакотерапия сердечно-сосудистых заболеваний. Рук.
для практикующих врачей/Е.И.Чазов, Ю.Н.Беленков, Е.О.Борисова, Е.Е.Гогин
и др. – М.: Литтерра, 2006. – 972с.
5. Бурбелло А.Т. Современные лекарственные средства: Клиникофармакологический
справочник
практического
врача/А.Т.Бурбелло,
А.В.Шабров, П.П.Денисенко. – СПб.: Издательский Дом «Нева»; М.:
Издательство «Олма-Пресс», 2007. – 800с.
222
ИЗУЧЕНИЕ АНТИДЕПРЕССАНТНОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ
Куркин В.А., Дубищев А.В., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Зайцева Е.Н.,
Осипова А.А., Боткин Е.А.
Самарский государственный медицинский университет
Зверобоя трава (Hyperici herba) широко применяется в нашей стране в
качестве противовоспалительного, антимикробного и вяжущего лекарственного
средства [1]. В то же время, за рубежом этот вид сырья является основой для
антидепрессантных препаратов, таких как «Деприм», «Негрустин» и «Гелариум
Гиперикум» [2, 3]. Однако, несмотря на широкое применение препаратов на
основе зверобоя травы, остается открытым вопрос относительно того, какая
группа биологически активных соединений (БАС), обусловливает
антидепрессантный эффект. При этом в литературных источниках
неоднозначно трактуется нейротропный эффект травы зверобоя. Следует также
отметить, что в настоящее время в РФ не производятся антидепрессантные
препараты на основе лекарственного растительного сырья, в то время как
существует объективная потребность в препаратах данного спектра действия.
Однако создание импортозамещающих антидепрессантных препаратов
возможно только на основе детального изучения химического состава сырья
зверобоя, физико-химических и фармакологических свойств индивидуальных
соединений.
Как известно, зверобоя трава содержит флавоноиды (рутин, гиперозид,
бисапигенин),
антраценпроизводные
(гиперицин,
псевдогиперицин),
флороглюцины (гиперфорин), дубильные вещества, эфирное масло и многие
другие БАС [1, 3]. Сложный химический состав сырья создает определенные
трудности для разработки унифицированного подхода к анализу сырья и
препаратов зверобоя. Для решения проблем стандартизации проведено
изучение химического состава травы зверобоя продырявленного с помощью
колоночной хроматографии, при этом получен ряд биологически активных
соединений в индивидуальном виде, которые были идентифицированы как
3,811-бисапигенин, кверцетин, 6,811-дикверцетин, гиперозид, рутин, гиперфорин
и хлорогеновая кислота [3]. Следует отметить, что 3,811-бисапигенин впервые
выделен из травы зверобоя продырявленного, произрастающего в РФ, а 6,811дикверцетин, является новым природным соединением и впервые описано для
рода Hypericum L. На основе результатов исследования химического состава
биологически активных соединений, их физико-химических, спектральных и
фармакологических свойств нами разработан методологический подход к
анализу сырья и препаратов травы зверобоя, сочетающий в себе определение
суммы флавоноидов и антраценпроизводных и позволяющий объективно
проводить оценку содержания основных БАС в сырье и препаратах зверобоя
[3, 4].
223
В литературных источниках сообщается о наличии антидепрессантных
свойств гиперицина и гиперфорина, причем для последнего компонента нами
также выявлена нейротропная активность [2, 3]. Ранее нами также был
обнаружен выраженный антидепрессантный эффект для флавоноида
гиперозида [2], однако не подтверждены данные зарубежных ученых
относительно антидепрессантных свойств для рутина [6].
Целью настоящей работы являлось изучение антидепрессантной
активности новых лекарственных средств и некоторых индивидуальных
биологически активных соединений зверобоя травы.
Оценку антидепрессантной активности проводили с использованием
теста «Отчаяние» [5], в условиях которого в течение пяти минут фиксируется
время активных попыток животных выбраться из воды. Исследования
проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 150-240 г. При
этом животные содержались в условиях вивария на обычном рационе. В
каждом опыте нами были использованы по восемь животных. Исследуемые
препараты вводили внутрижелудочно через зонд в течение 10 дней. Последний
раз препараты вводили за 30 мин до начала исследования. В качестве препарата
сравнения антидепрессантного эффекта фитопрепаратов нами использован
амитриптилин в дозе 5 мг на кг массы тела животного.
Нами был исследован новый лекарственный препарат «Зверобоя
настойка», полученный на основе травы зверобоя продырявленного в
соотношении сырье-экстрагент 1:5. Экстрагентом для данного препарата
являлся 70 % этиловый спирт, в отличие от промышленного препарата, для
которого используется 40 % этиловый спирт. Как было показано ранее,
«Зверобоя настойка» отличается от препарата с аналогичным названием,
выпускаемого промышленным способом, более высоким содержанием
основных БАС и более выраженным фармакологическим эффектом [3]. Данный
препарат вводили животным из расчета 100 мг на кг массы тела животного. Для
этого 1 мл препарата разводили в 50 мл воды очищенной. В контроле
использовали раствор, состоящий из 1 мл 70 % спирта этилового и 50 мл воды
очищенной.
Далее нами проводилось исследование «Зверобоя экстракта сухого»,
полученного из травы зверобоя продырявленного. Для этого нами был получен
жидкий экстракт зверобоя в соотношении сырье-экстрагент 1:1 с
использованием в качестве экстрагента для этого препарата 70% этилового
спирта. «Зверобоя сухого экстракта» был получен путем высушиванием
жидкого экстракта. Для эксперимента использовали сухой экстракт в дозе 2
мг/кг. Вводили животным препарат, смешанный с 1 % раствором крахмала.
Контрольная группа крыс при этом получала 1 % раствор крахмала.
В качестве одного из препаратов сравнения нами был использован
«Деприм». Для этого таблетки освобождали от оболочки и растирали в
фарфоровой ступке. Данный препарат также смешивали с раствором крахмала
и вводили животным из расчета 10 мг/кг. Кроме того, нами были исследованы
биологические свойства компонента биаспигенина, который вводили
224
однократно, параллельно сравнивали эффекты однократного ведения
амитриптилина.
Как показали результаты, под действием исследуемых препаратов
существенно увеличивается время активных попыток животных выбраться из
воды. Так, сухой экстракт зверобоя увеличивает антидепрессантный эффект
почти в два раза по сравнению с контролем. «Зверобоя настойка» и «Деприм»
увеличивают время движения животного в эксперименте на 25 % и 48 %
соответственно. Следует отметить, что разработанный нами препарат
«Зверобоя экстракт сухой», обладает более выраженной антидепрессантной
активностью по сравнению с зарубежным лекарственным средством «Деприм».
Также нами обнаружена антидепресантная активность флавоноидного
вещества бисапигенина, из чего следует, что этот компонент также влияет на
развитие фармакотерапевтического эффекта препаратов зверобоя. При
исследовании антидепрессантной активности бисапигенина происходит
увеличение времени движения животных на 58 %, тогда как в случае
амитриптилина этот показатель составляет лишь 12 %. Это обстоятельство
является очень важным, ведь данный компонент является уникальным для
зверобоя травы. Следовательно, необходимым условием, на наш взгляд,
является обнаружение бисапигенина как диагностического флавоноида при
фитохимическом исследовании сырья и препаратов зверобоя травы, особенно в
плане стандартизации.
Литература
1. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник. - 2-е изд., перераб. и доп. / В.А.
Куркин. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2007. - С. 794799.
2. Куркин, В.А. Исследование сырья и препаратов зверобоя / В.А. Куркин,
О.Е. Правдивцева, А.В. Дубищев, Д.В. Кадацкая, Г.Г. Запесочная, И.П.
Жданов // Фармация. – 2005. - Т. 53, № 3. – С. 23-25.
3. Куркин, В.А. Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных
средств / В.А. Куркин, О.Е. Правдивцева. – Самара: ГОУ ВПО
«СамГМУ»; ООО «Офорт», 2008. – 127 с.
4. Правдивцева, О.Е. Обоснование ресурсосберегающих технологий
производства и переработки сырья зверобоя / О.Е. Правдивцева, В.А.
Куркин // Специальный выпуск ―III Всероссийская научно-практическая
конференция «Процессы, технологии, оборудование и опыт переработки
отходов и вторичного сырья». Издательство: Самарский научный центр
Российской академии наук. – 2008. – С. 156-158.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб.
и доп. – М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.
6. Buttenwerck, V. Flavonoids from Hypericum perforatum show antidepressant
activity in the forced swimming test / V. Buttenwerck, G. Jurgenliemk, A.
Nahrstedt, H. Winterhoff // Planta Medica. – 2000. - Vol. 66. - P. 3-6.
225
ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ
И ПРЕПАРАТОВ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО
Куркин В.А., Буланкин Д.Г. e-mail: [email protected]
Самарский государственный медицинский университет
Гинкго двулопастный (Ginkgo biloba L.), в переводе с японского —
«серебряный абрикос», или «серебряный плод» представляет собой высокое
дерево. «Живая окаменелость» – именно так называл гинкго Чарльз Дарвин.
Гинкго двулопастный произрастает в странах с субтропическим климатом,
однако возможно его культивирование и в Российской Федерации, в частности,
в Краснодарском и Ставропольском краях, а также на п-ве Крым.
Листья гинкго двулопастного входят в Европейскую и Американскую
фармакопеи, а также включены в Государственный реестр лекарственных
средств. Препараты листьев гинкго широко применяются за рубежом, однако
на российском фармацевтическом рынке они представлены преимущественно в
виде биологически активных добавок (несколько десятков), которые, как
известно, практически не анализируются на содержание действующих веществ.
На основе извлечений из листьев гинкго двулопастного разработаны
препараты: танакан, билобил, мемоплант, гинкор форт, гинкор гель и др.,
однако они производятся за рубежом и вследствие этого являются
дорогостоящими.
Из листьев, семян и древесины гинкго выделены вещества разных
химических групп с различной фармакологической и терапевтической
активностью. К ним относятся монотерпены – эфир линалоола, производные
фенилпропана (п-цимол, тимол); сесквитерпены – билобалид А, бисаболадиен2,8-дион, билобанон, Е-10,11-алантон, Z-10,11-алантон; трициклические
дитерпены – гинкголиды А, В, С и J.
Целью нашей работы является исследование нейротропной активности
препаратов на основе гинкго двулопастного, а также совершенствование
методов стандартизации сырья и препаратов гинкго.
Для решения поставленных задач из листьев гинкго двулопастного,
культивируемого в Ботаническом саду г. Краснодара, с помощью метода
колоночной хроматографии были выделены флавоноиды нарциссин,
никотифлорин, гинкгетин и изогинкгетин. Кроме того, с помощью ТСХ
(пластинки «Сорбфил ПТСХ-А-А-УФ», система растворителей: хлороформметанол-вода, 26:14:3), в сравнительном плане исследован компонентный
состав разработанных лекарственных средств и препарата «Билобил».
Исследовали нейротропные свойства нового лекарственного средства
«Гинкго двулопастного настойка», полученного на основе листьев гинкго
двулопастного в соотношении сырье-экстрагент 1:5, сухого экстракта гинкго
двулопастного, а также препарат «Билобил» на основе стандартизированного
экстракта гинкго двулопастного EGb 761. Следует отметить, что препараты
«Гинкго двулопастного настойка» и «Гинкго двулопастного экстракт сухой»
226
отличаются от импортных лекарственных средств на основе гинкго
двулопастного, выпускаемых промышленным способом, более разнообразным
составом. Препарат «Гинкго двулопастного настойка» вводили животным из
расчета 100 мг на кг массы тела животного. При этом 1 мл настойки гинкго
разводили в 50 мл воды очищенной, а в контроле использовали раствор,
состоящий из 1 мл 70% спирта этилового и 50 мл воды очищенной. Препараты
«Гинкго двулопастного экстракт сухой» и «Билобил» вводили животным в дозе
20 мг/кг массы тела животного. Кроме того, нами были исследованы
биологические свойства выделенного нами флавоноида гинкгетина –
диметилового эфира аментофлавона – индивидуального БАС. Гинкгетин
вводили однократно в дозе 5 мг/кг массы тела животного, и параллельно
сравнивали эффекты однократного введения пирацетама.
Оценку ноотропной активности проводили с использованием теста «Тобразный лабиринт», в условиях которого фиксируется время активных
попыток животных обнаружить еду и питье после недельной пищевой и
питьевой депривации. Исследования проводили на белых беспородных крысах
обоего пола массой 150-240 г. При этом животные содержались в условиях
вивария на обычном рационе. В каждом опыте нами были использованы по
восемь животных. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно через
зонд в течение 4 и 10 дней. Последний раз препараты вводили за 30 мин до
начала исследования. В качестве препарата сравнения ноотропного эффекта
фитопрепаратов нами использован пирацетам в дозе 5 мг на кг массы тела
животного. На основе полученных результатов исследования нами сделан
вывод о том, что полученные на кафедре фармакогнозии СамГМУ препараты
гинкго обладают выраженной нооторопной активностью – того же уровня, что
и синтетические препараты (пирацетам).
Кроме того, исследования ноотропной активности проводились с
помощью теста «Открытое поле». Результат в данном тесте рассчитывается с
помощью вычисления количества показателей беспокойства в течение 5 минут
(грумминг,
вертикальная
активность,
горизонтальная
активность,
исследовательская деятельность) при помещении животного в огороженный
квадратный периметр с размером стороны 1 метр, размеченный на квадраты и
имеющий отверстия в каждом из них. При уменьшении количества показателей
беспокойства во времени у каждого конкретного животного можно
предполагать улучшение деятельности ЦНС. Тест проводился также, как и
предыдущий, в течение 4 и 10 дней. В данном тесте более выраженный
ноотропный эффект выявлен в случае настойки гинкго двулопастного,
полученной на кафедре фармакогнозии СамГМУ.
Психостимулирующую активность препаратов на основе гинкго
двулопастного выявляли с помощью теста на снотворную активность.
Тиопентал натрия вводился из расчета 40 мг/кг внутрибрюшинно, наступление
сна фиксировалось по принятию животным бокового положения, выход из
наркоза – по выходу из бокового положения (табл.1).
227
Таблица 1
Результаты исследования психостимулирующей активности препаратов
гинкго двулопастного
(Тест «Тиопенталовый сон»)
№
Продолжительность сна, мин
п/п Пирацетам Настойка гинкго Билобил Экстракт гинкго Контроль
1
25
24
20
17
27
2
26
25
18
16
30
3
26
23
16
19
28
4
27
21
18
17
28
5
26
23
17
20
27
6
25
24
20
18
30
7
27
25
21
17
28
8
25
22
18
19
27
M±m 25,9±0,83
23,4±1,41
18,5±1,69
17,8±1,36
28,1±1,25
Р<0,05
Обнаруженная
нами
ноотропная
активность
бифлавоноидного
соединения гинкгетина (диметиловый эфир аментофлавона) показывает, что
этот компонент также влияет на развитие фармакотерапевтического эффекта
препаратов гинкго. При исследовании ноотропной активности гинкгетина
наблюдается уменьшение времени нахождения животными пищевого и
питьевого мотиватора на 30-40%, как и в случае пирацетама. Это
обстоятельство является очень важным, ведь данный флавоноид является
уникальным биологически активным соединением для гинкго двулопастного.
Интересно, что ранее сообщалось лишь о биологической активности
флавоноида аментофлавона, однако содержание этого компонента в листьях
гинкго двулопастного невысокое. Следовательно, необходимым условием, на
наш взгляд, является обнаружение гинкгетина при фитохимическом
исследовании сырья и препаратов листьев гинкго, особенно в плане
совершенствования
методов
их
стандартизации.
Разработанные
импортозамещающие лекарственные средства «Гинкго двулопастного
настойка» и «Гинкго двулопастного настойка» отличаются от импортных
препаратов на основе гинкго двулопастного, выпускаемых промышленным
способом, более разнообразным составом биологически активных соединений
и более выраженным фармакологическим эффектом.
По итогам наших исследований можно сделать следующие выводы:
новые лекарственные препараты «Гинкго двулопастного настойка» и «Гинкго
двулопастного экстракт сухой» обладают выраженным ноотропным и
психотонизирующим действием; флавоноид гинкгетин, выделенный из листьев
гинкго, обладает выраженной ноотропной активностью; гинкгетин является
одним из доминирующих и характерных биологически активных соединений
листьев гинкго, поэтому целесообразным является обнаружение данного
флавоноида при стандартизации сырья и препаратов данного растения.
228
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ
БЕССМЕРТНИКА ПЕСЧАНОГО
Куркина А.В. е-mail: [email protected]
Самарский государственный медицинский университет
Цветки бессмертника песчаного [Helichrysum arenarium (L.) Moench., сем.
Сложноцветные – Asteraceae] широко применяются в медицинской практике в
качестве желчегонного средства в виде настоя, жидкого экстракта, фламина и
различных желчегонных сборов [2-5]. Желчегонное действие препаратов данного
растения
обусловлено
флавоноидами,
среди
которых
преобладают
изосалипурпозид, салипурпозид, прунин, нарингенин, однако в литературе нет
единой точки зрения, какой из этих компонентов является доминирующим.
На наш взгляд, именно сложность химического состава цветков
бессмертника песчаного является причиной того обстоятельства, что до сих пор
не решены проблемы стандартизации сырья и препаратов данного растения.
Так, в фармакопейной статье (ФС 9 «Цветки бессмертника песчаного»),
приведенной в ГФ СССР XI издания [1], раздел «Качественные реакции»
представлен только качественной реакцией на флавоноиды, которая не
позволяет определять отдельные компоненты, характерные для данного
растения.
Кроме того, в разделе
«Количественное определение» не
используется Государственный стандартный образец (ГСО) изосалипурпозида,
а метод прямой спектрофотометрии приводит к завышению результатов
анализа, тем более на фоне отсутствия унифицированных подходов к
стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного.
Цель настоящего исследования – совершенствование методов
стандартизации цветков бессмертника песчаного и препаратов на их основе.
Исследовали цветки бессмертника песчаного, произрастающего в
Самарской области (с. Демидовка), а также промышленные образцы сырья,
фламина и жидкого экстракта. Для качественного анализа сырья использовали
метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Силуфол УФ 254» и
«Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» (система растворителей: хлороформ-метанолвода, 26:14:3). УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре «Specord 40»
(Analytik Jena).
На хроматограмме извлечения и раствора исследуемых препаратов при
визуальной
оценке
обнаруживается
доминирующий
флавоноид
изосалипурпозид в виде пятна желтого цвета с величиной Rf около 0,6. При
этом на хроматограмме извлечения обнаруживаются и другие флавоноиды,
характерные для данного растения – салипурпозид (5-О-глюкозид нарингенина)
и прунин (7-О-глюкозид нарингенина) в виде одного пятна с фиолетовой
флуоресценцией в УФ-свете при длине волны 254 нм. Последующее
проявление хроматограммы раствором диазобензолсульфокислоты позволяет
еще более четко обнаружить доминирующее пятно изосалипурпозида на уровне
пятна ГСО изосалипурпозида.
229
С целью совершенствования методики количественного определения
нами изучены условия экстракции флавоноидов из цветков бессмертника
песчаного. Показано, что оптимальным экстрагентом является 70% этиловый
спирт, в то время как в ГФ СССР XI издания используется 50% этиловый спирт
[1]. В основу разработанной нами методики количественного определения
положены следующие оптимальные параметры: экстракция сырья 70%
этиловым спиртом в течение 1 часа в условиях кипения в соотношении 1:50,
измерение оптической плотности при длине волны 418 нм в условиях
дифференциальной спектрофотометрии. В УФ-спектре раствора водноспиртового извлечения обнаружены два наиболее характерных максимума
поглощения в области 295 нм и 335 нм (рис. 1). Следует отметить, что в
соответствующей фармакопейной статье в качестве аналитической длины
волны выбрана величина 315 нм [1], то есть один из минимумов кривой
поглощения. На наш взгляд, использование данной аналитической длины
волны приводит к завышению результатов анализа, так как в этой области УФспектра имеет место вклад в оптическую плотность сопутствующих веществ,
содержащихся в цветках бессмертника песчаного, т – гидроксикоричных
кислот (максимумы поглощения 290, 327 нм), кумаринов (максимум
поглощения около 340 нм) и фталидов (максимум поглощения 270 нм).
Изучение УФ-спектра водно-спиртового извлечения в присутствии AlCl3, в том
числе в дифференциальном варианте показало, что один из максимумов
поглощения наблюдается при длине волны 418 нм (рис. 1 и 2). Причем характер
поглощения этого спектра коррелирует с УФ-спектром изосалипурпозида: в
присутствии AlCl3 наблюдается батохромный сдвиг максимума при 370 нм в
область 418 нм. Это позволяет сделать вывод о том, что в присутствии AlCl3
характер кривой поглощения УФ-спектра водно-спиртового извлечения
цветков бессмертника обусловлен в основном изосалипурпозидом.
Рис. 1. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из
цветков бессмертника песчаного.
Обозначения: 1 – исходный раствор;
2 – раствор в присутствии AlCl3.
230
Рис. 2. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из цветков
бессмертника песчаного (дифференциальная спектрофотометрия).
На этом основании разработан метод определения суммы флавоноидов с
использованием аналитической длины волны 418 нм в варианте
дифференциальной УФ-спектроскопии, позволяющей исключить вклад в
оптическую плотность сопутствующих веществ. Содержание суммы
флавоноидов в различных образцах цветков бессмертника песчаного
колеблется в пределах 3,50-3,80 % (в пересчете на изосалипурпозид).
Содержание суммы флавоноидов в жидком экстракте варьирует в интервале
3,07-3,20 % (в пересчете на изосалипурпозид).
Таким образом, разработаны новые подходы к стандартизации сырья и
препаратов бессмертника песчаного, заключающиеся в определении
флавоноидов методами ТСХ и дифференциальной спектрофотометрии с
использованием в методиках анализа ГСО изосалипурпозида.
Литература
1.Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа.
Лекарственное растительное сырье/ МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М.: Медицина,
1989. - 400 с.
2.
Государственный реестр лекарственных средств. – Т. 1, 2.
Официальное издание. – М., 2008.
3.Куркин В.А. Основы фитотерапии: Учебное пособие для студентов
фармацевтических вузов. – Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ
Росздрава», 2009. - 963 с.
4.Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических
вузов (факультетов.). - 2-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ
ВПО «СамГМУ Росздрава», 2007. - 1239 с.
5.Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический
состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). – СПб.: наука, 1993.
– С. 120–123.
231
ЗАПАСЫ СЫРЬЯ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ДИКОРАСТУЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЗОНЫ ТЕРСКОСУНЖЕНСКОЙ РАВНИНЫ РСО-АЛАНИЯ
Кусова Р.Дз. e-mail: [email protected]
Северо-Осетинский государственный университет
Рост потребности в лекарственном растительном сырье в последние годы
связан с возрождением фармацевтической промышленности, ростом выпуска
биологически активных добавок и потреблением лекарственных растений
другими отраслями промышленности, в частности косметической и
парфюмерной. Развитие фармацевтической промышленности невозможно без
увеличения базы растительного сырья. Отсутствие сырья является
сдерживающим фактором для развития многих отраслей народного хозяйства, в
том числе малых и средних предприятий
Эта проблема возникла еще в начале 90-х годов прошлого столетия,
происходило ежегодное уменьшение заготовки растительного лекарственного
сырья по всей России, в том числе и республики Северная Осетия-Алания. Это
связано с многочисленными причинами. В частности уменьшились площади, на
которых культивировались лекарственные растения, лучшие земли были
заняты под сельскохозяйственные культуры, часть угодий занято под жилые и
промышленные застройки.
Таким образом, можно считать, что отсутствие роста сырьевой базы
является проблемой для ряда отраслей народного хозяйства и, прежде всего
фармацевтической промышленности.
В то же время в Российской Федерации имеются регионы, которые по
своим природно-климатическим условиям представляют огромный резерв для
заготовки лекарственного растительного сырья. К таким регионам относится
республика Северная Осетия-Алания. Ее флора включает множество различных
видов растений. Этим, очевидно, объясняется большое внимание к республике
многих ученых [2,4].
Основной целью исследования является изучение современного
состояния ресурсов дикорастущих лекарственных растений (ДЛР) республики
Северная Осетия-Алания и оценка их качества.
РСО-Алания расположена на северном склоне Центрального Кавказа,
занимая горную, предгорную и частично равнинную части Северного Кавказа.
В силу неоднородности рельефа территория республики классифицируется по
высотным ярусам: равнины; низкогорья, среднегорья (нижний и верхний
ярусы), высокогорья [1].
К числу экологически чистых районов относится зона ТерскоСунженской равнины РСО-Алания, которая по административнотерриториальному делению относится к Моздокскому району. Район
расположен в северо-восточной части республики степного пояса.
232
Моздокская степь с абсолютными высотами 100-200м над уровнем моря
сложена песчано-глинистыми и алльювиальными отложениями р. Терек. Почвы
каштановые, темно-каштановые, глинистые и суглинистые; аллювиальные. Тип
растительности полынно-злаковая и разнотравно-злаковая степи.
ДЛР зоны Терско-Сунженской равнины РСО-Алания в определенной
степени свободны от пестицидов, т.к. сельхозугодия сравнительно отдалены.
Здесь имеются участки, на которые практически не сказывается хозяйственная
деятельность человека. По поймам рек узкими полосами протянулись
припойменные леса. Древесная и кустарниковая растительность здесь
представлена дубом, ясенем и кленом. Реже встречаются яблоня, груша,
некоторые виды боярышника и шиповника, терн, кизил. Нередко можно
наблюдать заросли хмеля [4].
В данном сообщении мы отразили сырьевой потенциал ДЛР Моздокского
района. Ресурсные исследования и расчеты запасов лекарственного
растительного сырья (ЛРС) проводили по общепринятым методикам [3].
В результате экспедиционных исследований выявили, что районы
кассового произрастания ДЛР приурочены к пойме реки Терек и его притоков.
При обследовании территории нами было выявлено 35 вида ДЛР. В табл. 1
отражены результаты запасов возможных промысловых заготовок РЛС.
Таблица 1.
Площади зарослей и запасы лекарственного растительного сырья
в Моздокском районе
Запас воздушно-сухого сырья, т
Объем
возможной
ежегодной
заготовки, т
№
п/п
ЛРС
Площадь
участка, га
биологический
эксплуатационный
1
Трава пустырника
6,91
7,659
5,758
1,151
2
Трава череды
2,51
0,648
0,485
0,096
3
Трава чабреца
13,63
2,907
1,794
0,355
4
Трава зверобоя
16,29
2,946
1,589
0,674
13,09
3,043
2,516
0,507
6,53
1,578
1,189
0,234
2,64
2,242
1,755
0,355
2,78
2,393
1,798
0,359
3,18
14,83
11,217
11,267
9,545
4,709
0,477
0,313
24,63
13,254
9,320
9,320
2,16
0,343
0,201
0,040
5
6
7
8
9
10
11
12
Трава
тысячелистника
Лист мать-имачехи
Лист крапивы
Трава шалфея
эфиопского
Корень девясила
Корень алтея
Плоды шиповника
Трава и цветки
бессмертника
233
Анализируя
результаты
экспериментальных
исследований,
представленные в таблице1, позволяют рекомендовать для промышленной
заготовки 12 видов ЛРС из них наиболее значимые по объему возможной
ежегодной заготовки плоды шиповника (более 9,3 т), трава пустырника (до 5,7
т), а также корней девясила с учетом сроков восстановления зарослей до 0,5 т,
травы зверобоя до 0,7 т, травы тысячелистника свыше 0,5 т, травы
бессмертника около 0,2 т.
Литература
1.
Дудаева З.С. Агроприродное районирование Северо-Осетинской
АССР// основные проблемы физической географии Северного Кавказа и
рациональное природопользование/ Сб. науч. труд.- Владикавказ, 1992. С.- 6070.
2.
Кусова Р.Дз. Исследование ресурсов лекарственных растений
равнинно-предгорных районов Республики Северная Осетия-Алания. //
Фармация. 2006. № 4. – С. - 18-20.
3.
Муравьева Д.А., Попова О.И., Кусова Р.Д. и др. ресурсоведение
лекарственных растений: Учебное пособие; Сев.-Осет.гос. ун-т.- Владикавказ:
Изд-во СОГУ,2008.-220с.
4.
Муравьева Д.А., Кусова Р.Дз., Акопов А.А. Лекарственные
растения Северной Осетии. Владикавказ, 2005, 112 с.
234
ИЗУЧЕНИЕ ДИСПЕРСИИ КОМПЛЕКСА ХИТОЗАНА
С ПОЛИМЕТАКРИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
Лапенко В.Л.1, Сливкин Д.А.2, Быков В.А.2
1
Воронежский государственный университет
2
Российский университет дружбы народов
Полиэлектролитные комплексы (ПЭК) на основе хитозана (ХТЗ),
образующиеся в процессе формирования ассоциатов с характерными свойствами,
в частности частиц с размером на наноуровне находят применение в науке и
практике разнообразных отраслей. Процесс образования таких систем протекает
практически в условиях самоорганизации. В современных публикациях показана
перспективность подобных формирований при использовании их в фармации и
медицине в качестве носителей лекарственных веществ.
Целью настоящих исследований была разработка лабораторных
технологических методов получения полимерных комплексов ХТЗ с винильными
анионактивными полимерами – полиакриловой (ПАК) и полиметакриловой
(ПМАК) кислотами. В качестве полимерного компонента – аминогликана
использовался крабовый ХТЗ с молекулярной массой в пределах 20 – 50 кДа,
полученный в условиях контролируемой деполимеризации высокомолекулярного
аминогликана химическим методом. Образование ПЭК изучалось в условиях
матричной и смешанной полимеризации анионактивных винильных мономеров на
структуре макромолекул ХТЗ. Использовались различные варианты мольного
соотношения катионактивного полимера и мономеров. Процесс включал
предварительное образование солевых структур ХТЗ с акриловой (метакриловой)
кислотой в водной среде. Исследованы соотношения катионактивного полимера и
анионактивных мономеров в пределах 1: 1 – 1:2. В первом случае имеет место
образование двухцепочечных ориентированных структур. При избытке
винильных мономеров предполагается формирование ассоциатов, содержащих
различные изгибы и петли. В качестве инициатора радикальной полимеризации
винильных мономеров использовался ДАК (2% в отношении винильного
мономера) при термостатировании 60 – 80˚С и интенсивном перемешивании.
Оптимальное соотношение массы аминогликана и водной среды 1:7. При
соотношении ХТЗ и винильного мономера 1:2, благодаря одновременному
развитию матричного направления полимеризации и гомополимеризации
анионактивного мономера вероятно образование ПЭК с взаимопроникающей
структурой макромолекул.
Особое внимание при проведении исследований уделялось поиску
возможностей получения на основе образующихся ПЭК ХТЗ стабильных
высокодиспергированных водных систем. Для этого оказалось целесообразным
использование метода синтеза ПЭК путѐм взаимодействия аминогликана и
анионактивных мономеров (акриловая, метакриловая кислоты) в соотношении 1:2
в процессе полимеризации. В этих условиях в состав реакционной системы
вводился также сшивающий реагент N,N'-(метиленбисакриламид; 4*10‾³моль/л).
235
В данных условиях образуется достаточно стабильная дисперсия с концентрацией
полимерного компонента ≈13%. Полученные указанным методом водные
дисперсии комплексов хитозана с ПАК и ПМАК стабильны при разбавлении их
до концентрации 0,5 – 0,6% (20 - 22˚С) в течение более 60 суток. Степень
дисперсности полученных систем оценивалась методом светорассеяния и
соответствовала диапазону размера суспендированных частиц 305 - 310 нм.
Изучение состава и структуры полученных комплексов проводилось методами
вискозиметрии, нефелометрии, ИК-спектроскопии, рентгеноструктурного
анализа, электронной микроскопии.
Изучалась плѐнкообразующая способность ПЭК на основе ХТЗ и ПМК,
полученного в присутствии сшивающего реагента (соотношение катионактивного
и анионактивного компонентов 1:2). Визуально прозрачная и практически
бесцветная плѐнка формируется при высушивании соответствующей водной
дисперсии на стеклянной поверхности в открытой системе при температуре
окружающей среды; адгезия плѐнки к стеклу минимальна. Установлена
возможность регенерации соответствующей водной дисперсии путѐм
диспергирования полученной плѐнки в воде. Методом обратного
потенциометрического титрования определено содержание в составе ПЭК
свободных карбоксильных групп. Обработка ПЭК водным раствором щѐлочи
производилась в мягких условиях, исключающих разрушение солевых связей ХТЗ
и ПМАК. Найдено отличие показателей по содержанию карбоксильных групп в
ПЭК, полученных при титровании комплекса от теоретически расчѐтных
(соотношение полимерных компонентов 1:2). Это объясняется наличием
пространственных затруднений в составе полимерной системы при
взаимодействии со щелочным компонентом в мягких условиях.
Изучена возможность получения нанодисперсии на основе ХТЗ и ПМАК
(1:2), загруженной частицами коллоидного золота (КЗ). Известны
химиотерапевтические методы диагностики и химиотерапии онкологических
заболеваний с использованием препаратов КЗ. В условиях комбинирования
синтезированного ПЭК (углеводного типа) и высокодисперсного компонента
золота изучалась возможность получения наносистемы, обеспечивающей целевую
транспортировку Au (золота) к соответствующим патологическим мишеням в
организме. Наличие ионоактивных группировок в структуре диспергированного
ПЭК, сорбционная комплексообразующая способность обеспечивает высокую
вероятность объединения наночастиц и ПЭК с коллоидными формированиями
золота. Отмечена стабильность нанодисперсии ПЭК на основе хитозана и ПМАК
после загрузки еѐ КЗ. Препарат, использовавшийся для введения металла в
нанодисперсию ХТЗ, представлял собой коллоидный раствор с концентрацией
золота 0,24 мг/мл. Размер частиц в составе дисперсии после еѐ загрузки КЗ был
достаточно стабильным – 325 – 350нм (светорассеяние). Контролирование
биологической активности полученного золотосодержащего препарата в
настоящее время производится на животных объектах (крысы с привитой
лимфосаркомой Плисса) путѐм перорального введения в организм. По
предварительным данным имеет место прекращение роста опухолей и частичное
уменьшение их объѐма.
236
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИК-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ В
ОБНАРУЖЕНИИ ФАЛЬСИФИЦИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ ГРУППЫ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ
Лебедева Н.Н. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова
В последние годы отмечается тенденция к увеличению потребления
лекарственных средств. Связано это, прежде всего, с реализацией
государственных программ и появлением на российском фармацевтическом
рынке высокоэффективных лекарственных препаратов.
Одной из актуальных проблем фармацевтического анализа является
разработка быстрых, надежных и по возможности, универсальных способов
определения активного компонента в лекарственных средствах – субстанциях и
готовых формах, что необходимо для обеспечения быстрого и достоверного
контроля качества и выявления фальсифицированной продукции.
Материалы и методы. В работе проанализированы субстанции
российского производства – цефазолина натриевая соль, цефалексин,
цефамандола нафат, цефотаксима натриевая соль, цефтазидим натрия карбонат,
цефтриаксона натриевая соль, цефуроксим (цефурабола натриевая соль),
цефоперазона натриевая соль и зарубежного производства - цефалотина
натриевая соль (Италия), цефоперазона натриевая соль (Индия). Кроме этого
анализу подвергались препараты, содержащие цефазолина натриевую соль,
цефалексин, цефамандола нафат, цефотаксим, цефтазидим, цефтазидима
натриевую соль, цефтриаксон, цефуроксим, цефоперазона натриевую соль,
цефаклор в различных лекарственных формах (порошок для приготовления
раствора для инъекций и капсулы). Всего проанализировано 28 лекарственных
препаратов.
В работе использовали однолучевой интерференционный (с обратным
преобразованием Фурье) ИК – спектрофотометр Инфралюм ФТ – 02 (НПФ
«ЛЮМЭКС», Россия). Параметры записи спектров: диапазон 4000 – 400 см-1,
разрешение 1 см-1, циклическая запись с количеством сканов 20, аподизация
стандартная. Фоновый спектр (воздух) получали непосредственно перед
записью каждого спектра. Управление прибором и обработку спектров
осуществляли с использованием программы «Спектралюм» (НПФ
«ЛЮМЭКС», Россия) и программы «ACD/SpecViewer», Freeware Version
(Advanced Chemistry Development, Канада).
Пробоподготовку субстанций проводили в соответствии с требованиями
ГФ XI. Навеску субстанции массой 15 мг измельчали в агатовой ступке и
растирали с 1 – 2 каплями вазелинового масла качества «для ИКспектроскопии».
Результаты. На рис. 2 в качестве примера представлен ИК-спектр
субстанции цефотаксима натриевой соли, а на рис. 1 ИК-спектр вазелинового
масла для сравнения
237
На спектрах полосы с частотами около 2955, 2924, 2855 см –1
соответствуют валентным колебаниям С–Н вазелинового масла. Полосы с
частотами около 1462, 1377 и 721 см–1 соответствуют деформационным
колебаниям С–Н вазелинового масла. Все полосы в спектрах перекрываются
аналогичными полосами вазелинового масла. Набор слабых полос с частотами
около 2361, 2346 и 2334 см–1 соответствует колебаниям присутствующего в
атмосфере углекислого газа и не включается в интерпретацию.
100
90
721
2334
2346
2361
80
70
1377
%Transmittance
60
1462
50
40
30
20
2855
2955
10
2924
0
4000
3000
2000
1000
Wavenumber (cm-1)
Рис.1. ИК-спектр вазелинового масла.
90
85
80
80
80
958
75
%Transmittance
3042
3347
3101
3253
%Transmittance
3434
1063
%Transmittance
2728
3578
1029
979
1047
1243
30
10
1700
2923
2956
1800
Wavenumber (cm-1)
0
1600
1500
1400
Wavenumber (cm-1)
1300
1200
1100
1000
4000
3000
Wavenumber (cm-1)
2855
1000
1282
2000
1356
1378
1385
10
3000
40
20
1645
15
4000
50
1290
1542
1730
1759
20
1461
25
10
0
60
1403
1415
40
30
20
1184
1214
45
35
30
70
50
1611
40
1320
1589
55
50
1502
60
995
65
60
1126
1148
1200
70
70
2000
85
80
842
650
472
70
506
572
580
889
748
540
816
799
917
426
432
616
722
557
808
995
%Transmittance
672
701
865
950
958
75
65
775
55
1000
979
60
950
900
850
800
750
700
Wavenumber (cm-1)
650
600
550
500
450
400
Рис.2. ИК-спектр субстанции Цефотаксима натриевой соли в
вазелиновом масле
Выводы.
1. Методика пробоподготовки с использованием минерального масла
качества «для ИК-спектроскопии» не искажает ИК-спектр цефалоспоринов,
позволяет видеть все основные характеристические полосы и может быть
использована в фармакопейном анализе лекарственных средств данной группы
по разделу «подлинность».
2. При контроле качества субстанций цефалоспоринов можно
использовать стандартные ИК-спектры вместо стандартных образцов, что
упрощает анализ и значительно снижает его стоимость.
3. При интерпретации ИК-спектров лекарственных препаратов важно,
чтобы все полосы большой, средней и малой интенсивности имели полное
совпадение с соответствующими полосами стандартного спектра по
положению и относительной интенсивности. Допускается исчезновение или
238
появление полос очень малой интенсивности (1-2% по шкале пропускания),
смещение полос по отношению к стандартному спектру на 0,5% по шкале
волновых часел, а также слияние или расщепление полос, находящихся друг от
друга на расстоянии менее 8 см-1 в области 4000 – 2000 см-1 или менее 4 см-1 в
области 2000 –400 см-1.
4. Описанные методики анализа готовых препаратов цефалоспоринов
могут использоваться для установления подлинности при выявлении
фальсифицированных препаратов, не содержащих заявленное на упаковке
действующее вещество.
Литература
1.
Методы
анализа
лекарств.
Н.П.Максютина,
Ф.Е.Каган,
Л.А.Кириченко и др. Киев: Здоровья,1984 г.
2.
Белобородов В.Л., Зурабян С.Е., Лузин А.П., Тюкавкина Н.А. 2-е
изд. Органическая химия. Основной курс. Книга 1. – М.: Дрофа, 2003.
3.
Государственная фармакопея XI изд.
4.
Б.Н.Степаненко. «Органическая химия». Москва. 1980 г. -С.253.
Методическое пособие (фотометрический анализ).
5.
Экспресс-анализ с целью выявления фальсифицированных
лекарственных средств. Практическое руководство. Фторхинолоны и
цефалоспорины / А.П.Арзамасцев, В.Л.Дорофеев, А.А.Коновалов и др. – М.:
Издательский дом Русский врач, 2003. – 132с.
6.
Counterfeit Drugs, Report of a Join WHO/IFPMA Workshop,1992.
7.
British Pharmacopoeia, 2005.
8.
The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and
Biologicals: 13th ed. – Whitehouse Station, NJ: Merck Research Lab., Division of
Merck & Co., Inc., 2001.
9.
The United States Pharmacopeia, 27th ed.
239
РЕАКЦИИ ГЕТЕРОЦИКЛИЗАЦИИ ГУАНИЛТИОМОЧЕВИНЫ
С α-ГАЛОГЕНКЕТОНАМИ И β-КЕТОЭФИРАМИ
Левина А.М. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Исследованы реакции гуанилтиомочевины с некоторыми циклизующими
агентами как по тиоамидному, так и по амидиновому фраменту. [1-2].
Взаимодействие гуанилтиомочевины с 2-хлор-β-кетоэфирами и 2бромацетофенонами протекает по общему механизму – в реакцию вовлекается
тиоамидный фрагмент гуанилтиомочевины и происходит замыкание
тиазольного цикла с образованием 2-амидино-1,3-тиазолов 1 a-f.
Взаимодействие
протекает
хемоселективно
вследствие
большей
нуклеофильности тиоамидного фрагмента по сравнению с амидиновым
фрагментом.
O
NH
H2 N
N
H
R1
S
R2
NH
Hal
NH2
O
R1
H2 N
acetone/ethanol,
O
R3
N
R2
S
N
H
O
DMFA,
O
200 %
NH
R4
R3
O
R3
O
N
H
R2
S
DMFA,
R1
O
N
R3
N
HC(OEt)3
R4
O
R4
N
2 a-f
1 a-f
O
R1
N
N
N
H
R2
S
3 a-f
(a) R1 = Me, R2 = COOEt, R3 = Me, R4 = Et; (b) R1 = Me, R2 = COOEt, R3 = 4-MePh, R4 = Me;
(c) R1 = Me, R2 = COO(i-Pr), R3 = Me, R4 = Et; (d) R1 = Me, R2 = COO(i-Pr), R3 = 4-MePh, R4 = Me;
(e) R1 = Ph, R2 = H, R3 = Me, R4 = Et; (f) R1 = Ph, R2 = H, R3 = 4-MePh, R4 = Me
Изучена возможность дальнейшей гетероциклизации 1 a-f с образованием
новых линейно связанных гетероциклических систем. В реакции 1 a-f с βкетоэфирами участвует амидиновый фрагмент и происходит замыкание цикла
пиримидона. Реакция приводит к образованию 2-(1,3-тиазол-2-ил)амино-4(3Н)пиримидонов 2 a-f.
Введение триэтилортоформиата в реакцию 1 a-f с β-кетоэфирами
позволяет получить 2-(1,3-тиазол-2-ил)амино-4(3Н)-пиримидинкарбоксилаты 3
a-f.
Структура всех полученных соединений подтверждена методом ЯМР 1Нспектроскопии.
1. J. Lamattina, Ch. Mularski, D. E. Muse, Tetrahedron, 1988, 44, 3073.
2. R. C. Schnur, A. F. J. Fliri, S. Kajiji, V. A. Pollack, J. Med. Chem., 1991, 34, 914.
240
БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТРИЧНЫХ
ТРАНСДЕРМАЛЬНЫХ КОМПОЗИЦИЙ С ГИПОКСЕНОМ
Лосенкова С.О., Степанова Э.Ф., Новиков В.Е. е-mail: [email protected]
Смоленская государственная медицинская академия
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Трансдермальные терапевтические системы (ТТС) представляют собой
альтернативный способ назначения тех лекарств, которые не могут быть введены
иначе, или их традиционный пероральный путь назначения является менее
эффективным. Кожа обладает превосходным барьерным свойством, что
ограничивает типы молекул, которые могут быть через нее введены. Тем не менее,
для лекарств, обладающих этими свойствами, способ трансдермальной доставки
препарата
обеспечивает
непрерывное
дозирование
на
протяжении
продолжительного периода времени [1].
Цель: сравнительный анализ значений скорости трансдермальной подачи и
степени высвобождения гипоксена из модельных образцов пластырей с различным
содержанием в них лекарственного вещества (ЛВ).
Материалы и методы: субстанция гипоксена (ЗАО Корпорация Олифен),
поливинилпирролидон К30 (Biochemica) среднемолекулярный (ПВП К-30), 1,2пропиленгликоль, натрия метабисульфит, спирт этиловый 95%, фольга пищевая,
плѐнка-подложка, фильтровальная бумага «синяя лента», БАД «Наш лецитин».
Субстанцию гипоксена помещали в рабочую ѐмкость V=30 cм³ с учѐтом
влажности субстанции, добавляли заранее приготовленный 1% раствор натрия
метабисульфита в 1,2-пропиленгликоле, тщательно растирали смесь в течение 1015 минут и оставляли в плотно укупоренной ѐмкости до полного растворения
гипоксена на 4часа. Затем прибавляли спирт этиловый 95% и ПВП К-30. Смесь
тщательно гомогенизировали. Композицию наносили на плѐнку-подложку с не
металлизированной стороны. Площадь пластыря 25 см². Высушивали при
комнатной температуре 24 часа.
Таким образом, изготовлены 4 состава трансдермальной композиции с
содержанием гипоксена 0,05; 0,075; 0,1; 0,125 в пластыре. Проведены
биофармацевтические исследования in vitro методом диализа через мембрану с целью
определения зависимости скорости трансдермальной подачи и степени
высвобождения гипоксена из диффузионной матрицы от концентрации ЛВ.
Мембраны получали путѐм приготовления 6% раствора лецитина (БАД «Наш
лецитин» г.Краснодар) в кипящем 95 мас.% спирте этиловом, путѐм погружения
мелкопористых бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 15 см в раствор
лецитина и выдерживания в нѐм в течение 48 часов. Удаления избытка спирта от
фильтров производили деаэрацией [3]. В качестве диализной среды использовали
фосфатный буфер с натрия метабисульфитом рН 7,26 (500 мл фосфатного буфера с
0,25 г натрия метабисульфита) в объѐме 50, 75, 100, 125 мл соответственно. В течение
30минут свободную рабочую поверхность фильтров выдерживали в воде очищенной с
последующим удалением раствора. Данный приѐм использован нами для уменьшения
241
концентрации лецитина, высвобождающегося из мембраны и влияющего на
результаты определения количественного содержания гипоксена в диализате.
Далее на адгезионный слой модельных матриц с гипоксеном (площадь
25см²), полученных по выше описанной технологии, наклеивали образец модели
биологической мембраны, заменяющей «переживающую» кожу животных.
Ламинат модельных матриц с мембраной закрепляли в держателе и погружали в
химический стакан с раствором натрия метабисульфита в фосфатном буфере.
Полученную систему термостатировали при температуре 37±0,5°С. Забор проб
диализата осуществляли через 30минут, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48, 72, 96, 120, 144,
168 часов от начала эксперимента с немедленным возвращением в диализат
взятого объѐма растворителя. Количественное содержание гипоксена в диализате
анализировали УФ-спектрофотометрически на спектрофотометре СФ 2000-02 в
диапазоне волн 200-380 нм. Оптическую плотность измеряли в максимуме
305±3нм. Толщина слоя 10 мм [2].
Начиная с 24 часов наблюдения готовили разведение пробы диализата. Для
этого 3,0 мл пробы помещали в колбу на 25,0 мл и доводили раствором фосфатного
буфера с натрия метабисульфитом до метки. Параллельно измеряли оптическую
плотность контрольного образца. В качестве раствора сравнения использован
раствор натрия метабисульфита в фосфатном буфере. Расчѐты осуществляли с
учѐтом разведения РСО гипоксена.
В качестве основных исследуемых параметров были выбраны количество
высвободившегося (мкг/см²), скорость трансдермальной подачи за определѐнный
промежуток времени (мкг/ч·см²), степень высвобождения (%).
Скорость трансдермальной подачи гипоксена из матричных композиций за
определѐнный промежуток времени через модель биологической мембраны
определяли по формуле: V=Q / t*S, где V – скорость высвобождения гипоксена
через мембрану за определѐнный промежуток времени мкг/ч·см²; Q-количество
гипоксена, проникшее через мембрану за определѐнный промежуток времени, мкг;
t- изучаемый промежуток времени, ч; S – площадь мембраны (пластыря), см².
Результаты и их обсуждение: В процессе эксперимента на протяжении 7
дней наблюдали постепенное увеличение значений степени высвобождения
гипоксена из матриц. Скорость трансдермальной подачи гипоксена при увеличении
его содержания в матрице также возрастает. Прямая пропорциональная
зависимость скорости трансдермальной подачи от содержания гипоксена в матрице
сохраняется до достижения его содержания в матрице 0,1г., а затем перестает
зависеть от него.
Литература
1.Введение лекарственных веществ через кожу – достижения и перспективы
(обзор) / Мизина, П.Г., Быков, В.А., Настина, Ю.И. и др. // Вестник ВГУ. Серия:
Химия. Биология. Фармация. – 2004, №1. – С.176-183.
2.ВФС 42-3508-99 «Раствор гипоксена 7% для инъекций».
3.Пат. 2202835 Россия. Способ получения моделей биологических мембран /
Кайшева Н.Ш., Москаленко С.В. – 2001.
242
ПОИСК ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Лысенко Т.А., Ляхова Н.С., Зацепина Е.Е., Саркисян К.Х., Арльт А.В.,
Куянцева А.М., Сергиенко А.В., Кулешова С.А., Чуклин Р.Е., Масликова Г.В.,
Сампиева К.Т., Алиева М.У., Ивашев М.Н. е-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Актуальность использования лекарственных растений в последние
десятилетия значительно возросла, несмотря на то, что сведения о применении
целебных свойств растений своими корнями уходят в древние времена. Это
связано со многими преимуществами фитотерапии по сравнению с
использованием синтетических лекарственных средств. В связи с этим, одной
из главных задач, стоящих перед фармакологией, является создание новых
эффективных лекарственных средств из растительного сырья. Также
представляет интерес и актуально изучение новых синтетических соединений.
Благодаря комплексному
направлению научных исследований в
Пятигорской государственной фармацевтической академии
на кафедре
фармакологии изучались на предмет биологической активности продукты
синтетического и природного происхождения, предоставляемых кафедрами
фармацевтической химии, технологии лекарств, фармакогнозии, органической
химии и др.
Экспериментальные исследования проводились на бодрствующих и
наркотизированных животных. Некоторые исследования проводились с
использованием современных
компьютерных программ. Полученные
результаты оценивались относительно контроля и препаратов сравнения с
использованием современных методов статистики.
При экспериментальной терапии воспалительного процесса, вызванного
укусами пчел и ос, выявлена противовоспалительная активность экстракта
эмблики лекарственной. В результате исследования биологической активности
настоя бузины черной Sambucus nigra L. (влияние на уровень гемоглобина
настоя бузины при хроническом пероральном введении крысам в течение 2-х
недель) наблюдали повышение уровня гемоглобина по сравнению с
контрольной серией опытов. Представляло интерес изучение кедрового масла,
применяемого в народной медицине. Было исследовано его противоязвенное и
ранозаживляющее действие. Исследование проводилось на модели стероидноэтаноловой язвы. В результате были полученные данные, которые показали
присутствие
гастрорепаративного
эффекта.
Он
оказался
слабее
комбинированной лекарственной формы на основе концентрата облепихового
масла, но более выраженным по сравнению с облепиховым маслом. Было
изучено отхаркивающее действие сиропа, содержащего водорастворимые
полисахариды из надземной части алтея лекарственного. В результате
исследования было установлено, что сироп с водорастворимыми
полисахаридами из алтея лекарственного обладает отхаркивающим действием в
2,3 раза превышающим действие препарата мукалтин.
243
В результате исследования ГАМК и вещества №217 (лабораторный
шифр) выявлено, что они положительно влияют на показатели работы
миокарда у бодрствующих животных в норме и в условиях моделирования
гипертензии и ишемического инсульта мозга. ГАМК и вещество №217
снижают выраженность изменений системной гемодинамики у бодрствующих
крыс, вызванных нагрузочной пробой объемом. В условиях острой сосудистой
патологии мозга натрия селенит (50мкг/кг) и токоферола ацетат (50мг/кг)
повышают двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность
животных. Комбинированное введение натрия селенита (50мкг/кг) и витамина
Е (50мг/кг) снижает смертность животных в 2 раза по сравнению с контролем,
уменьшает
уровень
эмоционального
напряжения.
Получены
экспериментальные данные о том что, соединение МИКС-8 (лабораорный
шифр, производное феноиазина) и препарат сравнения каптоприл у
наркотизированных крыс с ХСН при однократном внутрибрюшинном введении
в дозе, составляющей 1/3000 от LD50, оказывают более выраженный
кардиопротективный эффект, чем при введении данных соединений в других
дозах. При изучении влияния исследуемых соединений на показатели работы
сердца у наркотизированных крыс с хронической сердечной недостаточностью
при курсовом введении (14 дней) в дозе 1/3000 от LD50 установлено, что
соединение МИКС-8 и препарат сравнения каптоприл обладают
кардиопротекторным
действием.
Экспериментально
доказана
противовоспалительная эффективность олеогеля метронидазола с бетакаротином в статике и динамике, наблюдалась положительная динамика всех
симптомов воспалительной реакции: снижение отека, гиперемии и
нормализация температуры воспаленной конечности крыс. Олеогель
метронидазола
с
бета-каротином
вызывал
достоверное
угнетение
экссудативной фазы острого воспаления на 30,3%(р 0,05), по сравнению с
нелеченными животными. Противовоспалительная эффективность олеогеля
составила 58,3%. Изучена антиэкссудативная активность фенолопроизводных
хиназолинона-4 с лабораторными шифрами P-7 и P-8. Исследование проводили
на модели острого воспалительного отѐка, который вызывали субплантарным
введением 0,1 мл 10% водной взвеси каолина в заднюю лапу крысы. Изучаемые
вещества вводили животным внутрибрюшинно в виде водной взвеси в дозе 10
мг/кг, контрольной группе в адекватном количестве вводили физиологический
раствор. Установлено, что исследуемые вещества P-7 и P-8 проявляли
антиэкссудативный эффект по отношению к контролю на 38,6% и 28,4%
соответственно.
Литература
1.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. – 2-е изд., перераб.
и доп. – М.: Медицина, 2005. – 835 с.
244
2.
Галенко-Ярошевский П.А., Гацура В.В. Методы поиска и
доклинического исследования специфической активности потенциальных
сердечно-сосудистых средств. – Краснодар: Просвещение-Юг, 2005. –249 с.
3.
Макарова, Н.В. Статистика в Excel: Учеб. пособие. /Н.В.Макарова,
Трофимец В.Я. // М.: Финансы и статистика, 2002. - 368 с.
245
АКТИВНОСТЬ АКОНИТАЗЫ, ЦИТРАТСИНТАЗЫ И СОДЕРЖАНИЕ
ЦИТРАТА В ТКАНИ МОЗГА ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ И
ДЕЙСТВИИ N-[ИМИНО(1-ПИПЕРИДИНИЛ)МЕТИЛ]ГУАНИДИНА НА
ФОНЕ РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИИ
Макеева А.В., Суховеева О.В., Попова Т.Н. e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Согласно современным представлениям, оксидативный стресс принято
рассматривать в качестве центрального звена в развитии состояния
дезадаптации и возникновения патологии [1]. Основными механизмами
активации свободнорадикального окисления (СО) при этом являются:
значительное увеличение выработки активных форм кислорода (АФК) и
высвобождение каталитически активных ионов Fe2+ из вне- и внутриклеточных
депо [2]. Известно, что в условиях активации СО наблюдаются существенные
изменения в активности ряда ферментов. В частности, имеются данные, что
одной из мишеней действия свободных радикалов является аконитатгидратаза
(АГ, К.Ф.4.2.1.3) [3]. Снижение активности данного фермента может приводить
к накоплению цитрата, являющегося эффективным низкомолекулярным
антиоксидантом, вследствие хелатирующих свойств по отношению к ионам
Fe2+ [4]. Метаболизм цитрата находится под контролем цитратсинтазы (ЦС),
однако решающую роль в регуляции накопления цитрата отводят аконитазе.
Для снижения степени развития оксидативного стресса в медицинской
практике широко используют природные и синтетические антиоксидантные
средства, инактивирующие радикальные молекулы и препятствующие их
образованию. Поскольку особая чувствительность головного мозга к
окислительному стрессу объясняется его низкой антиоксидантной защитой, то
проблема поиска веществ, обладающих выраженным органотропным
протекторным действием, является весьма актуальной. Известно, что для
синтетических производных гуанидина характерен широкий спектр
биологической активности. Производные гуанидина обладают бактерицидной и
фунгицидной
активностью
[5],
проявляют
антигипертензивные
и
кардиопротекторные свойства, выступают в качестве ингибиторов
адренорецепторов и натриевых каналов, являются супрессорами пероксидного
окисления липидов [6]. В связи с этим целью данной работы явилось
исследование воздействия N-[имино(1-пиперидинил)метил]гуанидина (ИПМГ)
на уровень цитрата, активность аконитазы и цитратсинтазы в ткани головного
мозга крыс при экспериментальной ишемии-реперфузии.
В качестве объекта исследования использовали самцов белых
лабораторных крыс (Rattus rattus L.) массой 150-200 г., содержащихся на
стандартном рационе питания в виварии. Индуцирование ишемии головного
мозга у животных опытной группы осуществляли путем 30-минутной окклюзии
обеих общих сонных артерий, реперфузия достигалась снятием окклюзоров,
восстановление кровотока контролировали визуально. Крысы были разделены
246
на 4 экспериментальные группы: I группа (контроль) – ложнооперированные
животные; II группа – животные с постишемической реперфузией головного
мозга; в III группе животным с ишемией-реперфузией головного мозга вводили
ИПМГ внутрибрюшинно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозе
25 мг/кг, один раз в сутки в течение 3-х дней эксперимента; в IV группе
животным с постишемической реперфузией головного мозга вводили ИПМГ
также внутрибрюшинно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозе
50 мг/кг веса животного. Активность АГ определяли спектрофотометрически
при длине волны 240 нм. Количество цитрата оценивали по методу Нательсона.
Активность ЦС определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента,
катализирующее образование микромоля продукта за 1 мин при 250С. Оценку
содержания белка в пробах проводили по методу Лоури и др. Полученные
данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, различия
сравниваемых показателей считали достоверными при р < 0,05.
Результаты проведенных исследований показали, что у крыс с ишемией реперфузией головного мозга (ИРГМ) наблюдалось уменьшение активности
АГ, выраженной виде Е/г сырой массы, в 2,6 раза относительно контрольного
уровня. Удельная активность АГ также снижалась при ИРГМ в 2,4 раза по
сравнению с 1-ой опытной группой. Снижение активности АГ, вероятно,
связано с тем, что свободные радикалы, содержание которых возрастает при
патологии головного мозга, разрушают железо-серные кластеры молекулы
данного фермента и переводят его в неактивную форму. Наряду с этим, было
выявлено увеличение содержания цитрата в ткани головного мозга в 2,6 раза по
сравнению с контрольными значениями. Полученные результаты согласуются с
данными литературы о том, что при гипоксии происходит нарушение
утилизации цитрата в цитоплазматической фракции мозга крыс [7]. При этом на
фоне развития постишемической реперфузии головного мозга также
наблюдалось снижение удельной активности цитратсинтазы в ткани головного
мозга в 1,5 раза относительно группы ложнооперированных животных.
Показано, что введение ИПМГ в дозах 25 и 50 мг/кг приводило к
увеличению активности АГ, выраженной в виде Е/г сырой массы, в 1,3 и 1,9
раза, а удельной активности – в 1,4 и 1,9 раза, относительно значений при
постишемической реперфузии. Активность ЦС, выраженная в виде Е/г сырой
массы , также возрастала в 1,1 и 1,6 раза под воздействием ИПМГ в дозах 25 и
50 мг/кг соответственно, по сравнению с животными 2-ой опытной группы.
Вместе с этим, выявлено увеличение удельной активности ЦС в 1,1и 1,6 раза
при введении ИПМГ в дозах 25 и 50 мг/кг на фоне развития ИРГМ. При
введении ИПМГ в дозах 25 и 50 мг/кг крысам с ИРГМ наблюдалось снижение
содержания цитрата в мозге в 2,1 и 2,3 раза по отношению к группе животных с
патологией. Изменение исследуемых параметров в сторону контрольных
значений при введении N-[имино(1-пиперидинил)метил]гуанидина животным с
постишемической реперфузией головного мозга, очевидно, свидетельствует о
способности исследуемого вещества участвовать в нормализации клеточного
метаболизма при патологии, связанной с развитием окислительного стресса.
247
Литература
1. Биленко М.В. Влияние ишемии и реперфузии головного мозга
крыс на процессы перекисного окисления липидов и защитный эффект
антиоксидантов / М.В. Биленко, В.И. Тельпухов, Т.Д. Чуракова // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 1988. - Т. 107, №4. - С. 394-396.
2. Верещагин Н.В. Интенсивная терапия острых нарушений мозгового
кровообращения / Н.В. Верещагин, М.А. Пирадов // Медицинская газета. 1999.-9 июня.
3. Gardner P.R. Aconitase is a sensitive and critical target of oxygen
poisoning in cultured mammalian cells and in rat lungs / P.R. Gardner, D.M. Nguyen,
C.W. White // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1994. – V. 91, N 25. – P. 12248 - 12252.
4. Donnes recentes sur metabolisme du fer: un etat de transition / E.Cadet
[et al.] // La revue de medecine interne. – 2005. – V. 26. – P.315-324.
5. Гетероциклические соединения: учеб.пособие / под ред. Р.
Эльдерфилда. – Т.1, 1953. С. 430.
6. Крыльский Д.В. Гетероциклические системы на основе прооизводных
гуанидина и его структурных аналогов / Д.В. Крыльский, Х.С. Шихалиев,
Ю.А. Ковыгин. - Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 2006.- 200с.
7. Rafalowska U. The effect of aspartate on citrate metabolism in the
cytosolic fraction of brain under conditions of normoxia, hypoxia and anesthesia / U.
Rafalowska, M. Erecinska, B. Chance // J. Neurochem. – 1975. – V.25, №4. – P.497501.
248
ИССЛЕДОВНАИЕ МОТИВАЦИЙ ВРАЧЕЙ ПРИ ВЫБОРЕ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Махинова Е.Н., Акиньшина Н.И.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Цель:
Получение
достоверной
информации
о
номенклатуре
лекарственных препаратов, применяемых для лечения различных заболеваний,
оценки их функциональных свойств и конкурентоспособности.
Для изучения качественных характеристик лекарственных средств широко применяется метод коллективных экспертных оценок. Коллективная (или
групповая) экспертная оценка – это оценка, высказанная группой
высококвалифицированных специалистов при соблюдении процедуры еѐ
проведения. Метод коллективных экспертных оценок базируется на комплексе
логических и математико-статистических процедур, позволяющих индивидуальное
мнение каждого эксперта привести к единому групповому. Проанализированная и
обобщенная информация является основой для подготовки и принятия
рациональных решений.
Проведение экспертизы включает в себя следующие основные этапы:
формулировка цели экспертизы и разработка процедуры опроса;
отбор и формирование группы экспертов;
проведение опроса;
анализ и обработка информации, полученной от экспертов;
синтез статистической (объективной) информации и информации,
полученной в результате экспертизы в форму, удобную для принятия решений.
Для получения репрезентативных данных к опросу необходимо привлечь
достаточное количество компетентных экспертов. По мнению ряда авторов при
проведении исследований на фармацевтическом рынке достаточно опросить 9-29
высококвалифицированных специалистов.
Инструментом коллективной экспертной оценки лекарственных средств
является анкета, включающая следующие разделы:
3.
инструкция по запалнению анкеты;
4.
профессиональные данные эксперта (или паспортичка);
5.
сведения о частоте назначения анализируемой группы лекарственных средств;
6.
оценка значимости функциональных и других свойств
лекарственных средств;
7.
оценка источников информации.
На основании паспортички анкеты проводится анализ профессиональных
данных экспертов. Расчитываются коэффициент использования номенклатуры
ЛС, коэффициент приобретенного опыта, который зависит от стажа работы
эксперта по данной специальности и коэффициент квалификационного уровня,
зависящий от наличия квалификационной категории эксперта. Общий
249
коэффициент компетентности расчитывается путем суммирования полученных
коэффициентов, который также зависит и от степени использования
номенклатуры и степени внедрения в практику новых ЛС.
Далее по результатам округления «средневзвешенных» оценок
лекарственных препаратов проводится градуировка исследуемого ассортимента
лекарственных средств. Полученные результаты проведенной зкспертной оценки
лекарственных препаратов для лечения исследуемой нозологии сопоставляются с их
номенклатурой, вошедшей в Перечень жизненно необходимых и важнейших
лекарственных средств, а также в Федеральное руководство по рациональному
применению лекарственных средств.
Также в результате анкетирования врачей выявляются наиболее
предпочитаемые источники информации о лекарственных препаратах.
Как правило, это материалы научно-практических конференций, обзоры
научных статей, содержащих результаты клинических испытаний
лекарственных препаратов. Нередко врачи выражают желание получать
фармацевтическую информацию, подготовленую независимыми специалистами
(фармработниками) в виде аналитических обзоров, подготовленных на
основании обработки и обобщения различных информационных материалов.
Таким образом, результаты исследования мнений врачей позволяют
совершенствовать формулярные перечни лекарственных препаратов, разрабатываемые медицинскими учреждениями. Кроме этого, в результате опроса
врачей выявляются торговые наименования лекарственных средств с учетом
дозировки и фасовки. Это позволяет аптечным организациям оптимизировать
номенклатуру текущих товарных запасов лекарственных средств исследуемой
фармакотерапевтической группы.
Литература
1. Дрѐмова Н.Б., Тестирование рынка – основа формирования
ассортиментной политики по лекарственным средствам / Н.Б. Дрѐмова //
Фармация. - 2008. - Т.48, №6. – с.26-28.
250
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВЕННОГО И
КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ
В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ
Медведев Ю.В., Передеряев О.И., Прокофьева В.И.
e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Гидроксикоричные кислоты (ГКК), или производные кофейной кислоты,
являются наиболее распространенными полифенольными кислотами в высших
растениях. Этот класс соединений представлен сложными эфирами кофейной
кислоты с хинной, шикимовой и винной кислотами, гликозидами, а также
комплексами с целлюлозой, лигнином и белками. ГКК проявляют выраженные
антиоксидантные и антирадикальные свойства в тестах in vitro, описаны
иммуностимулирующая, ротивовирусная и противовоспалительная активность.
Основными ГКК являются: кафтаровая к-та, хлорогеновая к-та и еѐ
изомеры, цикориевая к-та, изомеры дикофеоилхинной к-ты (цинарина),
феруловая к-та, ферулоилхинная к-та и еѐ изомеры.
ГКК являются индикаторными компонентами и действующими
веществами лекарственного растительного сырья, растительных экстрактов и
биологически активных добавок к пище (БАД) на их основе.
В настоящее время в отечественной нормативной документации на
лекарственные растения и продукты на их основе ГКК упоминается весьма
редко (виды эхинацеи и артишока). Для зарубежной нормативной
документации (BP 2009, USP 30, JP 15) характерно больше наименование
лекарственных растений, в которых нормируется содержание ГКК (трава и
корни эхинацеи, листья артишока, листья ясеня обыкновенного, цветки
белокудренника черного, листья крапивы двудомной, листья розмарина
лекарственного, листья мелисы лекарственной, корневища и корни шалфея
лекарственного). Однако, учитывая важную физиологическую роль для самих
растений можно предположить гораздо большее распространение ГКК.
Другой не менее актуальной проблемой является разработка и внедрение
унифицированного метода анализа ГКК, позволяющего определять больший
спектр кислот, чем в действующей нормативной документации.
Учитывая
вышесказанное,
актуальной
является
разработка
унифицированного метода анализа ГКК и исследование с его помощью
различного лекарственного растительного сырья, растительных экстрактов,
БАД к пище и пищевых продуктов.
Цель исследования – разработка методики определения качественного и
количественного состава ГКК в лекарственном растительном сырье и
продуктах его переработки, а также поиск новых источников ГКК.
В процессе разработки методики анализа ГКК был произведен подбор
оптимальных условий УФ-детектирования ГКК; подбор оптимальных условий
масс-детектирования ГКК; подбор оптимальных условий хроматографического
251
разделения ГКК; подбор оптимальных условий экстракции ГКК (состав
экстрагента и время экстракции);
Для определения ГКК в лекарственном растительном сырье и
растительных экстрактах был использован метод высокоэффективной
жидкостной хроматографии. Хроматографическое разделение проводили на
жидкостном хроматографе Agilent 1100 Series (Agilent, США) с
диодноматричным детектором и масс-детектором Agilent MS Trap SL (ионная
ловушка с ионизацией электроспреем), на колонке Supelco Discovery C18 HPLC
column 5мкм (250 x 4,6мм), при температуре термостата колонок 25С. Скорость
потока – 0,9 мл/мин.
Детектирование. Детектирование ГКК (за исключение кумаровой
кислоты) проводили на УФ детекторе при длине волны 330 нм, детектирование
кумаровой кислоты – при 310 нм. Выбор длины волны объясняется тем, что
ГКК хотя и имеют несколько максимумов поглощения в УФ-области, но 330
(310) нм является более специфичной длиной волны и характеризуется
наибольшим поглощением.
С целью дополнительного подтверждения соответствующих ГКК
проводили снятие спектра в области от 200 нм до 400 нм (сравнение спектров
проводили с созданной библиотекой спектров).
Детектирование на масс-детекторе проводили в следующих условиях:
ионизация электроспреем с распылением азотом; небулайзер - 70 psi;
температура осушающего газа - 350°С; скорость осушающего газа - 12
л/минуту; сканирование в диапазоне 100-800 m/z (отрицательные ионы) с
разрушением доминирующих ионов, соответствующим молекулярным массам
исследуемых кислот.
Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляли путем
сравнения со стандартом времени удерживания, УФ спектра, а также
молекулярной массы каждого компонента и его дочерних ионов.
Объекты исследования - лекарственное растительное сырье и
растительные экстракты. В процессе работы нами было исследовано 90
образцов лекарственного растительного сырья экстрактов лекарственного
растительного сырья.
Обсуждение и результаты. При помощи разработанной методики был
изучен состав ГКК в некоторых видах лекарственного растительного сырья,
проанализированы некоторые растительные экстракты (90 объектов).
По итогам исследования все лекарственное растительное сырье было
разделено на 3 группы:
- лекарственное растительное сырье, которое может являться источником
гидроксикоричных кислот и в котором гидроксикоричные кислоты могут
выступать в роли индикаторных компонентов (содержание более 0,50%), всего
24 объектов;
- лекарственное растительное сырье, с незначительным содержанием
гидроксикоричных кислот (содержание менее 0,50%), всего 32 объекта;
- лекарственное растительное сырье, не содержащее гидроксикоричные
кислоты (содержание менее предела обнаружения), всего 34 объекта.
252
Наибольшее содержание ГКК характерно для листьев мать-и-мачехи
(5,3%), травы крапивы двудомной (2,5%), цветков арники горной (2,4%),
плодов калины (2,0%), цветков пижмы обыкновенной (1,9%), травы полыни
обыкновенной (1,8%), цветков бузины черной (1,8%), листьев мяты перечной
(1,7%), листьев ортосифона тычиночного (1,5%), травы одуванчика
лекарственного (1,5%), травы эхинацеи пурпурной (1,4%) и некоторые другие.
По составу ГКК лекарственное растительное сырье можно разделить на
следующие группы:
- лекарственное растительное сырье с преимущественным содержанием
производных кофейной и хинной кислоты (трава тысячелистника
обыкновенного, трава полыни горькой, листья мать-и-мачехи, цветки пижмы
обыкновенной, цветки арники горной, цветки боярышника, цветки бузины
черной, плоды калины, корневища горца змеиного, листья артишока);
- лекарственное растительное сырье с преимущественным содержанием
производных кофейной и винной кислоты (трава эхинацеи пурпурной, трава
одуванчика лекарственного);
- лекарственное растительное сырье с преимущественным содержанием
розмариновой кислоты (трава чабреца, трава душицы обыкновенной, листья
мяты перечной, листья ортосифона тычиночного);
- крапива двудомная (единственное растение, в котором во время
исследования была обнаружены кофеоиляблочная кислота);
Выводы:
1. Разработана
методика
пробоподготовки
для
лекарственного
растительного сырья. Изучено влияние растворителей и условий экстракции на
степень извлечения гидроксикоричных кислот. Подобраны оптимальные
условия детектирования и хроматографического разделения.
2. Для ряда лекарственных растений показано высокое содержание ГКК,
которое может являться источником гидроксикоричных кислот и в котором
гидроксикоричные кислоты могут выступать в роли индикаторных
компонентов.
253
ПРИМЕНЕНИЕ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В АНАЛИЗЕ
ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Мельник Г.И., Грицык А.Р. е-mail: [email protected]
Ивано-Франковский национальный медицинский университет
Несмотря на большие успехи химии природных соединений современная
медицина широко использует растительное сырье в лечебных целях. Из 300
тыс. видов растений, произрастающих на земном шаре, около 700 могут
вызывать тяжелые или смертельные отравления людей. В качестве примера
можно привести виды рода Чемерица, обладаючие токсическими свойствами.
Проблема интоксикации веществами растительного происхождения
требует дальнейшего изучения. Одним из главных вопросов является
выделение индивидуальных соединений растений и исследование их
токсических свойств. Растения содержат физиологически активные вещества
разных классов с различной направленностью действия, что составляет
главную сложность.
Токсическое влияние этих веществ связано и с рядом других факторов,
обусловливающих выраженность и особенности их действия. Вещества,
вызывающие отравления, могут концентрироваться как во всех частях растения
(вератровые алкалоиды в чемерице), так и избирательно в отдельных его
органах (гликозид амигдалин – в косточках абрикоса, миндаля). Накопление
ядовитых веществ связано с периодом вегетации растений, ареалом
произрастания. Так особенности почвенных и климатических условий делают
чемерицу более ядовитой в южных районах, чем в других географических
зонах. Наряду с алкалоидами растения этого вида содержат дубильные и
смолистые вещества, флавоноиды, органические кислоты, жирные масла и
кислоты, другие биологически активные вещества.
Цель нашей работы – получение из растений видов рода Чемерица
фракций биологически активных веществ, хроматографическое исследование
индивидуальных соединений.
Экспериментальная часть
На территории Украины произрастают три вида рода Чемерица: чемерица
Лобеля, чемерица белая и чемерица черная. Нами проведено химическое
исследование сырья (листья и корневище с корнями) чемерицы белой,
заготовленной на территории Ивано-Франковской области.
Нами изучена полнота экстракции алкалоидов в зависимости от
предварительной обработки сырья растворами хлористоводородной кислоты и
аммиака различной концентрации. Оптимальные результаты получены при
настаивании сырья в течение 15 - 20 мин с 25 % раствором аммиака в
соотношении 1 мл раствора аммиака на 1 г сырья. Увеличение времени
настаивания не влияет на полноту извлечения алкалоидов. Полнота экстракции
достигается при настаивании хлороформом в течение 2 ч. Оптимальное
254
соотношение сырья и растворителя 1:10. При увеличении объема растворителя
(1: 50) выход суммы алкалоидов в пересчете на протовератрин не изменяется.
Для хроматографического разделения экстрактов из растительного сырья
использовали пластинки с силикагелем СТХ-1ВЭ (типа «Sorbfil») и различные
системы растворителей. Наилучшее разделение вератровых алкалоидов
достигнуто в подвижных фазах: хлороформ - метанол – 25 % раствор аммиака
(90:8:2); этилацетат - метанол – 25 % раствор аммиака (85:10:5); циклогексан толуол - диэтиламин (75:15:10). На пластинках в УФ свете было обнаружено 11
индивидуальных веществ фиолетовой флюоресценции. При проявлении
пластинки реактивом Драгендорфа модифицированном по Мунье 9 из них,
расположенных в средней и верхней части пластинки, приобрели оранжевое
окрашивание.
Алкалоиды элюировали из пластинки в течение 3 - 5, 15, 30, 45 мин в
разных условиях: при комнатной температуре, нагревании, при механическом
встряхивании. Оптимальные результаты получены при механическом
встряхивании сорбента с веществом в 10 мл хлороформа в течение 3 - 5 мин
при комнатной температуре с последующим центрифугированием для
освобождения от силикагеля.
Сравнительное хроматографическое изучение качественного состава
экстрактов из листьев и корневищ с корнями показало, что алкалоиды имеют
близкий химический состав.
При изучении химического состава листьев и корневищ с корнями ч.
белой нами выявлены флавоноиды, гидроксикоричные и органические кислоты,
дубильные вещества. Эти группы биологически активных веществ исследовали
с помощью реакций идентификации и хроматографии.
Флавоноиды из сырья екстрагировали 70 % этанолом, этанольное
извлечение концентрировали до 1/10 от полученного объема. Разделение на
индивидуальные вещества проводили на бумаге марки «Filtrak FN-1», «Filtrak
FN-8», «Filtrak FN-14» в системах растворителей: 15 % уксусная кислота – I
направление и н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) – II направление .
Методом двухмерной хроматографии на бумаге в листьях ч. белой обнаружено
не менее 8 веществ, в корневище с корнями – не менее 7, которые по
хроматографической подвижности, взаимодействию со специфическими
реактивами, флюоресценции в УФ-свете отнесены к флавоноидам, их
гликозидам, гидроксикоричным кислотам.
Для разделения гидроксикоричных кислот описано большое количество
систем. Исследование проводили методом одномерной бумажной
хроматографии в различных системах по сравнению со стандартными
образцами. Полноты разделения достигнуто в подвижной фазе 2,5% уксусной
кислоты на бумаге марки «Filtrak FN-1». Обнаружение гидроксикоричных
кислот на хроматограммах проводили по флюоресценции в УФ-свете до и поле
обработки хромогенными реактивами. Сравнительное хроматографическое
изучение этанольных экстрактов из листьев и корневищ с корнями чемерицы
белой показало наличие кофейной, феруловой
хлорогеновой и
неохлорогеновой кислот.
255
Хроматографическое изучение качественного состава экстрактов
показало, что экстракты из листьев и корневищ с корнями имеют близкий
химический состав по алкалоидам, гидроксикоричным и органическим
кислотам и значительно различаются по составу флавоноидов.
Выводы
1. Изучен химический состав листьев и корневищ с корнями чемерицы белой.
2. Методом тонкослойной хроматографии в экстрактах листьев и корневищ с
корнями чемерицы белой выделено 20 индивидуальных веществ, которые
тождественны
алкалоидам,
флавоноидам,
гидроксикоричным
и
органическим кислотам.
256
ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ НЕЙРОМЕДИАТОРОВ
КАТЕХОЛАМИНОВ И АЦЕТИЛХОЛИНА В ПРОЦЕССАХ
ОКИСЛЕНИЯ
Менгеле Е.А.1, Круговов Д.А.1, Панченко Л.Ф.2, Касаикина О.Т.1
e-mail: [email protected]
1
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
2
ФГУ ННЦ наркологии
Ненасыщенные липиды являются структурными компонентами
биологических мембран, и с их пероксидным окислением, которое является
показателем окислительного стресса, связывают такие патологии, как
заболевания сердечно-сосудистой, нервной систем, легких, глаз, крови,
старение организма человека, абстинентные состояния. При лечении этих
патологий с положительным эффектом применяются лекарственные средства,
регулирующие обмен веществ, обладающие гепатопротекторным и
антиоксидантным действием. Использование
препаратов, содержащих
полиненасыщенные жирные кислоты и витамины антирадикального и
антиоксидантного действия A, D, E, нормализует антиоксидантный статус
крови, снижает содержание липопероксидов, стимулирует регенерацию печени,
а также предотвращает возникающие в абстинентном периоде нейтропению и
дефицит Т-лимфоцитов [1]. С другой стороны, известно, что алкоголь и
наркотики активируют нейроны мозга и увеличивают уровень дофамина [2,3].
Нарушаются уровни и других катехоламинов норадреналина и адреналина,
поэтому в качестве терапевтических препаратов испытывают соединения,
влияющие на метаболизм катехоламинов [4].
В живых организмах
катехоламины выполняют функцию нейромедиаторов наряду с другими
соединениями, в частности с ацетилхолином. Катехоламины (КА) – группа
биогенных аминов, содержащих в качестве общего структурного фрагмента
3,4-дигидроксифенил (катехол), проявляющего в радикальных реакциях
окисления антиоксидантные свойства. Целью данной работы было
исследование взаимодействия катехоламинов и ацетилхолина с активными
формами кислорода – пероксильными радикалами, пероксидом водорода и
липопероксидами.
В работе использовали катехоламины (КА) дофамин (3-hydroxytyramine
hydrochloride), адреналин (epinephrine), норадреналин
(DL-noradrenaline
hydrochloride) и ацетилхолин хлорид производства фирмы
Fluka.
Ингибирующее действие КА исследовали в процессе окисления лецитина (Lphosphatidylcholine from egg yolk), инициированного ААРН ( ’azodiisobutyramidine dihydrochloride) также производства фирмы
Fluka.
о
Окисление лецитина проводили при РО2 = 1 атм, 37 С.
Катехоламины легко окисляются в водных растворах. Одним из
продуктов окисления адреналина в воде является адренохром (3-гидрокси-1257
метил-2,3-дигидро-1H-индол-5,6-дион), окрашивающий раствор в розовый цвет
( = 4.02 103 (М см)-1 при 480 нм).
Адреналин
Адрен
охром
На рис.1а показано, что изменение оптических спектров поглощения
растворов адреналина в воде и в физиологическом растворе (0,9% NaCl)
практически одинаково, и свидетельствует о постепенном образовании
адренохрома. В фосфатном буфере с рН 7,2 адреналин тоже претерпевает
изменения (рис.1б), но адренохром при этом не образуется.
0,6
0,8
D
D
0,7
0,5
0,6
0,4
0,5
0,3
0,4
0,2
0,3
0,2
0,1
0,1
0,0
250,0
300,0
350,0
400,0
450,0
500,0
550,0
600,0
0,0
250,0
650,0
Рис.1а.
Изменение
УФспектров
0,1
мМ
раствора
адреналина при его окислении в
воде
и
в
физиологическом
растворе (0,9% NaCl) при 37оС.
300,0
350,0
400,0
450,0
500,0
550,0
600,0
650,0
Рис.1б.
Изменение
УФспектров
0,1
мМ
раствора
адреналина при его окислении в
фосфатном буфере (рН 7,2) при
37оС.
Все катехоламины (КА) являются эффективными акцепторами
пероксильных радикалов. Добавка КА в водную дисперсию липомом лецитина
приводит к появлению периода индукции на кинетических кривых поглощения
О2.
Следует отметить, что при окислении в фосфатном буфере при
одинаковых скоростях инициирования радикалов и концентрациях КА периоды
индукции ( ) практически одинаковы для всех КА, тогда как в водном растворе
адреналин обеспечивает более длительное торможение окисления, чем
дофамин и норадреналин, и окрашивает оксидат в розовый цвет. Анализ
соотношения скоростей инициирования радикалов, продолжительности
периодов индукции и скорости накопления адренохрома в водной среде
показал, что для дофамина и норадреналина стехиометрический коэффициент
ингибирования (f), численно равный количеству радикалов, приходящихся на
одну молекулу акцептора, равен 2, что характерно для катехолов, тогда как для
адреналина f = 4. Примечательно, что в условиях свободно-радикального
258
окисления (инициированного ААРН) в водном растворе адреналин
количественно превращается в адренохром. В фосфатном буферном растворе
адренохром не образуется и для всех КА f = 2.
В отличие от КА ацетилхолин практически не влияет на скорость
инициированного окисления лецитина и других масел. Напротив, в [5] было
установлено, что ацетилхолин ускоряет окисление подсолнечного масла.
Исследования механизма ускоряющего действия ацетилхолина на процессы
окисления показали, что подобно катионным поверхностно-активным
веществам, солям тетраалкиламмония ацетилхолин катализирует распад
липопероксидов и пероксида водорода на свободные радикалы и тем самым
ускоряет цепной процесс в целом [6,7].
Литература
[1] С.В. Пирожков, Л.Ф. Панченко и др. Ж. Наркология, №7, 32, 2005.
[2] Анохина И.П. Вестник РАМН. 7, 7, 1995.
[3] Weiss F., Lorang M.T.at al. J.Pharmacol.Exp.Ther. 267, 250, 1993.
[4] Madras B.K, Xie Z, et al J Pharmacol Exp Ther.: 319, 561, 2006.
[5] O. T. Kasaikina, V. D. Kancheva, et al. Oxid.Comm N3, 574, 2006.
[6] N.A. Trunova, Z.S. Kartasheva, et al Col. Jour. 69, 5, 697, 2007.
[7] Н.А. Трунова, О.Т. Касаикина и др. Вестник МГУ, сер. хим. № 4, 260,
2008.
259
КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ТРИТЕРПЕНОВОГО САПОНИНА С АНИОНООБМЕННИКОМ АВ-17-2П
Мироненко Н.В., Брежнева Т.А., Бутырская Е.В., Селеменев В.Ф.
е-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
В последнее время особую популярность приобретают лекарственные
средства и биологически активные добавки широкого спектра терапевтического
действия на организм. Подавляющее число таких средств создаются на основе
тритерпеновых сапонинов – веществ растительного и животного
происхождения, отличающихся разнообразным физиологическим действием.
Значительная доля среди сапонинов приходится на производные олеаноловой
кислоты, содержащие от 2 до 4-х сахарных остатков (рис.1).
H3C
HOOC
H
HOH2C
H O
H
HOH2C
HO
HO
H
H
OH
CH3
COOH
CH3
O
H O
O
HO
H3C
O
CH3
H3C
CH3
OH
H
O H
OH
H
HO
H
H
Рис. 1. Структурная формула сапонина 3-О-[ -D-глюкопиранозил-(12)-( -D-ксилопиранозил-(1-3))- -D-глюкуронопиранозил-3 -окси-олеан-12ен-28-оевой] кислоты.
Поскольку исследуемые соединения выделяют из природных объектов,
получая продукт, представляющий собой сложные по составу смеси
соединений, содержащие
десятки, а иногда и сотни сопутствующих
компонентов, то актуальным является интенсификация процессов очистки
последних. Выделение индивидуальных или высокоочищенных биологически
активных веществ из этих смесей возможно только с использованием
различных современных физико-химических методов, к которым относятся
такие многостадийные процессы как экстракция, осаждение, кристаллизация.
Создание синтетических полимерных сорбентов, позволяющих осуществлять
более тонкую очистку, привело к широкому использованию последних для
выделения, очистки и разделения сложных смесей веществ. Правильное
истолкование механизма сорбции позволит интенсифицировать процесс
очистки и получить образцы с максимальным содержанием основного вещества
– тритерпеновых сапонинов.
Проведенные авторами статьи исследования показали целесообразность
использования макропористых ионогенных сорбентов, в частности полимера
260
АВ-17-2П для очистки фракций выделенных сапонинов от липофильных
соединений. Анализ выходных кривых сорбции в равновесных и кинетических
условиях позволил отметить ионогенное поглощение с участием
карбоксильных групп агликона сапонинов – олеаноловой кислоты или
глюкуроновой кислоты, входящей в состав углеводной составляющей
молекулы. Вероятно, гидратация углеводной части молекулы сапонина
препятствует ионному обмену с участием карбоксильной грцппы
глюкуроновой кислоты, в то время как карбоксильная группа гидрофобной
составляющей – агликона поглощается ионообменно и дополнительно
взамодействует с бензольным кольцом анионита за счет гидрофобных сил,
стабилизируя возникшую структуру (стэккинг-эффект). В настоящее время
квантовохимические расчеты являются одним из физико-химических методов
исследования, позволяющих получить данные, необходимые для установления
механизмов сложных органических реакций. Поэтому подтвердить или
опровергнуть наши предположения возможно, проведя компьютерное
моделирование сапонина с анионобменникомм АВ-17-2П. Квантовохимический
расчет проводили в программе Gaussian 03 рекомендуемым для органических
соединений методом Хартли-Фока в базисе 6-31G** (d,p).
Для моделирования механизма сорбции сапонина анионитом в силу
сложности структуры гликозида необходимо выбрать репрезентативный
фрагмент, т.е. составляющую часть молекулы, атомы которой могут
непосредственно участвовать в ионном обмене. Поскольку носителями
карбоксильных групп, потенциальных участников ионного обмена, являются
олеаноловая кислота – агликон сапонина и глюкуроновая кислота, были
определены 2 фрагмента, являющиеся неполярной и полярной частью
молекулы – агликон и сахара (глюкуроновая кислота, D-глюкоза, D-ксилоза).
Следующим этапом являлось компьютерное моделирование выбранных нами
фрагментов молекулы сапонина с анионообменником. К исследуемым
системам по методу «приближения супермолекулы» добавляли молекулы воды.
Полученные значения расстояний между фрагментами и зарядов
соответствующих
ионов позволили рассчитать величины
энергии
электростатического взаимодействия и энергии водородной связи, значения
которых приведены в табл. 1.
Проведенные расчеты с участием молекул воды показали наличие
гидраторазделенных ионных пар (рис.2,3) и ослабление электростатического
взаимодействия между сорбентом и углеводной частью молекулы сапонина.
Известно, что протекание ионного обмена определяет самая слабая Н-связь. В
структуре «сорбент-углеводная часть сапонина» менее прочной является
водородная связь между молекулами воды, поэтому особый интерес
представляла ее количественная оценка с использованием следующего
эмпирического соотношения:
ЕН=261,7 ∙∆υ/υон0 (2), где ЕН (кДж/моль) – энергия водородной связи; ∆υ
(см-1) – сдвиг частоты валентного колебания свободной ОН-группы при
образовании водородной связи, υон0- валентное колебание свободной ОН261
группы. Значение водородной связи составило 16,5 кДж/моль для молекул воды
в структуре «сорбент-углеводная часть сапонина».
Таблица 1
Величины энергии электростатического взаимодействия и энергии
водородной связи при взаимодействии фрагментов сапонина
с анионообменником, кДж/моль
n
H2O
0
3
5
Еэлектр., кДж/моль
Структура
Структура
«сорбент«сорбент –
олеаноловая
углеводная
кислота»
часть»
3,6
3,0
3,2
2,8
3,2
ЕН, кДж/моль
Структура
Структура
«сорбент «сорбент –
олеаноловая
углеводная
кислота»
часть»
28,7
16,5
2,4
Рис.3 Оптимизированная структура
«анионит - агликон сапонина (на рисунке
представлен его фрагмент) - 5 молекул
воды». Пунктирной линией отмечена
водородная связь (нм).
Рис.2 Оптимизированная структура
«анионит - углеводная часть молекулы
сапонина (на рисунке представлен ее
фрагмент)-5 молекул воды». Пунктирной
линией отмечена водородная связь (нм).
В структуре «сорбент-агликон» менее прочной из Н-связей является
водородная связь между молекулой воды и атомом кислорода карбоксильной
группы». Расчет ее величины вели по уравнению, рекомендуемому для Н-связи
с участием карбонильных соединений:
ЕН=1,38(∆υ-40)1/2 (3), где ЕН (кДж/моль) – энергия водородной связи; ∆υ
(см-1) – сдвиг частоты валентного ОН-колебания свободной ОН-группы при
образовании водородной связи. Значение водородной связи составило 28,7
кДж/моль. Полученные величины подтверждают, что водородная связь
является наиболее прочной по сравнению с электростатическим
взаимодействием и именно она определяет протекание ионного обмена (табл.1).
262
Таким образом, понижение энергии системы при поглощении полярной
части молекулы сапонина анионообменником, являющееся суммой энергии
электростатического взаимодействия и энергии Н-связи, составляет 18,9
кДж/моль, при поглощении олеаноловой кислоты – 31,9 кДж/моль, т.е.
сорбционная способность агликона выше, чем глюкуроновой кислоты.
Полученные результаты полностью соответствуют экспериментальным
данным, полученным при исследовании поглощения сорбентом сапонина и его
агликона – олеаноловой кислоты.
263
КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ, ИК И
ЯМР СПЕКТРОВ ИОНООБМЕННИКОВ
Нечаева Л.С., Бутырская Е.В., Шапошник В.А., Селеменев В.Ф.
е-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
Ионообменники широко применяются в качестве сорбентов на стадии
пробоподготовки при анализе лекарственных веществ. Закономерности их
сорбции и характеристики хроматографического разделения могут быть
проинтерпретированы на основе анализа взаимодействий сорбент-сорбат на
атомно-молекулярном уровне. Существенным для понимания природы ионного
обмена является вопрос о диссоциации ионогенной группы, что неоднократно
обсуждалось многими авторами, и в литературе отсутствует единая точка
зрения по этому вопросу. Отсутствие диссоциации приводит к образованию
контактной ионной пары, сильному электростатическому взаимодействию,
препятствующему как протеканию ионного обмена, так и транспорту
противоионов в ионообменных мембранах при наложении на них градиента
электрического потенциала. При наличии диссоциации молекулы воды,
разделяющие фиксированный и подвижный ионы, ослабляют кулоновское
взаимодействие между ними как в результате увеличения расстояния, так и за
счет увеличения диэлектрической проницаемости. В работе выполнено
компьютерное моделирование структуры ионной пары в репрезентативных
фрагментах
сульфокатионообменника
в
Li-,
Naи
К-формах,
перфторированной сульфокатионитовой мембраны в Li- и Na- формах и
карбоксильного катионообменника в Na-форме. Для данных систем c
использованием
программы
Gaussian03
методом
B3LYP/6-31++(d,p)
рассчитаны ИК и ЯМР спектры для различного предполагаемого окружения
фиксированного иона (контактная и гидраторазделенная ионные пары). Анализ
рассчитанных ИК спектров оптимизированных структур исследованных
катионообменников показал, что наблюдается хорошее согласование
рассчитанных частот валентных колебаний с экспериментальными значениями
для структур с гидраторазделенной ионной парой. Для структур с контактной
ионной парой расхождение теории и эксперимента превышает погрешность
определения колебательных частот. Расчет ЯМР спектров всех исследованных
систем показал, что химический сдвиг ядер противоионов для систем с
контактной ионной парой относительно эталона (разбавленного раствора соли
противоиона)
существенно
превышает
таковой
для
систем
с
гидраторазделенной ионной парой. Поэтому величина данного химического
сдвига также может служить аналитическим сигналом при выявлении
структуры ионной пары в ионообменниках. Таким образом, анализ ИК и ЯМР
спектров ионообменных систем показал, что в исследованных набухших
ионообменниках, экспериментальные значения частот валентных колебаний
функциональных групп катионообменников и химических сдвигов ядер
264
противоионов хорошо согласуются с рассчитанными для структур с
гидраторазделенной ионной парой. Отсюда сделан вывод о диссоциации
ионной пары в данных системах.
Рассчитанная структура составного
повторяющегося звена катионообменника
КБ-4 в Na-форме с 10 молекулами воды
представлена на рисунке. На основе
анализа
оптимизированных
структур
показано,
что
энергия
активации
транспортных
процессов
в
ионообменниках равна сумме энергии
разрыва
водородной
связи
между
гидратными оболочками противоионов и
ионной связи между противоионами.
Понимание
механизма
транспорта
позволяет
оптимизировать
процессы
разделения
в
хроматографическом
анализе.
265
ПРИМЕНЕНИЕ ТОНКИХ ПЛЕНОК ФУЛЛЕРЕНА С60
В МЕДИЦИНЕ И ФАРМАЦИИ
Никитская Л.М.1, Калач А.В.2, Селеменев В.Ф.1, Никитский А.С.3,
Ковалева Н.В.1 e-mail: [email protected]
1
Воронежский государственный университет
Воронежский институт ГПС МЧС Российской Федерации
3
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко
2
Нанотехнологии являются одним из интенсивно развивающихся
направлений в современной науке. Исследования в медицине и фармации
ведутся на стыке различных направлений науки: создание новых молекул,
микроэлектромеханических и микрооптикоэлектромеханических систем,
нанотехнологии твердых веществ, микроэлектроника. Эти исследования
сосредоточены на получении препаратов нового поколения, разработке
способов доставки лекарственных средств, получении искусственных тканей
организма, совершенствовании методов диагностики заболеваний и
лабораторного тестирования препаратов.
Молекулы веществ могут применяться непосредственно в качестве
активных веществ. В частности, интересным классом молекул с этой точки
зрения являются фуллерены.
Известно, что фуллерены обладают хорошей адсорбционной
способностью, поэтому на их основе можно создавать различные сорбенты.
Кроме того, установлена противовирусная активность фуллеренов, их
способность поглощать свободные радикалы. На основе фуллеренов
разрабатываются препараты – средства доставки лекарственных средств для
лечения ВИЧ-инфицированных пациентов и онкологических больных.
В настоящее время, метод получения фуллеренов основан на
термическом разложении графита. Одним из основных методов исследования
фуллеренов является спектральный анализ.
Для диагностики острых и хронических интоксикаций тяжелыми
металлами применимы пьезокварцевые сенсоры, модифицированные тонкими
пленками фуллеренов. Известно, что чувствительность пьезосенсоров зависит
от способа нанесения пленки сорбента-модификатора. Для исследования
влияния способа нанесения сорбента на операционные характеристики
пьезосенсоров изучены ИК-спектры пленок фуллерена С60.
Спектры поглощения исследуемых образцов фуллерена С60 измеряли при
температуре 20±2°С на Фурье-спектрометре VERTEX-70. В качестве подложки
использовали кремниевые пластины. Нанесение сорбентов проводили
хроматографическим микрошприцем методом «высыхающей капли».
На рис. 1 представлен ИК-спектр поглощения фуллерена С60.
В ИК-спектре фуллерена С60 наблюдаются 4 линии поглощения с
максимумами при 1429, 1183, 577 и 528 см-1 соответственно. Это доказывает,
266
что фуллерен С60 имеет спектр поглощения высокой симметрии с элементами
комбинационного рассеяния.
Экспериментальные
спектроскопические
данные
подтверждают
теоретические расчеты спектров и хорошо согласуются с известными
литературными данными, доказывающими, что структура С60 представляет
собой усеченный икосаэдр.
Рис. 1. Инфракрасный спектр поглощения фуллерена С60
Таким образом, полученные результаты позволяют рекомендовать метод
высыхающей капли для получения тонких пленок фуллерена заданного
качества на поверхности пьезорезонаторов.
267
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СМЕСИ ПАНТОГАМА
И КИСЛОТЫ ЯНТАРНОЙ ПРИ СОВМЕСТНОМ ПРИМЕНЕНИИ
Николаевский В.А.1, Рецкий М.И.2, Сливкин А.И.1, Сливкин Д.А.3,
Бузлама А.В.1, Филонова Е.В.1 e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт
патологии, фармакологии и терапии
3
Российский университет дружбы народов
Пантогам
–
отечественный
препарат,
применяющийся
в
психоневрологической практике, в частности, в педиатрии. Кальция
гомопантотенат, обладая нейрометаболическим действием
на обменные
процессы в мозге, улучшает его кровоснабжение и повышает устойчивость к
гипоксии, а так же стимулирует анаболические процессы в нейронах [1].
Янтарная кислота обладает антигипоксическим действием вследствие
интенсификации утилизации кислорода тканями и восстановления NADзависимого клеточного дыхания. Другими словами, данный препарат
обеспечивает в условиях гипоксии энергосинтезирующую функцию
митохондрий [2].
Актуальной является задача поиска эффективных средств для лечения
нарушения мозгового кровообращения, особенно при черепно-мозговых
травмах.
Вследствие
этого
представляется
перспективным
исследовать
композицию пантогам – кислота янтарная, которые могут потенцировать друг
друга по основным направлениям фармакологических свойств. Такого
сочетания веществ в лечебной и фармацевтической практике не наблюдалось.
Проведены
экспериментальные
скрининговые
исследования
противогипоксической активности смеси пантогама и кислоты янтарной, смеси
пантогама, кислоты янтарной и хитозана с вязкостью 100-200 кД для
обоснования целесообразности создания комбинированной лекарственной
формы ноотропного действия.
Противогипоксическая активность изучалась в опытах на белых
беспородных мышах массой 18-24г в условиях моделирования гипоксической,
гипобарической, гемической гипоксии [3,4]. Исследуемые вещества и их смесь
вводились перорально в дозах по 40 мг/кг в пересчѐте на действующее
вещество за 30 минут до создания гипоксии. Антигипоксический эффект
определяется по продолжительности жизни мышей в эксперименте в сравнении
с контролем (табл.1).
Острую гипоксическую гипоксию вызывали методом размещения
лабораторных животных в банки равного объѐма и формы с плотно
закрывающимися крышками. Отсчет времени проводили с момента
герметизации банок. [3,4] Острую гипобарическую гипоксию воспроизводили
поднятием белых мышей на высоту 11000м (198,7 – 185 мм рт ст) в условиях
268
герметичной барокамеры со скоростью подъѐма 40-50 м/с. Предварительно у
мышей определялся исходный уровень – устойчивость к гипоксии. Эффект
оценивался по времени пребыва-ния животных на заданной высоте до
наступления судорог: при появлении второго агонального вдоха производился
отсчет времени выживания и давление (под колоколом) в барокамере
постепенно нормализовали. Острая гемическая гипоксия вызывалась введением
внутрибрюшинно
нитрита
натрия
в
дозе
200
мг/кг
как
метгемоглабинобразователя. Отсчет времени жизни мышей начинался сразу
после введения нитрита натрия до гибели животного. С целью исключения
случайностей экспериментальные мыши содержались в стандартных условиях
и брались на опыт в одно и то же время [3].
Таблица 1.
Противогипоксическая активность исследуемых объектов на мышах
Исследуемые
объекты
Контрольная
группа мышей
Пантогам
p>0,05 по отношению к контролю
p>0,05 по отношению к контролю
p>0,05 по отношению к контролю
p>0,05 по отношению к контролю
Вид активности во времени
Гипоксичес- Гипобаричес- Гемическая,
кая, t, мин
кая, t, сек
t, мин
28±0,99
22,0±0,30
14,8±0,50
36,2±0,70
29,4±0,70
15,5±0,50
*Янтарная
35,1±0,90
34,0±0,40
16,6±0,50
кислота
*Смесь пан49,4±1,0
40,1±0,70
20,0±0,50
тогама и к-ты
янтарной
*Смесь панp>0,05 по отноше50,6±1,1
43,2±0,80
21,8±0,50
тогама,к-ты
нию к контролю
янтарной и
хитозана
* Изменения показателей статистически значимы (р>0,05) относительно
контрольной группы
Статистическая обработка полученных в эксперименте материалов
проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI на персональном
компьютере с использованием программ для статистической обработки
(Statgraphics plus 5.1).
В результате исследования при моделировании гипоксической гипоксии
выявлено увеличение продолжительности жизни животных более чем на 64%
после введения смеси пантогама с кислотой янтарной и более чем на 66% после
введения смеси пантогама с кислотой янтарной и хитозаном относительно
контрольной группы. Это превышает данный показатель для пантогама (24%) и
янтарной кислоты (31%). В условиях гипобарической активности отмечено
увеличение продолжительности жизни мышей при введении пантогама на 34%,
269
янтарной кислоты – на 58%, смеси пантогама с янтарной кислотой – на 82%,
смеси пантогама с янтарной кислотой и хитозаном – на 84% в сравнении с
контролем. В условиях гемической гипоксии зафиксировано увеличение
времени выживания при введении пантогама – на 9,2%, янтарной кислоты – на
11,0%, смеси пантогама с кислотой янтарной – на 28%, смеси пантогама с
кислотой янтарной и хитозаном – на 33%.
Заключение
При пероральном введении пантогама, кислоты янтарной, хитозана и их
смесей установлено, что лучшую противогипоксическую активность проявляют
смеси указанных соединений.
Литература
1. Маслова О.И., Шелковский В.И. Пантогам и детская психоневрология /
О.И. Маслова, В.П. Шелковский // Пантогам. Двадцатилетний опыт применения в психоневрологии: сб. науч. тр. / М., 1998. – С.50.
2. Ливанов Г.А. Пути фармакологической коррекции последствий гипоксии
при критических состояниях у больных с острыми отравлениями / Г.А. Ливанов, В.В. Мороз, Б.В. Батоцеренов // Анестезиология и реаниматология. – 2003.
- №2. – С. 51-54.
3. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Р.У Хабриев. – Москва, 2000.–155с.
4. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ / В.В.Гацура. – Москва: Медицина, 1974. – 108 с.
270
РАСТИТЕЛЬНЫЕ И АНТАЦИДНЫЕ СРЕДСТВА
В ГЕНЕЗЕ КИСЛОТОЗАВИСИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Новикова Г.Е. е-mail: [email protected]
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
Согласно данным научного прогнозирования, заболеваемость болезнями
пищеварительной системы в ближайшие 15-20 лет возрастет в мире, по крайней
мере, на 30-50%. При этом эти заболевания значительно «помолодели» и
встречаются не только в молодом, но и в раннем детском возрасте, что на наш
взгляд связано с появлением недоброкачественных продуктов питания, которые
в составе содержат как искусственно полученные компоненты, например
различного рода ароматизаторы, стабилизаторы, красители, а также продукты,
содержащие
генно-модифицированные
вещества
и
антибиотики.
Немаловажную роль играет увеличение числа различных киосков, кафе и
других учреждений так называемого быстрого питания. Данные тенденции
характерны и для такой патологии желудка как гипер- и гипокислотность. Так,
согласно исследованиям, только жители США потратили в прошлом году 13,6
миллиардов долларов на специальные препараты для подавления кислотности.
По данным литературы однако известно, что многие аспекты этой проблемы до
сих пор остаются не раскрытыми [1].
Нарушение кислотообразования может явиться причиной различных
заболеваний желудочно-кишечного тракта. Повышение кислотопродукции
сопровождается развитием так называемых кислотозависимых заболеваний:
язвенной болезни, рефлюкс-эзофагита, панкреатита и т.д. Снижение
кислотопродукции находится в определенной связи с развитием
новообразований желудка, нарушением микрофлоры желудочно-кишечного
тракта и, как следствие, нарушением кишечного пищеварения. В тоже время,
ритмичное выделение определенного количества соляной кислоты железами
желудка является необходимым условием нормального протекания процессов
пищеварения. Из всего выше изложенного логично предположить, что
гиперацидность, так же как и гипоацидность, требует соответствующей
коррекции, и более пристального изучения, что является актуальной проблемой
современной медицины.
Первыми фармакологическими средствами, которые начали использовать
в лечении кислотозависимых заболеваний еще несколько столетий назад
являются так называемые антацидные препараты. В нашей стране
зарегистрировано более 30 торговых наименований, среди них такие как:
гастал, гевискон, ренни, маалокс, омез и др. В настоящее время существует две
основные группы антацидов: всасывающиеся и невсасывающиеся. К
сравнительно новым лекарственным препаратам относятся блокаторы Н2 –
гистаминовых рецепторов и ингибиторы H+-K+-ATФазы (протонного насоса).
Классической точкой приложения медицинского эффекта антацидов,
известной с глубокой древности, является химическая нейтрализация соляной
271
кислоты в просвете желудка. На принципе уменьшения агрессивных свойств
соляной кислоты желудочного сока и пепсина построены все стратегии лечения
кислотозависимых заболеваний и в настоящее время. Однако зачастую
упускается из виду то, что при желаемом быстром, но непродолжительном
эффекте постоянное применение антацидных препаратов является не столь уж
безобидным [2].
При этом во всем мире сложилась парадоксальная ситуация, когда
антацидные препараты и селективные ингибиторы солянокислой секреции с
успехом применяются в лечении кислотозависимых заболеваний без ясного
понимания механизма и характера этой кислотозависимости. Тогда как
изучению влияния компонентов растительного происхождения, которые в
своем составе имеют комплекс веществ, которые лучше усваиваются
организмом, в борьбе с этой проблемой уделяется на наш взгляд недостаточно
исследований. Отсюда вывод: антацидные препараты «лечат» последствия, а не
причину повышенной кислотности. Тогда как причины остаются неизвестны.
На основании всего вышеизложенного возникает проблема поиска
лекарственных средств растительного происхождения, которые могли бы
оказывать подавляющее или стимулирующее действие на продукцию соляной
кислоты в желудке. Например, известно [1], что растворы меда обладают
высоким ощелачивающим (теплый раствор) и стимулирующим (холодный
раствор) действием. Эти свойства проявляются индивидуально, но
обнаруживаются почти в 75% случаев.
Так как общая кислотность желудочного сока складывается из свободной
и связанной кислотности, то на наш взгляд для понимания механизма
кислотопродукции, а, следовательно, и кислотонейтрализации основным
является выяснение действия антацидных и растительных средств на
определенный тип кислотности, что явилось основной задачей нашего
исследования.
Целью работы было провести сравнительное изучение влияния
известных антацидных препаратов с растительными компонентами на тип
кислотопродукции и кислотонейтрализации.
Материалы и методы
В работе использовались известные антацидные препараты, (в форме
таблеток) такие как, омез, гевискон, ренни и маалокс. Из компонентов
растительного происхождения были использованы мед и отвар кора ивы (по
действию ее на кислотонейтрализацию в литературе нет никаких данных). В
качестве искусственного заменителя желудочного сока был использован
аптечный таблетированный препарат ацидин-пепсин, содержащий 1 часть
пепсина и 4 части бетаина гидрохлорида. Определение типа кислотности
проводили по методу Тепфера. Из-за невозможности применения данного
метода в случае антацидных препаратов (из-за их окраски) все исследования
повторяли с использованием метода потенциометрического титрования на
приборе «Иономер универсальный – ЭВ74». Для построения графиков и
обработки полученных результатов использовали программу Microsoft Exсel.
272
Полученные результаты
В экспериментах in vivo было установлено, что отвар коры ивы проявляет
хороший
антацидный
эффект,
который
характеризуется
быстрым
нейтрализующим действием (от 1 до 3 минут) и продолжительностью более 56 часов. По нашему мнению, для выяснения механизма кислотопродукции было
важно установить, на какой тип кислотности действуют компоненты данного
отвара. Оказалось, что отвар не оказывает влияния на общую кислотность
искусственного желудочного сока, что прямо указывает на не химический
механизм кислотонейтрализации соляной кислоты по сравнению с
антацидными средствами, при этом незначительно влияет на связанную
кислотность. Причем теплый отвар обладал более мягким действием по
сравнению с холодным. Аналогичный результат был получен при
использовании меда. Все исследуемые антацидные средства, за исключением
препарата «омез» оказывали влияние на общую кислотность чисто химически
нейтрализуя соляную кислоту. Действие же препарата «омез» было
аналогичным с отваром коры ивы и раствором меда.
Выводы
На основании полученных результатов можно предположить, что процесс
кислотонейтрализации в организме человека это не прямой химический
процесс нейтрализации свободной соляной кислоты желудочного сока, а
является более комплексным механизмом вовлекающим в себя
функционирование поджелудочной железы, печени, микроэлементный и
гормональный состав крови и желудочного сока. При разбалансировании
механизмов поступления тех или иных необходимых для пищеварения
ферментов, гормонов и микроэлементов, а также инфицированиях желудочнокишечного тракта, например бактериями Helicobaсter pylori, наблюдается
усиленное выделение соляной кислоты как корректирующего фактора.
Определение химического состава растительных веществ, которые оказывают
кислотонейтрализующий эффект или участвующие в процессах активации
пищеварительных ферментов, а также проведение аналогичного исследования с
натуральным желудочным соком является перспективным для последующих
исследований. Решение этих задач, укажит на наш взгляд, на причины
повышенного кислотообразования, а также определит пути к решению
проблемы кислотозависимых заболеваний в целом.
Литература
1. Лазебник Л.Б., Касьяненко В.И. Мед и кислотообразующая функция
желудка // www.beekeeping.orc.ru/Arhiv/a2003/n703 53.htm.
2. Фадеенко Г.Д. Роль и место антацидов в лечении кислотозависимых
заболеваний // Гастроэнтерология, гепатология, колопроктология.- 2007.
№20/1.- С. 30-32.
273
CИНТЕЗ НОВЫХ ПОТЕНЦИАЛЬНО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВЫХ
ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ 2-ФЕНИЛ-1,1-ДИЦИАНОЭТЕНА
Носачев С.Б., Пак И.Г., Тырков А.Г. e-mail: [email protected]
Астраханский государственный университет
Замещенные фенилэтена широко используются в органическом синтезе.
Наличие в их молекуле нескольких реакционных центров позволяет вовлекать
эти соединения в многочисленные превращения, приводящие к широкому
ассортименту продуктов алифатического и гетероциклического рядов. Многие
реакции, при этом, протекают нетривиально, что связано со специфическими
особенностями взаимного влияния функциональных групп и способностью
реакционных интермедиатов вступать во вторичные внутримолекулярные
процессы.
Ранее нами была исследована реакция 2-фенил-1,1-дицианоэтена 1 с
диазометаном и диазоэтаном, которая завершилась образованием пиразолинов
[1], а также реакция трехкомпонентной гетероциклизации фенилэтена 1 с
альдегидами
и
иминокислотами
которая
привела
к
получению
соответствующих пиролов [2].
Продолжая развивать исследования в этом направлении, нами был
расширен ряд 1,3-диполей вводимых в реакцию с соединением 1.
Нами установлено, что наличие подвижного атома водорода в иминной
группе пиразолинового цикла в соединении 2 открывает перспективы
дальнейшей функционализации этих соединений, например, по реакции их
калиевых солей 3 с бромистым аллилом, которая завершилась получением
производных 2-аллил-2,4-дигидро-3Н-пиразол-3,3-дикарбонитрила 4.
Ar
RCHN2
Ar
CN
CN
Et2O
NC
CN
1
R
N
N
CN
Ar
Br
EtOH
CN
EtOK
H
R
2
N
N K
+
3
Ar
CN
CN
N
R
4
274
N
R=H, Me
ацетон
Пиразолины 4 в положении 2 гетероцикла содержат диполярофильную
аллильную функцию, которая оказалась способна к циклоприсоединению к
алифатическим диазосоединениям, в частности, к диазометану или диазоэтану.
Установлено, что реакция протекает при 25ºС регионаправленно и с хорошим
выходом приводит к 2-(4,5-дигидро-1Н-пиразол-4-илметил)-4-фенил-2,4дигидро-3Н-пиразол-3,3-дикарбонитрилам 5.
Ar
4
CN
RCHN2
CN
Et2O
R
N
N
N
H
N
R
5
В мягких условиях протекает и взаимодействие замещенных пиразолинов
4 с N-окисями ароматических нитрилов. Реакция протекает как 1,3-диполярное
циклоприсоединение
и
завершается
образованием соответствующих
изоксазолинов 6.
Ar
4
CN
ArCNO
CN
Et2O
R
N
Ar
N
O N
6
Структура полученных соединений 2, 4-6 установлена методами ИК, 1Н,
13
С ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, а состав данными элементного
анализа.
С целью выявления спектра потенциальной биологической активности
новых веществ, полученных на основе 2,4-дигидро-3Н-пиразол-3,3дикарбонитрил-4-фенила, нами был проведен компьютерный интернет-прогноз
с использованием программного комплекса PASS, результаты которого
представлены в таблице.
275
Таблица.
Результаты прогноза потенциальной биологической активности
новых соединений 4-6 с использованием программного комплекса PASS
Формула
Ar
Вид активности
CN
CN
N
R
N
CN
Ar
CN
R
N
N
N
H
N
R
Ar
CN
CN
R
N
Ar
N
O N
Степень
вероятности, Ра
HDL-cholesterol increasing
72,1
Antacid
66,6
Antibacterial
63,2
Antiviral (influenza)
54,4
Cardiodepressant
54,1
Cardiovascular analeptic
52,4
Convulsant
52,2
Glutamate
(mGluR5)
50,8
antagonist
Cardiovascular analeptic
89,6
Antacid
74,2
Antibacterial
72,4
Convulsant
66,4
HDL-cholesterol increasing
63,1
Glutamate
(mGluR5)
55,9
antagonist
53,4
Cardiodepressant
50,3
Antiviral (influenza)
Nitric oxide agonist
65,7
Antimicobacterial
62,5
Spermicide
57,7
Antineurogenic pain
56,8
Guanylate cyclase stimulant
53,7
Uricosuric
53,4
Interleukin antagonist
53,2
Hypotermic
52,5
Antihypercholesterolemic
52,0
В заключении необходимо отметить, что нами разработан простой метод
получения новых азагетероциклических соединений на основе 2-фенил-1,1дицианоэтена, основанный на доступном сырье. Синтезированные соединения
интересны как с точки зрения изучения их дальнейших превращений, так и в
плане исследования их биологической активности.
Литература
[1] С.Б. Носачев, Н.А. Щурова, Е.А. Тыркова, А.Г. Тырков. Журн. орг.
химии. 2009. 45 (3), 473.
[2] С.Б. Носачев, Е.А. Тыркова, А.Г. Тырков. Журн. орг. химии. 2009. 45 (4),
637.
276
ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ФИТОПРЕПАРАТОВ
Огай М.А., Степанова Э.Ф., Провоторова С.И., Дзюба В.Ф.
e-mail: [email protected]
Воронежский государственный университет
ВВЕДЕНИЕ
Биотестирование – оценка реакции тест-организмов на ту или иную
субстанцию. В качестве тест-организмов для оценки токсичности использовали
парамеции. Профессор А.Н. Кудрин провел исследования по сравнительной
оценке токсичности спиртовых растворов, лекарственных чаѐв [1]. В
фармакологии парамеции как биологическую модель используют для
скрининга
лекарственных
средств
антиоксидантного
и
мембранстабилизирующего типов действия.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Эксперимент по определению биологической активности и токсичности
веществ был проведен на парамециях - культуре Parametium caudatum,
выделенных из естественных мест обитания, из которой для дальнейшего
исследования были получены отдельные клоны (от одной особи бесполым
путем). Массовые культуры парамеций постоянно находились в среде Л.К.
Лозина-Лозинского [1].
Пищей для парамеций служили живые дрожжи Rhadotorula gracilis с добавлением пшеничной муки.
Оборудование: бинокулярный микроскоп Биолам, предметные стекла,
пипетки автоматические градуированные с наконечником, рН-метр.
Подготовка биологического материала к проведению эксперимента
(определение чувствительности парамеций) проводилась следующим образом:
на предметное стекло наносили две капли среды, содержащей парамеции
(число особей в каждой капле не менее 5), одна капля служила контролем, ко
второй тангенциально (сбоку) прибавляли каплю соответствующего объема
0,9% раствора хлорида натрия. При добавлении раствора натрия хлорида
наблюдалось заметное ускорение движения по сравнению с контролем. Этот
опыт повторяли 5 раз. При этом парамеции считаются чувствительными в
случае ускорения движения не более 4 особей из 5 по результатам 5 измерений.
Для оценки чувствительности парамеций по параметру - замедление движений
- использовали 0,5% раствор калия хлорида и проводили опыты по аналогичной
методике. При этом парамеции считаются чувствительными в случае
замедления движения не менее 4 особей из 5 по сравнению с контролем.
Культура парамеций считается чувствительной по положительным результатам
проб с 0,9% раствором натрия хлорида и 0,5% раствором калия хлорида.
Проведение испытаний на биологическую активность и токсичность. На
предметное стекло наносили три капли среды, содержащей парамеции (должно
быть не менее 5 особей в капле). Одна капля служит контролем, ко второй
277
капле прибавляли каплю раствора исследуемого вещества в наибольшем
разведении (например, 1х10-6 г/мл), к третьей с меньшим разбавлением
(например, 1х10-5 г/мл). Наблюдали 5-7 мин за изменением движения
парамеций, отмечали характерные изменения в их движении: ускорение,
замедление, круговые хаотичные движения. С целью выяснения развития
эффекта во время наблюдения можно увеличить до 30 мин время от момента
добавления исследуемой концентрации вещества. Затем на новом предметном
стекле устанавливали концентрацию вещества, которая вызывает изменение
формы парамеций или лизис. С каждой концентрацией опыты повторяют не
менее 5 раз.
Информативными являются следующие показатели: наименьшая
концентрация, вызывающая ускорение или замедление движения – пороговая
концентрация; концентрация, вызывающая необратимую остановку –
остановочная концентрация, и приводящая к лизису – лизирующая. О степени
биологической активности судили по величине пороговой концентрации: чем
меньше эта величина, тем выше активность.
Изучение протективной активности по отношению к клеточным ядам
проводили со спиртом этиловым и водорода пероксидом, которые создают
патологическую модель повреждения мембраны клетки. Этиловый спирт
повреждает белковую часть биомембраны, пероксид водорода инициирует
ПОЛ мембраны [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В процессе наблюдения за культурой клеток фиксировали число особей в
одной капле и средний (преобладающий) размер клеток. Для подсчѐта числа
инфузорий использовали гемоцитометрический способ (камера Горяева).
Различие в концентрации живых парамеций в опытной и контрольной пробах, а
также в их размере являлось критерием токсичности или экологически
благоприятной среды для одноклеточного организма.
Таблица 1.
Результаты определения влияния разработанных фитогелей 1 и 2 на
аппарат размножения и темпа роста парамеций (хронический опыт)
Объект
Исследования
Исходное
Количество
количество
парамеций
парамеций в спустя
0,05 мл
3 суток
Контроль
5-10
30-40
5-10
> 200
5-10
> 100
Фитогель 1
Фитогель 2
278
Размер
Характер
парамеций и
движения
форма (мкм)
90-100
Удлинѐнные
50-80
Овальные
90-100
Удлинѐнные
Активны
Очень
Активны
Активны
Размер парамеций под воздействием фитогеля 1 (50-80 мкм) меньше, чем
в контрольной группе. Однако по шкале активности эта группа относится к
очень активным и к 3 суткам количество парамеций превосходит контроль в 5-6
раз. Анализ данных, приведѐнных в таблице 1 показал, что оба фитогеля в
экологическом отношении благоприятны для парамеций.
Следующим этапом наших исследований было изучение протективной
активности изучаемых фитогелей по отношению к клеточным ядам: спирту
этиловому и водорода пероксиду.
Таблица 2.
Изучение степени защиты парамеций от действия токсикантов по
времени остановки (n=5)
Наименование объекта
Время
остановки
Время остановки
парамеций в 1%
парамеций в 14%
растворе пероксида
этаноле, мин
водорода, мин
Контроль
0,2 ± 0,01
0,09 ± 0,01
8,5 ± 0,2
3,2 ± 0,2
10,0 ± 0,2
5,1 ± 0,2
Фитогель1
Фитогель 2
Разработанные фитогели существенно удлиняли время остановки
парамеций под воздействием клеточных ядов – спирта этилового и пероксида
водорода. Удлинение времени остановки движения парамеций под
воздействием спирта этилового, характеризует мембраностабилизирующую
активность разработанных фитогелей 1 и 2, компоненты, которых
препятствуют повреждению белковой части биомембраны. Антиоксидантная
активность проверена по удлинению времени движения парамеций под
воздействием 1% раствора перекиси водорода. По-видимому это связано со
способностью компонентов разработанных фитогелей тормозить ПОЛ
мембраны.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Учитывая все выше описанное и основываясь на проведенном
эксперименте нами разработаны составы фитогелей.
Фитогель 1 включает спиртоводное извлечение из зверобоя
продырявленного, прополис и облепиховое масло, и вспомогательные
вещества; фитогель 2 – спиртоводные извлечения из лавра благородного,
эхинацеи пурпурной, солодки голой, донника лекарственного, сок алоэ,
279
индивидуальный препарат таурин и комплекс вспомогательных веществ
(основа – сплав ПЭГ-400 и ПЭГ-1500).
Литература
1. Кудрин А.Н., Ананин В.В., Балабьян В.Ю. Система экспресс – методов
интегральной оценки биологической активности индивидуальных и
комплексных препаратов на биологических объектах // Рос. Хим. журн. – 1997.
– Т. 41. - № 5. – С. 114-123.
2. Использование экспресс – методов оценки биологической активности
на культуре клеток при разработке фитопрепаратов адаптогенного действия /
Степанова Э.Ф., Андреева И.Н., Огай М.А. и др. // Фармация на современном
этапе – проблемы и достижения: Науч. тр. – М.: 2000. - Т. 39, ч. 1. – С. 299-302.
280
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИНЕЙНЫХ КОЖНЫХ РАН
ИНФИЦИРОВАННЫХ СТАФИЛОКОККОМ
Огай М.А.1, Степанова Э.Ф.2, Ларионов Л.П.3, Петров А.Ю.3
e-mail: [email protected]
1
2
Воронежский государственный университет
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
3
Уральская государственная медицинская академия
ВВЕДЕНИЕ. Актуальной проблемой современной медицины и фармации
является метаболический синдром (МС), который проявляется как сочетание
сахарного диабета, ожирения, артериальной гипертензии и ишемической
болезни сердца (Д.Карlаn, 1989). Первичным является нарушение
нейроэндокринной функции гипоталамуса. Повышается секреция и выделение
гипофизом адренокортикотропного гормона, который в свою очередь повышает
образование гормонов коры надпочечников, что приводит к развитию
специфического ожирения с преимущественным отложением жировой ткани в
области плечевого пояса, живота, около внутренних органов [8]. Насыщение
печени жирами нарушает метаболизм инсулина, а это способствует развитию
нарушения толерантности к глюкозе, переходящего в сахарный диабет 2 типа
[4]. Одним из опасных проявлений последствий сахарного диабета является
синдром диабетическая стопа (СДС). Мази, гели – основная лекарственная
форма для лечения и профилактики дерматологических заболеваний. В
последние годы интерес к ним возрос в связи с развитием нового направления –
фитодерматологии [1, 2, 3]. Нами предложены гели на основе лекарственного
растительного сырья.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Создана модель линейной кожной раны инфицированной
стафилококком [6,7]. В эксперименте были использованы 24 белые
беспородные крысы обоего пола массой 150-175,0 гр.
Модель линейной кожной раны инфицированной стафилококком.
Животные были разделены на 4 группы по 6 особей в каждой. Для подавления
иммунитета всем группам вводили внутрибрюшинно циклофосфан в дозировке
75 мг/кг на 1, 3 и 5 день эксперимента. Животным проведена операция
нанесения линейных кожных ран. Линейные кожные раны наносили под
наркозом – хлоралгидратом (300 мг/кг). Кожу спины разрезали до собственной
фасции. Длина разреза составила 25 мм. Затем на равном расстоянии от краев
раны накладывали 1 шов, сближающий края раны.
Швы накладывались с таким расчетом, чтобы эпителий боковых краев
раны не соприкасался, и в этом случае эпителизация происходила от конечных
краев раны. Сразу после нанесения линейной кожной раны еѐ инфицировали
культурой стафилококка.
Изучаемое вещество наносили на раны животным – первую группу
животных не лечили (контроль), второй группе животных ежедневно на
281
раневую поверхность наносили левомеколь (препарат сравнения), третьей
группе животных – фитогель 1, четвертой группе животных – фитогель 2. Все
препараты наносили на протяжении всего периода эксперимента до полного
заживления ран.
Изучали срезы линейных кожных ран гистологически. Образцы кожи
брали таким образом, чтобы в поле зрения попадал как участок поврежденной
кожи, так и соседний неповрежденный участок. Эти участки рассматривались
как интактные для сравнения с поврежденными.
Фитогель 1 включает спиртоводное извлечение из зверобоя
продырявленного, прополис и облепиховое масло, и вспомогательные
вещества; фитогель 2 – спиртоводные извлечения из лавра благородного,
эхинацеи пурпурной, солодки голой, донника лекарственного, сок алоэ,
индивидуальный препарат таурин и комплекс вспомогательных веществ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологическое изучение срезов рубца линейных кожных ран,
инфицированных стафилококком
Группа 1. Контроль
Макроскопически края ран по всей еѐ длине покрыты, массивным, прочно
спаянным с подлежащей поверхностью, плотным струпом коричневого цвета.
При гистологическом исследовании заживление раны происходило вторичным
натяжением. C момента нанесения и инфицирования раны прошло 20 дней,
поверхность раны покрыта толстым слоем некротических масс, в которые
прорастает соединительная ткань, несколько выступающая над краями раны.
Это так называемое «дикое мясо» (на фото 1 указано стрелкой), образование
которого характерно для заживления вторичным натяжением. Дефект раны
заполнен соединительной тканью, в которой содержится мало клеточных
элементов и преобладает аморфный компонент. Просматриваются
образовавшиеся сосуды, изнутри покрытые эпителием. С краев раны
наблюдается вялая эпителизация. Слои горизонтально расположенных
фибробластов и коллагеновых волокон не сформированы, что говорит о вяло
текущем процессе заживления раны (см. фото 1).
Фото 1
Группа 2. Левомеколь
При микроскопии срезов кожи животных, получавших левомеколь, в
области кожной раны сохраняется тканевой дефект от нанесенной раны (на
фото 2 указано стрелкой), хотя эпителизация практически завершилась.
Количество
клеточных
элементов
мезинхимального
происхождения
ограничено. Преобладает аморфное вещество, хотя наблюдается начальное
формирование параллельных поверхности кожи пластов фибробластов. В
282
грануляционной ткани
натяжением (см. фото 2).
присутствуют
сосуды.
Заживление
вторичным
Фото 2
Группа 3. Фитогель 1
Макроскопически вся поверхность раны эпителизирована, фибринознонекротические массы на поверхности раны отсутствуют. При микроскопии
среза в зоне раны заживления вторичным натяжением с образование
грануляционной ткани. Раневой дефект частично замещен врастающим
эпидермисом (на фото 3 указано стрелкой). Клеточных элементов
соединительной ткани небольшое количество. Они замещаются коллагеновыми
волокнами. Наблюдается инволюция сосудистого компонента, что говорит о
достаточной зрелости регенерата (см. фото 3).
Фото 3
Группа 4.Фитогель 2.
При макроскопии в зоне инфицированной линейных кожных ран к
моменту исследования обнаруживаются точечные очаги фибринознонекротических масс. При микроскопии эпителизация раневой поверхности на
стадии завершения, однако, в центре кратера раны срастание эпидермиса
завершено не окончательно (на фото 4 указано стрелкой). Соединительнотканный компонент представлен в большей степени клеточным компонентом
(см. фото 4).
Фото 4
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Ранее [5] была доказана ранозаживляющая активность
разработанных фитогелей 1 и 2.
Гистологические исследования ран, инфицированных стафилококком и
леченных
разработанными
фитогелями,
подтверждают
зрелость
образовавшегося рубца по сравнению с контрольной группой. Выше
изложенное, позволяет в перспективе рассматривать фитогели для
283
профилактики и лечения некоторых последствий метаболического синдрома
(«диабетическая стопа»).
Литература
1.
Асеева Т.А., Николаев С.М. и др. / Сахароснижающие средства
растительного происхождения.// Мат. 3-го межд. съезда «Актуальные проблемы
создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». С-Пб.
29 июня-1 июля, 1999. – С. 13-16.
2.
Изучение сахароснижающего действия листьев лавра благородного
/ Л.А. Ашаева, А.И. Анчикова, Н.А. Алханова и др. // Фармация. – 1984. -Т. 12 –
№ 2. - С. 49-51.
3.
Каухова И.Е. Теоретические и экспериментальные основы
разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных
средств растительного происхождения: автореф. дис. … д-ра фармац. наук /
Каухова И.Е. – СПб., 2007. – 59 с.
4.
Мычка В. Б., Богиева Р. М., Чазова И. Е. Акробаза / Средство
профилактики множественных сердечно-сосудистых факторов риска
метаболического синдрома // Клин. Фармакол. и тер. — 2003. № 12(2). С. 80-83.
5.
Огай М.А., Степанова Э.Ф., Ларионов Л.П., Петров А.Ю.
Фармакологические исследования и технология фитогелей для коррекции
последствий сахарного диабета // Журн. "Вестник Воронежского
государственного университета". Серия: Химия. Биология. Фармация.
Воронеж. Изд-во ВГУ, 2009. №2; С. 171-173.
6.
Сернов Л.Н., Гацура В.В.// Элементы экспериментальной
фармакологии М., - 2000. - 351 с.
7.
Экспериментальный сахарный диабет / Под ред. В.Г. Баранова. - Л.
: Наука, 1983 . - 37 с.
8.
Чазова И. Е., Мычка В. Б. Метаболический синдром //
Кардиоваскулярная терапия и профилактика. — 2003. № 3. С. 32-38.
284
РАЗРАБОТКА КОМБИНИРОВАННЫХ СУППОЗИТОРИЕВ
ЖАРОПОНИЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ
Орлова Т.В., Панкрушева Т.А., Нестерова А.В., Огнещикова Н.Д.
e-mail: [email protected]
Курский государственный медицинский университет
Высокий уровень заболеваемости населения ОРВИ, гриппом требует
регуляции гипертермических состояний и использования в качестве
симптоматических средств анальгетиков-антипиретиков. У некоторых
пациентов, особенно детей, нарушение общего состояния может возникнуть от
сравнительно невысокой температуры, что выражается в возникновении
судорог, нарушении деятельности сердца, почек. Поэтому жаропонижающие
средства назначают и при невысокой температуре, а при гипертермии выше 39о
С они показаны всем.
Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) являются
важнейшими
симптоматическими
лекарственными
препаратами
современности, которые за счет уникальной комбинации фармакологических
свойств - противовоспалительных, анальгетических и жаропонижающих –
применяются практически во всех областях медицины. В современной
фармакотерапии используются различные лекарственные формы НПВС, такие
как порошки, таблетки, сиропы, инъекции. Однако, пероральный прием часто
невозможен из-за тошноты и рвоты, которые сопровождают лихорадочные
состояния. Инъекционный способ введения имеет ряд недостатков, одним из
которых, особенно в детской практике, является страх перед уколом. Следует
также учитывать, что нежелательным побочным эффектом НПВС является их
ульцерогенное действие на желудочно-кишечный тракт. Одним из путей
решения обозначенных проблем является использование НПВС в форме
суппозиториев.
Номенклатура
суппозиториев
противовоспалительного
и
жаропонижающего действия за последнее время значительно увеличилась, но
ассортимент ректальных лекарственных форм с НПВС отечественного
производства весьма ограничен. В то же время все выпускаемые суппозитории
являются однокомпонентными, а комбинированные суппозитории практически
отсутствуют. Тем не менее в терапии воспалительных заболеваний часто
прибегают к комбинации НПВС с лекарственными средствами других
фармакотерапевтических групп, таких как антигистаминные, анальгетические,
спазмолитические
средства,
витамины,
психостимуляторы,
которые
потенцируют и дополняют действие НПВС. Примерами служат препараты
отечественного и импортного производства такие как цитрамон, аскофен,
андипал, пенталгин, седалгин, колдрекс, панадол и др.
Цель нашей работы – разработка комбинированных суппозиториев,
содержащих НПВС, для симптоматического лечения ОРВИ, регуляции
гипертермических состояний. Нами предложены суппозитории двух составов.
285
Суппозитории
состава 1 содержат парацетамол в комбинации с
димедролом, т.к. антигистаминные средства являются синергистами НПВС, в
т.ч. обладают доказанной эффективностью при рините, снижая объем секреции,
уменьшая зуд в носу и частоту чихания.
На основе проведенных биофармацевтических исследований нами
установлены оптимальные суппозиторные основы, обеспечивающие
максимальный выход активных субстанций: масло какао и Витепсол Н-15.
Суппозитории готовили массой 2,0 г соответственно методами выкатывания и
выливания. Лекарственные средства вводили в основу по типу суспензии.
Разработаны методики качественного и количественного определения
парацетамола и димедрола в суппозиториях. Относительная ошибка
определения парацетамола в суппозиториях методом УФ-спектрофотометрии
на основах Витепсол Н-15 и масло какао составляет не более ±4,5%; а
димедрола (метод аргентометрии по Фаянсу с индикатором бромфеноловым
синим) - ±1,42% и ±2,77% соответственно.
Проведена оценка качества полученных суппозиториев и изучена их
стабильность в процессе хранения.
Для определения температуры плавления суппозиториев с парацетамолом и
димедролом использовали метод 2а, описанный в ГФ XI издания. Средняя
температура плавления изученных суппозиториев составила: для свечей на
масле какао 32,8°С, а на Витепсоле 35,1° С.
Значение времени полной деформации суппозиториев устанавливали по
методике ГФ XI изд., которое составило 2 и 13 мин для суппозиториев на масле
какао и Витепсоле соответственно.
Потенциометрическим методом определено значение рН водной вытяжки из
суппозиториев с парацетамолом и димедролом, которое близко к нейтральному и
равно: 6,73 ед. (масло какао) и 6,37 ед. (Витепсол Н-15).
Изучена дисперсность лекарственных веществ с помощью оптического
микроскопа марки МБУ - 4А и окулярного микрометра. В суппозиториях
преобладает фракция частиц размером до 25 мкм, средний размер частиц
составляет 32,6 мкм. Указанная степень дисперсности лекарственных веществ
является достаточной для их полного высвобождения из суппозиториев.
Суппозитории состава 1 отвечают всем фармакопейным требованиям,
предъявляемым к данной лекарственной форме и стабильны в течение 18
месяцев.
Уже довольно продолжительное время для достижения быстрого и
надежного
жаропонижающего, обезболивающего и спазмолитического
эффекта в медицинской практике, особенно скорой помощи, используют
инъекционный препарат, содержащий комбинацию анальгина с папаверина
гидрохлоридом. Это сочетание показало свою эффективность, а в некоторых
случаях и незаменимость при гипертермических, спастических состояниях,
болях различного происхождения. Некоторые педиатры также отдают
предпочтение анальгину по сравнению с другими НПВС, т.к. он способствует
расширению сосудов и улучшению гемодинамики, не обладает судорожным
действием.
286
Известны таблетированные препараты, содержащие анальгин в сочетании
с папаверина гидрохлоридом или близкими по свойствам спазмолитиками:
андипал, баралгин и др. Отечественной промышленностью выпускаются
однокомпонентные суппозитории анальгина и папаверина гидрохлорида. В
связи с этим нами разработаны комбинированные суппозитории с данными
лекарственными веществами (состав 2).
В ходе биофармацевтических исследований установлены оптимальные
основы для производства суппозиториев, содержащих комбинацию анальгина и
папаверина гидрохлорида: масло какао и Витепсол Н-15.
Определены физико-химические показатели качества суппозиториев
состава 2. Время полной деформации равно 3 и 8 мин для свечей,
изготовленных на масле какао и Витепсоле соответственно. Средние
температуры плавления исследуемых суппозиториев, изготовленных на
Витепсоле и масле какао, соответственно составляют 35,32 и 35,4 0С. Водные
вытяжки из суппозиториев, изготовленных на обеих основах, имеют
слабощелочную реакцию среды (7,5 и 7,39 ед.). Средний размер частиц в
суппозиториях на данных основах - 13,6 мкм.
Для количественной оценки анальгина и папаверина гидрохлорида при
совместном присутствии нами был использован спектрофотометрический
метод Фирордта. Относительная ошибка определения активных ингредиентов
в суппозиториях не превышает ±3,80 %.
Суппозитории состава 2 отвечают всем фармакопейным требованиям и
стабильны в течение 12 месяцев (срок наблюдения).
Таким образом, разработаны и стандартизованы комбинированные
суппозитории для купирования лихорадочных состояний при простудных
заболеваниях и воспалительных процессах различной этиологии.
287
СОЛИ 2,3-ДИАМИНО-5,7-ДИАРИЛ-3Н-[1,2,4]-ТРИАЗОЛО[1,5-а]ПИРИМИДИНИЯ И ИХ 6-ОЛАТЫ. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕИЕ В
КАЧЕСТВЕ ЛЮМИНИСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ В ЦИТОЛОГИИ
Папонов Б.В.1, Шкорбатов Ю.Г.2, Пасюга В.Н.2
е-mail: [email protected]
1
2
Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина
НИИ Биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина
Ряд
бромидов
2,3-диамино-5,7-диарил-3Н-[1,2,4]-триазоло[1,5a]пиримидиния 3 был синтезирован взаимодействием 3,4,5-триамино-1,2,4триазола 1 с 1,2-дибром-1,3-диарилпропанонами-1 (халкондибромидами) 2 по
известной методике [1].Также известно, что в случае, когда арильный
заместитель в положении 7 триазолопиримидиниевого бицикла в бромидах 3
содержит электронакцепторный заместитель (например нитрогруппу)
возможно их окисление в соответствующие 2,3-диамино-5,7-диарил-3Н-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидиний-6-олаты 4 [2]. Для соединений, не содержащих
нитрофенильных радикалов в положении 7 триазолопиримидиниевого бицикла,
олаты 4 ранее синтезированы не были.
И
бромиды
2,3-диамино-5,7-диарил-3Н-[1,2,4]-триазоло[1,5a]пиримидиния 3 и их олаты 4 являются эффективными люминофорами.
Полосы люминисценции и тех идругих соединений проявляются в зелѐной
области видимого спектра. Однако, 2,3-диамино-5,7-диарил-3Н-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидиния 3 водорастворимы, а олаты 4 не растворимы в
воде.
Таким образом соли триазолопиримидиния 3 и их олаты 4 можно
эффективно использовать для крашения клеток и их органелл. Однако
нитрогруппа олатов 4 является ―тушителем‖ люминисценции и, кроме того
может повышать токсичность исследуемых соединений по отношению к живой
клетке.
В силу этих причин нами был разработан эффективный метод синтеза
2,3-диамино-5,7-диарил-3Н-[1,2,4]-триазоло[1,5-a]пиримидиний-6-олатов 4 не
содержащих в положенни 7 нитрофенильного радикала. Соединения были
получены с хорошими выходами взаимодействием 3,4,5-триамино-1,2,4триазола с 1,2-дибром-1,3-диарилпропанонами-1 (халкондибромидами) 2 в
этаноле в присутствии эквимолярного количества DBU (схема 1).
288
Проведено исследование применимости данного красителя в цитологии в
качестве витального красителя – для окрашивания живых клеток, а также и в
качестве красителя для фиксированных препаратов клеток. При прижизненном
окрашивании клеток буккального эпителия человека и лейкоцитов красителем в
концентрациях 0,5; 0,05; 0,005 мМ в течение 10 минут в ультрафиолетовом
счете с длиной волны 360-440 нм наблюдалась зеленая флуоресценция клеток.
В клетках буккального эпителия при увеличении х 660 были отчетливо видны
ядра и внутриядерные структуры, в цитоплазме наблюдались волокнистые
структуры, напоминавшие структуры цитоскелета. Особенно четко на общем
фоне выделялись ядра лейкоцитов, характеризующиеся наиболее ярким
свечением. Использованию красителя для прижизненного окрашивания клеток
способстлуют два обстоятельства: высокая растворимость в воде и низкая
токсичность красителя. Согласно полученным нами данным, в тесте на
жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего (0.5 %),
краситель в концентрации 0,5 мМ при воздействии на клетку в течение 1 часа
вызывал увеличение процента клеток с поврежденными мембранами;
концентрации краситедя 0,05 и 0,005 мМ не вызывли увеличения количества
поврежденных клеток. Предварительно фиксированные этанолом клетки
данным красителем не окрашивались.
289
ОСОБЕННОСТИ АНАЛИЗА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Передеряев О.И. e-mail: [email protected]
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Высокомолекулярные лекарственные средства имеют молекулярную
массу
от
нескольких
тысяч
(низкомолекулярные
гепарины,
поливинилпирролидон) до нескольких миллионов атомных единиц (ферменты),
и по своей структуре, как правило, представляют многократно повторяющиеся
фрагменты, соединенных между собой химическими или координационными
связями.
Применение в медицине высокомолекулярных лекарственных средств
различного происхождения имеет ряд особенностей, требующих особых
подхода к оценке их качества, безопасности и стандартизации.
Во-первых, значительная часть высокомолекулярных лекарственных
средств применяется парентерально (в виде инъекций и инфузий). Это
обуславливает необходимость использования наиболее строгих показателей,
обеспечивающих безопасность лекарственных средств.
Во-вторых, способы получения высокомолекулярных лекарственных
средств сопряжены с возможностью загрязнения конечного лекарственного
средства как побочными продуктами их синтеза и выделения, так и продуктами
их деградации в процессе хранения. В этом случае как химические, так и
физические свойства примесей практически не отличаются от свойств
основных веществ, что делает их обнаружение и количественное определение
весьма сложной задачей.
Однако существующие подходы к оценке качества и безопасности
высокомолекулярных лекарственных средств не в полной мере оценивают все
возможные факторы загрязнения или изменения лекарственного средства. Как
правило, качественное и количественное определение действующих
компонентов высокомолекулярных лекарственных средств проводится
косвенным образом.
Так, в качестве способа идентификации и количественного определения
часто используется оценка биологической активности высокомолекулярного
лекарственного средства.
В качестве примера можно привести использование антикоагулянтной
активности для лекарственных средств, основным действующим веществом
которых является гепарин или низкомолекулярный гепарин. Лекарственные
средства, действующим началом которых является поливинлипирролидон,
часто оценивают по вязкости образуемых растворов.
Такие способы идентификации и количественного определения имеют
свои достоинства:
определяется именно тот эффект, для которого используется данное
лекарственное средство;
290
относительная простота и доступность: такие методы, как правило,
не требуют сложного оборудования и специальных навыков и познаний в
области химии;
такие методы количественного определения требуют меньших
затрат по времени, по сравнению с распространенными физико-химическими
методами.
Однако такие способы идентификации и количественного определения не
в полной мере позволяют оценить безопасность лекарственных средств: они не
позволяют выявить присутствие веществ с чрезмерно меньшей или чрезмерно
большей молекулярной массой (как правило, имеют такой же эффект, но
несколько другие параметры фармакокинетики, могут быть аллергены). Такие
методы не позволяют подтвердить структуру вещества или выявить
присутствие вещества со сходной структурой.
Последнее является обязательным. Это подтверждает случай гибели
более 200 человек по всему миру от аллергических осложнений у людей,
принимавших низкомолекулярный гепарин. Одна из серий этого
лекарственного средства была загрязнена хондроитин сульфатом – веществом
по свой структуре и свойствам очень похожим на низкомолекулярные
гепарины, но обладающим высокой аллергенностью при парентеральных
способах введения. Следует отметить, что загрязнение произошло еще на
уровне субстанции, однако ни при оценке качества и безопасности самой
субстанции, ни при оценке качества и безопасности конечного лекарственного
средства отклонений выявлено не было.
Ряд применяемых методов при оценке качества и безопасности
высокомолекулярных лекарственных средств имеет вспомогательную, но
необходимую роль, а именно:
определение молекулярно-массового распределения действующих
веществ
методом
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии
(низкомолекулярные гепарины, белки);
определение молекулярной массы действующего вещества по
вязкости (используется для поливинилпирролидона):
определение отдельных элементов, образующих действующее
вещество: сера (гравиметрически, для гепаринов и низкомолекулярных
гепаринов, хондроитин сульфата), азота (методом Къельдаля, для
поливинилпирролидона);
определение
остаточных
мономеров
физико-химическими
(высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография) и
химическими методами (используется при анализе поливинилпирролидона)
идентификация действующих веществ методом инфракрасной
спектроскопии (для поливинилпирролидона).
К сожалению, анализ фармакопейных статей на высокомолекулярные
лекарственные средства показывает, что в большинстве случаев, для
стандартизации и оценки безопасности таких лекарственных средств
291
используются наиболее простейшие методы, не позволяющих оценить
лекарственное средство со всех сторон в полной мере.
Это обуславливает острую необходимость в разработке современного
систематизированного подхода к оценке качества, безопасности и
стандартизации высокомолекулярных лекарственных средств различного
происхождения.
Для этого необходимо:
разработать
методики
качественного
и
количественного
определения
состава
действующих
компонентов
ряда
широко
распространенных высокомолекулярных лекарственных средств (гепарины,
иммуноглобулины, вакцины, поливинилпироллидон и пр.);
разработать
методики
качественного
и
количественного
определения состава сопутствующих компонентов высокомолекулярных
лекарственных средств: продуктов деградации действующих веществ,
вспомогательных технологических средств, побочных продуктов получения
или выделения лекарственного вещества;
выявить
возможные
различия
между
качественным
и
количественным составом действующих и сопутствующих компонентов
однотипных высокомолекулярных лекарственных средств различных
производителей;
оценить влияние найденных различий в качественном и
количественном составе как действующих, так и сопутствующих компонентов
на качество и безопасность лекарственных средств.
на основании проведенных исследований выявить ключевые
характеристики состава высокомолекулярных лекарственных средств,
влияющих на их качество и безопасность.
предложить показатели оценки качества и стандартизации
высокомолекулярных лекарственных средств.
На основании проведенных исследований необходимо выявить ключевые
(обязательные) показатели качества и безопасности высокомолекулярных
лекарственных средств, а также предложить систематизированный подход к
оценке качества, безопасности высокомолекулярных лекарственных средств.
Решение указанных вопросов позволит существенно снизить риск
возможного выхода на рынок таких высокомолекулярных лекарственных
средств, применение которых может иметь негативные последствия для
здоровья человека.
292
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ КАПСУЛ, СОДЕРЖАЩИХ ЭКСТРАКТ ИЗ
ЦВЕТКОВ БАРХАТЦЕВ В СОЧЕТАНИИ С КВЕРЦЕТИНОМ
Погорелов В.И., Тираспольская С.Г., Сергеева Е.О., Алфимова Г.В.,
Максименко Т.И. e-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
Целью настоящего исследования было создание комбинированного
лекарственного препарата, обладающего гепатопротекторным действием и
содержащего кверцетин в сочетании с сухим экстрактом цветков бархатцев в
соотношении 1:50, в форме капсул.
Сочетание двух веществ в одном лекарственном препарате привело к
потенцированию фармакологического действия и позволило снизить дозу в 2
раза, что было подтверждено при проведении биохимических исследований.
Изучение гепатопротекторного действия капсул, содержащих кверцетин и
сухой экстракт из цветков бархатцев распростѐртых, при поражении печени
тетрахлорметаном (ССL4) проводили на белых беспородных половозрелых
крысах обоего пола массой 200-220 г. Модель острого
ССL4 –гепатоза
воспроизводили путѐм введения per os с помощью зонда 3 раза через день в
виде 50% -ного раствора тетрахлорметана в вазелиновом масле в дозе 0,15
мл/100 г массы тела животного. Кверцетин вводили перорально в дозе 100
мг/кг в виде водной суспензии, экстракт из цветков бархатцев в дозе 200 мг/кг,
капсулы, содержащие кверцетин
и экстракт из цветков бархатцев
распростѐртых в соотношении 1:50 – в дозе 100 мг/кг. Исследованные вещества
вводили по лечебно-профилактической схеме. В качестве препарата сравнения
использовали официальный гепатопротектор флавоноидной природы – карсил.
Полученные данные приведены на рис. 1 и 2.
100
%
90
* ^
80
*
70
60
40
*^
*
*
*
*
50
^*
*^
*
*
*
30
20
10
0
АлАт
КФ
Интактные
ЩФ
Капсулы, 100 мг/кг
ОБ
Карсил, 100 мг/кг
100%- контрольные животные;^- достоверно по отношению к интактным животным;
*-достоверно по отношению к контрольным животным
Рис. 1. Влияние капсул и карсила на биохимические показатели
сыворотки крови при остром CC l4-гепатозе у крыс
293
*
200
%
180
*
160
^
140
120
100
80
*^
60
40
*
^
*
*
*
*
20
0
ТРГ
Гликоген
Интактные
Капсулы, 100 мг/кг
ТБК-продукты печени
Карсил, 100 мг/кг
Рис. 2. Влияние капсул и карсила на биохимические показатели в печени
крыс при остром CC l4-гепатозе
В результате проведѐнных исследований нами установлено, что
применение предложенных капсул при поражении печени тетрахлорметаном
полностью предотвращало активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) в
печени и стабилизировало внутриклеточные мембраны, значительно сдерживало
развитие цитолиза и холестаза, улучшало гликогенсинтетическую функцию
печени, способствовало устранению развития жировой дистрофии в печени.
Эффективность гепатозащитного действия изучаемых капсул оказалась
несколько более выраженной, чем при использовании кверцетина и экстракта в
отдельности и карсила, поскольку под влиянием капсул на фоне поражения
печени тетрахлорметаном полностью нормализовалось значительно большее
число исследованных биохимических показателей, чем под влиянием последних.
Сухой экстракт цветков бархатцев представляет собой полученное с
помощью 70% спирта, упаренное и высушенное из них извлечение, которое
вследствие своей высокой гигроскопичности было смешано с молочным
сахаром в соотношении 1:2,5 с целью увеличения срока хранения и улучшения
сыпучести. Для равномерного заполнения капсул важно, чтобы размер частиц
порошка колебался в незначительных пределах. Слишком мелкие порошки
плохо дозируются, так как обладают плохой сыпучестью. Путѐм ситового
анализа нами был определѐн фракционный состав указанной смеси. Для этого
порошок в количестве 25,0 просеивали через набор сит с диаметром отверстий
от 1,0 до 0,1 мм. Установили, что в смеси порошков преобладают фракции от
0,5 до 0,2мм, что обеспечивает однородность порошка и минимальное
расслоение смеси при дозировании в капсулы.
Далее нами были определены сыпучесть указанной смеси порошков и
угол естественного откоса [1]. В результате проведѐнных исследований
установили, что смесь порошков кверцетина и сухого экстракта бархатцев 1:50
имеет удовлетворительную сыпучесть (3,53 г/с), угол естественного откоса
48ºС, что достаточно для обеспечения равномерного наполнения капсул
лекарственным препаратом.
294
С целью изготовления капсул в лабораторных условиях порошки
кверцетина и сухого экстракта цветков бархатцев просеивали через сито с
размером пор 0,3 мм и смешивали их в указанном выше соотношении в ступке
до получения однородной массы желто-коричневого цвета. В процессе
выполнения работы были использованы заводские твердые желатиновые
капсулы максимального размера. В условиях лаборатории капсулы заполнялись
вручную. Порошок развешивали на дозы с помощью ложки-дозатора по 0,501 г.
Определение распадаемости и растворимости капсул показало, что все
образцы полностью растворились за 11 мин и за 45 мин растворилось более
75,5% экстрактивных веществ, что соответствует требованиям ФС к твѐрдым
лекарственным формам [2]. Экстракт бархатцев и полученные капсулы были
подвергнуты качественному и количественному анализу. Для подтверждения
подлинности флавоноидов использовали цветные реакции с растворами натрия
гидроксида, натрия нитрита, железа (III) хлорида, образование азокрасителя,
цианидиновую пробу. Хроматографическое исследование (метод ТСХ)
подтвердило наличие в экстракте цветков бархатцев кверцетина (Rf=0,85±0,02)
и рутина (Rf=0,50±0,01) в системе растворителей бутанол-уксусная кислота –
вода (4:1:5). Свидетелями служили стандартный образец кверцетина и рутина.
Проявители – УФ-свет (254 нм) и 2% раствор алюминия хлорида.
Количественное определение флавоноидов в экстракте и в капсулах
осуществляли методом дифференциальной спектрофотометрии, используя
реакцию взаимодействия флавоноидов с 2% спиртовым раствором алюминия
хлорида [2]. В качестве аналитической длины волны выбрали 427 нм,
соответствующую максимуму поглощения комплекса флавоноидов с раствором
алюминия хлорида. Расчѐт количественного содержания суммы флавоноидов в
пересчѐте на кверцетин проводили с использованием значения удельного
показателя поглощения для продукта взаимодействия кверцетина с алюминия
хлоридом 765,6. Содержание флавоноидов
в сухом экстракте цветков
бархатцев в пересчѐте на кверцетин составляет -3,95±0,17%, в капсулах –
0,031±0,001%. Относительная погрешность определения ±1,8%.
Таким образом, разработана схема производства капсул с кверцетином и
сухим экстрактом цветков бархатцев распростѐртых (1:50). Предложены
методики качественного и количественного определения флавоноидов в
капсулах в пересчѐте на кверцетин. Экспериментально подтверждено, что
сочетание экстракта цветков бархатцев и кверцетина в одной лекарственной
форме – капсулах позволяет снизить дозу каждого ингредиента в 2 раза.
Литература
1.
Алексеева, В.А. Оценка современных требований капсул / В.А.
Алексеева, Т.П. Глотова, Г.С. Михайлова // Фармация. – 1989. - Т.38, №4 –
С.76-79.
2.
Государственная фармакопея СССР. - XI изд. - Вып.2: Общие
методы анализа. Лекарственное растительное сырье. – М.:Медицина, 1990. 400с.
295
ТРЕХКОМПОНЕНТНЫЙ СИНТЕЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
СПИРОСОЕДИНЕНИЙ С КАРБАМАТНОЙ ФУНКЦИЕЙ
Поддубный О.Ю.1, Великородов А.В.1, Титова О.Л.2, Сухенко Л.Т.1,
Дегтярев О.В.2 e-mail: [email protected]
1
2
Астраханский государственный университет
Астраханская государственная медицинская академия
В развитие исследований по синтезу биологически активных соединений
с карбаматной функцией исследованы закономерности трехкомпонентных
синтезов с участием метил N-4-[2-(3-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-3ил)ацетил]фенилкарбамата (1), полученного, в свою очередь, конденсацией
изатина с метил N-(4-ацетилфенил)карбаматом [1]. Нами изучены реакции 1,3диполярного циклоприсоединения азометинилидов [2,3], образующихся in situ
при взаимодействии аминокислот (саркозина и L-пролина) c карбонильными
соединениями (изатином, аценафтенхиноном и нингидрином).
296
NH
Me
NH
O
N
Me
C6H4NHCO2Me-p
O
O
O
O
N
C6H4NHCO2Me-p
OO
O
O
N
H
O
N
H
2
MeNHCH2CO2H
MeNHCH 2CO 2H
3
MeOH-H2O,
диоксан,
C6H4NHCO2Me-p
O
O
O
O
O
N
H
1
OH
OH
N
H
N
H
O
MeNHCH2CO2H
CO 2H
MeOH-H2O,
MeOH,
NH
NH
Me
O
N
O
C6H4NHCO2Me-p
N
C6H4NHCO2Me-p
O O
OO
N
H
O
4
5
На основании изучения структуры продуктов реакций методами ИК,
ЯМР 1Н, 13С спектроскопии установлено, что реакции протекают регио- и
стереоселективно с образованием спиросоединений c карбаматной функцией 25
с выходами 67-78%. Регионаправленность циклоприсоединения
азометинилидов к диполярофилу 1 согласуется с направлением поляризации
реагентов.
Схема генерирования азометинилидов из -аминокислот и карбонильных
соединений показана ниже на примере саркозина и аценафтенхинона.
Me _
O
O
O
+ CH3-NH-CH2COOH
- CO2
-H2O
297
+ N CH
2
Me
O
_ N CH2
+
Синтезированные спиросоединения 2-5 были протестированы в
отношении микроорганизмов Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Candida
albicans, а также в отношении музейных штаммов стафилококков (St. aureus
209, E. coli O 18), культуры Micrococcus, выделенных из организма человека.
Изучение противогрибковой активности проводилось в соответствии со
стандартом М27 методом серийного разведения NCCLS [4,5] в плотной и
жидкой среде Сабуро [5]. В пробирке к серийно разведенному препарату в
димексиде добавляли взвесь микроорганизма и определяли минимальную
концентрацию вещества способную задерживать рост тест-культуры. В
качестве тест-культур использовали микроорганизмы Microsporum canis,
Trichophyton rubrum, Candida albicans.
Пробирки термостатировали при 24±3 С в течение 7 суток (Candida
albicans) и 30 суток (Microsporum canis, Trichophyton rubrum). С целью
определения характера действия препарата (фунгистатическое – ФС) или
(фунгицидное – ФЦ) производили высевы на чашки Петри с суслом-агаром из
всех пробирок. Чашки помещали в термостат при 24±3 С в течение 7 суток
(Candida albicans) и 30 суток (Microsporum canis, Trichophyton rubrum).
Препаратом сравнения служил эконазол.
Противогрибковые испытания in vitro показали, что синтезированные
спиросоединения с карбаматной функцией проявляют фунгистатическое
действие в диапазоне концентраций 160-320 мкг/мл, фунгицидное действие – в
диапазоне концентраций 160-640 мкг/мл.
Противомикробную активность спиросоединений изучали методом
прямой диффузии в питательную среду и методом бумажных дисков в чашках
Петри, предварительно засеянных суспензиями микроорганизмов в разведении
1
105 микробных тел в 1 мл. Спиросоединения 2-5 вносили в лунки
питательной среды в объеме 25 мкл, начиная со стартовых концентраций 1 мг в
1 мл растворителя – диметилсульфоксида. После внесения растворов
соединений микроорганизмы культивировали при 37 С.
Оценку результатов чувствительности осуществляли измерением
диаметра зоны задержки роста микроорганизмов вокруг лунки, учитывая
диаметр лунки в мм [6] через каждые двое суток в течение двух недель,
контролируя динамику устойчивости исследуемых штаммов или снижения
подавления развития микроорганизмов под влиянием соединений за время
наблюдения. Препаратом сравнения служил гентамицин. Дополнительно
оценку резистентности исследуемых культур микроорганизмов проводили
согласно принятой классификации [7].
Установлено, что спиросоединения с карбаматной функцией 2-5
проявляют умеренную антимикробную активность в отношении изученных
штаммов микроорганизмов.
298
Литература
[1]. Поддубный О.Ю., Великородов А.В., Куанчалиева А.К. Тезисы докл.
VII Всерос. конф. «Химия и медицина, Орхимед-2009». – Уфа: Гилем, 2009,
246.
[2]. Serov A.B., Kartsev V.G., Alexandrov Yu.A., Dolgushin F.M. Rus. Chem.
Bull., Int. Ed., 2005, 54 (10), 2432.
[3]. da Silva J.F.M., Garden S.J., Pinto A.C. J. Braz. Chem. Soc., 2001, 12 (3),
273.
[4]. Espinel-Ingroff F., Boyle K., Sheehan D.J. Mycopathologia, 2001, 150,
101.
[5]. Rex J.H., Pfaller M.A., Galgiani J.N., Bartlett M.S., Espinel-Ingroff A.,
Ghannoum M.A., Lancaster M., Odds F.C., Rinaldi M.G., Walsh T.J., Barry A.L.,
Clin Infect Dis., 1997, 24 (2), 248.
[7]. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических
исследований. – М.: Медицина, 1972,
[8]. Коротяев А.И., Ьабичев С.А. Медицинская микробиология,
иммунология и вирусология. – С.-Петербург: Спецлитература, 1998.
299
ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ОРИГИНАЛЬНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ АФОБАЗОЛА
Полковникова Ю.А. e-mail: [email protected]
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
В настоящее время большую актуальность приобретает вопрос создания
пролонгированных лекарственных форм, способных обеспечить длительное
действие лекарственного средства с одновременным снижением его суточной
дозы. Лекарственные препараты этого типа обеспечивают поддержание в крови
постоянной концентрации действующего вещества без пиковых колебаний.
Пролонгированные
лекарственные формы позволяют снизить кратность
назначения лекарственного средства, и соответственно, уменьшить частоту
развития и выраженность возможных нежелательных реакций лекарственных
средств. Сокращение кратности приемов лекарственных препаратов создает
определенные удобства как для медицинского персонала в клиниках, так и для
тех пациентов, которые осуществляют лечение амбулаторно.
Существуют различные технологические принципы достижения
пролонгированного действия твердых лекарственных форм. Современная
фармацевтическая промышленность предусматривает также создание
специальных лекарственных форм, способных обеспечить пролонгированное
действие лекарственных средств. Одной из таких лекарственных форм
являются спансулы [1].
Эффект спансул основан на том, что обычные желатиновые капсулы
содержат сфероидальные частицы лекарственного вещества с пленчатым
покрытием, обеспечивающим непрерывное высвобождение лекарственного
средства в течение продолжительного времени и его всасывание в кровь.
Контролируемое высвобождение лекарственного средства достигается тем, что
микрокапсулы, содержащие его, покрыты различными слоями оболочек,
которые растворяются постепенно, что и обеспечивает постоянное поступление
в просвет кишечника свободного лекарственного вещества.
Спансулы создают новый способ применения лекарственных препаратов
и являются «прорывом» в терапии. При приеме они быстро высвобождают
требуемую начальную дозу, а затем медленно и постепенно – мельчайшие
дозы, что позволяет поддерживать терапевтический эффект более, чем 12 часов
и обеспечивать кофмортность при длительном лечении [1].
Перед нами стояла задача – разработать состав комбинированной
лекарственной формы. В качестве действующего вещества мы взяли афобазол,
представляющий собой селективный анксиолитик, разработанный российскими
фармакологами НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова.
В настоящее время существует богатый арсенал противотревожных
лекарственных препаратов, позволяющих влиять не только на психические, но
и на соматические проявления тревоги. Наряду со специфическими
анксиолитиками (бензодиазепинами) широко применяются лекарственные
300
средства из других групп, также обладающие противотревожными свойствами
[2].
На наш взгляд, целесообразно было включить в разрабатываемый
лекарственный препарат такие сопутствующие компоненты, как магния
аспарагинат, пиридоксин, кислоту аскорбиновую.
Применение органических солей магния в моно- и комплексной терапии
открывает большие возможности для лечения широкого круга заболеваний.
Клинические
исследования
показали,
что
терапия
органическими
соединениями магния способна достоверно ослабить психические и
соматические проявления тревоги. Его применение также снижает тревогу,
вызванную алкогольной абстиненцией [3].
Пиридоксин улучшает метаболизм в тканях мозга, так как является
главным катализатором обмена аминокислот, синтеза большинства
нейромедиаторов нервной системы.
Витамин С, или аскорбиновая кислота, является наиважнейшим
витамином в жизнедеятельности человека. Важность этого витамина трудно
переоценить, потому как практически не существует такого процесса в
жизнедеятельности организма, на который бы не повлияла бы аскорбиновая
кислота [4].
Для выбора оптимальной технологии получения микрокапсул были
использованы традиционные технологические методы [5].
Сначала мы попытались осуществить микрокапсулирование наиболее
принятыми в лабораторных условиях физико-химическими способами, в
частности, методом диспергирования в системе жидкость – жидкость.
В итоге полученные микрокапсулы имели круглую, шарообразную
форму, темно-коричневый цвет.
Далее для сравнения мы провели получение микрокапсул физическим
способом (напыление растворов ВМВ в дражировочном котле). В качестве
оболочки для микрокапсул мы выбрали следующие ВМВ, используемые для
пролонгирования действия лекарственных веществ:
1. Колликут (Kollicoat MAE 100P) – полимерный комплекс этакрилово