ISSN 1563-0218 Индекс 75866 25866 Əл

Доступен только на StudyGur

Тема:
Скачиваний: 22
Страниц: 388
Опубликован:
ЧИТАЙТЕ ПОЛНЫЙ ТЕКСТ ДОКУМЕНТА

ПРЕДПРОСМОТР

Əл-Фараби атындағы
Қазақ ұлттық университеті
ҚазҰУ
ХАБАРШЫСЫ
Биология сериясы
АЛМАТЫ
Основан 22.04.1992 г.
Регистрационное
свидетельство № 766.
Перерегистрирован
Министерством культуры,
информации и общественного
согласия Республики
Казахстан 25.11.99 г.
Регистрационное
свидетельство №956-Ж
Редакционная коллегия:
Шалахметова Т.М., д.б.н.,
проф.,
(научный редактор)
Тулеуханов С.Т., д.б.н., проф.,
(зам.научного редактора)
Оразова С.Б., к.б.н.
(ответственный секретарь)
тел.: 377-33-29
Айдосова С.С. д.б.н., проф.,
Айташева З.Г. д.б.н., проф.,
Бисенбаев А.К. д.б.н.,
Заядан Б.К., д.б.н., проф.,
Иващенко А.Т. д.б.н., проф.,
Карпенюк Т.А. д.б.н., проф.,
Мукашева Т.Д. д.б.н.,
Мухитдинов Н.М. д.б.н., проф.,
Нуртазин С.Т. д.б.н., проф.,
Сапаров К.А. д.б.н., проф.,
Шигаева М.Х. д.б.н., проф.,
Шулембаева К.К. д.б.н., проф.
Вестник КазНУ
Серия биологическая
№ 4 (56) 2012 г.
ИБ № 5720
Подписано в печать 31.08.2011.
Формат 90х110 1/8.
Бумага офсетная № 1.
Печать офсетная. Уч.-изд.л. 16.
Тираж 500 экз. Заказ № 298
Цена договорная.
Издательство «Қазақ университеті»
Казахского национального
университета имени аль-Фараби.
050038, г.Алматы,
пр. аль-Фараби, 71, КазНУ.
Отпечатано в типографии
издательства
«Қазақ университеті»
ISSN 1563-0218
Индекс 75866
25866
Казахский национальный университет
имени аль-Фараби
ВЕСТНИК
КазНУ
Серия биологическая
№ 4 (56)
2012
Внеочередной. Собственник КазНУ имени аль-Фараби
СОДЕРЖАНИЕ:
ПЛЕНАРНЫЕ ДОКЛАДЫ
Саубенова М.Г. Достижения Института Микробиологии И
Вирусологии Кн Мон Рк
Мансуров З.А. Нанотехнологии: 20 Летняя Деятельность и перспективы
развития.
Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д. Разнообразие микроорганизмов и
продуктов их жизнедеятельности
Алмагамбетов К.Х., Молдагулова Н.Б., Ануарбекова С.С.,
Сармурзина З.С. Коллекции микроорганизмов, их использование и
развитие
МИКРОБИОЛОГИЯ
Абдиева Г.Ж., Имадиева А.М., Қайырманова Г.Қ., Жұбанова А.А.,
Акимбеков Н.Ш. Ағын судан бөлініп алынған деструктивті белсенді
гетеротрофты
микроорганизмдерді
идентификациялау
жəне
иммобилиздеу………………………………………………………………
Айдаркулова Р.С., Науанова А.П., Айтенова М.Б. Фунгицидті қасиетке
ие сhaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын арпаның тамыр
шірігі ауруына қарсы қолдану..............................................................
Аленькина С.А., Трутнева К.А., Никитина В.Е. Влияние лектинов
азоспирилл на содержание салициловой кислоты в корнях проростков
пшеницы …………………………………………………………………...
Алимарданова М.К., Надирова С.А., Султанбекова А.Б.
Биотехнологические аспекты использования вторичного белково–
углеводного сырья………………………………………………………….
Алмагамбетов К.Х., Сармурзина З.С., Молдагулова Н.Б., Абитаева
Г.К. Влияние экстрактов лекарственных растений на биологические
свойства микроорганизмов
Антоновская Л.И., Белясова Н.А., Рокало И.П. Использование
метаболической
активности
бактерий
для
оценки
степени
бактериостойкости материалов……………………………………………..
Баяқышова Қ., Гаврилова Н.Н., Ратникова И.А. Ассоциациялар
құрамына
кіретін
мұнайтотықтырушы
микроорганизмдердің
культивирлеу жағдайларын іріктеу ..........................................................
Блиева Р.К. Повышение продуктивности и селекция микромицетовпродуцентов ферментов............................................................................
Ботбаева Ж.Т., Науанова А.П., Əбдукерім Р.Ж. Разработка
технологии получения эффективного биофунгицида – стимулятора
роста растений на основе микроорганизмов………………………………
Велямов М.Т., Дарахунова Н.Н., Бержанова Р.Ж. Обогащение
овощных напитков пектином является жизненно важным …………….
Велямов М.Т., Бержанова Р.Ж., Амирбаева М.М., Амангелді А.А.
Көкөністердің микробиологиялық ластануының мониторингі кезіндегі
негізгі көрсеткіштерді зерттеу...................................................................
Велямов М.Т., Амангелды А.А., Амирбаева М.М. Картопты,
орамжапырақты, сəбізді сақтау кезінде микроорганизмдердің түрлерін
анықтау...
6
8
14
16
20
24
28
31
32
34
37
40
43
46
49
52
Damdinsuren L., Selenge Ts., Tsend-Ayush D.Meat value chain nalysis, renewal strategyin
Mongolia....................................................................................................
Дэлгэрмаа С., Цэрэндулам Ц. Биоцидное действие экстрактов растений на различные виды
микроорганизмов
Заядан Б.К., Кирбаева Д.К., Садвакасова А.К., Болатхан К. Содержание биологически активных
веществ смешанных культур микроводорослей при совместном культивировании…………………………..
Зорина А.А., Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Лось Д.А. Функциональная геномика и
фосфопротеомика стрессовых ответов у цианобактерий………………………………………………………..
Игнатова Л.В., Бражникова Е.В., Мукашева Т.Д., Цзю В.Л., Бержанова Р.Ж., Сыдыкбекова Р.К.,
Шукешева С.Е. Скрининг активных нефтедеструкторов среди дрожжеподобных грибов рода
Aureobasidium...................................................................................................................................................
Калиева А.К., Блиева Р.К. Рenicillium cyclopium 2-11 штамынан алынған пектинлиаза ферменттерінің
физика-химиялық қасиеттерін зерттеу жəне синтетикалық жуғыш заттарда іс жүзінде
қолдану.............................................................................................................................................................
Канаев А.Т., Мырзаханова И.А. Новые методы обеззараживания и оценка состояния воды водовода
«астрахань – мангышлак»…………………………………………………………………………………………
Кирбаева Д.К., Заядан Б.К., Уразбекова Г.Е., Темирбаев С.А. Əртүрлі концентрациялы цинк
сульфатының spirulina platensis-тің өнімділігіне əсері…………………………………………………….......
Е.В. Куприянова, Н.А. Пронина Со2-концентрирующий механизм алкалофильных цианобактерий из
содовых озер………………………………………………………………………………………………………...
Мукашева Т.Д., Бержанова Р.Ж., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Даутова Д.,
Сартаева А.А. Стабилизация популяции и селекция микроорганизмов - деструкторов полициклических
ароматических углеводородов………………………………………………………………………......................
Бержанова Р.Ж., Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Искакова Ж.К.,
Дуйсембинова Д., Алашбаева А., Сартаева А.А. Сообщества актиномицетов рода Streptomyces в
подзональных подтипах почв равнинной территории Казахстана......................................................................
Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Бержанова Р.Ж., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Даутова Д.,
Алашбаева А., Сартаева А.А. Разработка регламента получения многокомпонентных композиций из
микроорганизмов-деструкторов
и
оценка
возможности
их
использования
для
биоремедиации……………….
Өнерхан Г., Заядан Б.К.2, Билал С. Зеренді көлінен алынған су үлгілеріне chlorella sp-3k штамын өсіру
арқылы биотест жүргізген нəтижелер
Ратникова И.А., Н.Н. Гаврилова Н.Н., Л.П. Треножникова, К. Баякышова, А.Х. Хасенова.
Устойчивость к желчи молочнокислых, пропионовокислых бактерий и их ассоциаций, адаптированных к
низкому значению рН………………………………………………………………………………………………
Сагындыков У.З., Мамырбекова Ж., Макажанова Х.Х., Губарева С.С. Түйе сүті негізіндегі құрғақ
биологиялық белсенді қоспаның сапалық мінездемесі.......................................................................................
Сагындыков У.З., Кожахметова З.А., Мустафаева М.Ж. Влияние фитонцидов борщевика сосновского
на микрофлору смешанных силосов……………………………………………………………………………....
С.Сагындыкова, Б. Мухамбетов, А. Нурлыбеков, С.А. Надирова ,У.З. Сагындыков, Бержанова Р.Ж.
Биологическая рекультивация нефтезагрязненных почв.....................................................................................
Савицкая И.С.Популяционный уровень кишечных пробиотических бактерий и фекальные мутагены.......
Савицкая И.С., Тарасов В.А., Кистаубаева А.С., Воронова Н.В. Батарея бактериальных тест-систем для
генетической токсикологии………………………………………………………………..............................
Савицкая И.С., Кистаубаева А.С., Нигметова К., Воронова Н.В.Исследование антагонистической
активности и жизнеспособности клеток лактобацилл, иммобилизованных на карбонизованном сорбенте...
Савицкая И.С., Кистаубаева А.С., Абдулжанова М., Жумагалиева Ж. Принципы отбора штаммов для
нового лактосодержащего пробиотика…………………………………………………………………………..
Сыдыкбекова Р.К., Каргаева М.Т., Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Бержанова Р.Ж., Игнатова Л.В.,
Бражникова Е.В. Распределение грамположительных бактерий в целинных почвах равнинной территории
Казахстана……………………………………………………………………………………………..
Шемшура О.Н. Определение хитинолитической активности у грибов антагонистов………………………..
Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Мазунина М.Н. Исследование нематостатической активности
белковых фракций гриба Аspergillus sp…………………………………………….............................................
Чуркина
Г.Н.
Микробиологическая
активность
южных
черноземов
в
плодосменных
севооборотах………...
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Абай Г.Қ., Ерназарова А.К., Кайырманова Г.К. Ластанған ағын суларда кездесетін цианобактерияларды
зерттеу..........................................................................................................................
Авксентьева О.А., Жмурко В.В. Генетический контроль путей морфогенеза in vitro изогенных по генам
PPD линий озимой пшеницы Triticum aestivum l……………………………….......................................
2
53
57
59
62
64
66
70
73
76
78
81
85
91
94
97
99
100
102
107
110
114
119
123
125
128
130
133
Алмаганбетов Ж.С., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У., Оразова С.Б. Көк-жасыл микробалдырлардың
мутуалистік типті дикультураларын айқындау..................................................................
Alikulov Z., Myrzabaeva M., Utupov T., Babenko O. Xenobiotic transforming activity of animal
molybdoenzymes…………………………………………………………………………………………………….
Алыбаева Р.А., Билялова Г.Ж., Кожахметова А.Н. Оценка устойчивости генотипов пшеницы к свинцу
и цинку для создания экологически чистой технологии ее возделывания.........................................
Аимбетов Р.С., Бисенбаев А.К., Сарбасов Д.Д. GLY-934 обеспечивает взаимодействие риктора с SIN1…
Асрандина С.Ш., Кенжебаева С.С., Атабаева С.Д. Құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық
регуляторлардың бидайдың тұзды ортаға төзімділік қасиетіне тигізетін əсері..................................................
Атабаева С.Д., Кенжебаева С.С. Трансгенные растения для фиторемедиации................................................
Басыгараев Ж.М., Ибрагимова С.А., Ережепов Ə.Е. Тулегенова Ж.Б., Абылайханов Е.Т. Цитокинин
медиаторының физиологиялық белсенділігінін биотест көмегімен зерттеу.....................................................
Берсимбай Р.И. Роль геномных исследований в изучении предрасположенности к бронхиальной астме и
хронической обструктивной болезни легких......................................................................................................
Бишимбаева Н.К., Ережепов А.Е., Шилманова А.А., Нахимова А., Сартбаева И.А. Бидайдың
сомаклонды варианттарының тұзға төзімділігін зерттеу......................................................................................
Гончарова А.В., Карпенюк Т.А., Цуркан Я.С. Углеводородокисляющие микроорганизмы активного ила
как сорбенты тяжелых металлов.......................................................................................................................
Джолдыбаева Б.C., Алтыбаева Н.А., Бисенбаев А.К. Изучение действия экзогенной Н2О2 на
жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы…………………………………………………
Джусупова Д.Б.. Внедрение курса «Экологическая биотехнология» для подготовки в вузах специалистов
экологов...................................................................................................................................
Davletova K. Sh., Yerezhepov A.Y. Biotechnology: achievements and consequences………………………......
Жакешбаева Р.Б., Альмурзаева С.И. Мұнаймен ластанған топырақтың ауылшаруашылығында маңызды
өсімдіктерге əсерін анықтау..............................................................................................................................
Жұмабаева Б.Ə., Тұрашева С.Қ., Абдықалықова Ұ.О. «Казахстанская-10» бидай сортының
сомаклондарының селекциялық белгілерін анықтау...........................................................................................
Жусипова Д.А., Абдиева Г.Ж., Жакипбекова А.С., Тансикбаева Г.С. Лактобактериялардың белсенді
штамдары негізінде сүтқышқылды сусын алу....................................................................................................
Заядан Б.К., Отаров А.О., Баймаханова Г.Б., Ораз Г., Кумар М. Изучение альгофлоры рисовых полей
шиелийского района кызылординский
области и выделение бактериологически чистых культур
микроводорослей и цианобактерий....................................................................................................................
Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Оразова С.Б., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У. Поиск
микроводорослей и микроорганизмов, синтезирующих арахидоновую кислоту и ее производные..............
Кенжебаева С.С., Асрандина С.Ш., Доқтырбай Г. Жаздық бидайдың мутантты формаларына
құрғақшылықтың əсері......................................................................................................................................
Кебекбаева К.М., Джобулаева А.К.,
Треножникова Л.П., Хасенова А. Жизнеспособность и
биологическая активность актиномицетов сине-фиолетовой группы после длительного хранения
Кебекбаева К.М. Длительное хранение культур микроорганизмов в коллекции.
Кожалакова А.А., Жубанова А.А. Эффективность использования абсорбента нефти на основе торфяного
сфагнового мха..................................................................................................................................................
Курманбаев А.А., Файзулина Э.Р., Ауэзова О.Н., Байгонусова Ж.А., Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж.
Биоремедиация нефтезагрязненной почвы испытательного полигона тоо «жылыой-болашак» ассоциациями
нефтеокисляющих микроорганизмов......................................................................................
Қазыкен Д. Гель хроматографиясымен mtor комплекстерін бөліп алу..............................................................
Қосманбетова Н.Б., Донбаева М.Н., Баубекова А.С., Мелдебекова А.А., Конуспаева Г.С. Lactococcus
acidophilus жəне lactococcus plantarum сүтқышқылды бактерияларымен ұйытылған түйе сүтінің физикахимиялық қасиеттерінің өзгеруі.........................................................................................................................
Мусалдинов Т.Б. Влияние биопрепарата «альгин» на посевные качества семян и повышение устойчивости
к корневой гнили сахарной свеклы
Мухамбетжанов С.К., Ережепов А.Е., Кударов Б.Р. 2, Ережепов Д.А. Выращивание кормового злака
brachiaria spp. в условиях in vitro
Нуржанова А.А., Жунусова Ж.С., Кашкеев К., Ермекова М.Ш. Фиторемедиационный потенциал
дикорастущих видов растений..........................................................................................................................
Савицкая И.С., Жубанова А.А., Кистаубаева А.С., Болекбаева А.Б. Антибиотикорезистентность
лактобацилл – пробиотиков................................................................................................................................
Савицкая И.С., Кистубаева А.С., Абдулжанова М., Жумагалиева Ж. Принципы отбора штаммов для
нового лактосодержащего пробиотика
3
137
140
142
145
150
153
158
160
163
167
172
176
178
181
183
186
190
194
198
201
203
205
207
209
211
214
216
218
222
227
Сайдсұлтанова Ж.С., Галиева Л.Д., Тезекбаева Б.К., Шарафутдинова Д.А., Малахова Н.П. Бидайдың
клеткалық культураларындағы супероксиддизмутаза (СОД) ферментінің белсенділік деңгейіне қолайсыз
жағдайлардың əсері........................................................................................................................
Табыс Д., Бейсембаева Р.У., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В. Топырақ микроорганизмдерін арахидон
қышқылының көзі ретінде зерттеу........................................................................................................................
Тайпакова С.М., Жанаева А.Б., Бисенбаев А.К. Клонирование и экспрессия КДНК эндо-β-1,4-глюканазы
гриба Aspergillus niger в E. coli и характеристика рекомбинантного белка.................................
Треножникова Л.П., Айткельдиева С.А., Хасенова А.Х., Шакиев С.Ш., Ултанбекова Г.Д.,
Саданов А.К. Перспективы исследования экстремофильных микроорганизмов в Казахстане......................
Ұлтанбекова Г.Д., Саданов А.Қ., Гаврилова Н.Н., Шорабаев Е.Ж., Усикбаева М.А. Жоғары өнімді
азотсіңіретін кең спектрлі бейімделгіш симбиозды өсімдік-микробты жүйені таңдап алу технологиясы.....
Шығаева М.Х., Сағындықова С.З., Дүйсекенова А.Б. «Софмайя» шұбат сусынын дайындаудың ғылыми
негізі..............................................................................................................................................................
Шығаева М.Х., Сағындықова С.З., Дүйсекенова А.Б. Изучение микроорганизмов фарша из осетровых
рыб.....................................................................................................................................................................
НАНОТЕХНОЛОГИЯ
Gilmanov M. K., Gilmanova S.M., Tutkyshbaev S.O., Kaster, Begzat A.N. The new nanocapsules for
succesful therapy of spinal tuberculosis ...................................................................................................................
Жандосов Ж.М., Керимкулова А.Р., Бийсенбаев М.А., Мансуров З.А., Жубанова А.А. Возможность
использования углеродного материала на основе абрикосовых косточек в процессе гемоперфузии...........
Жандосов Ж.М. Синтез углеродных материалов из скорлупы грецких орехов путем карбнизации в
присутствии фосфорной кислоты .........................................................................................................................
Зарубина А.П., Лукашев Е.П., Деев Л.И., Пархоменко И.М., Рубин А.Б., Шойынбекова С.А.,
Жылқыбаев О.Т.2, Кұрманкұлов Н.Б.. Люминесцентті бактериялардың тест-жүйелерін пайдаланып
бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің биологиялық эффекттерін биотестілеу...........
Заядан Б.К., Маторин Д.Н., Болатхан К., Садвакасова А.К., Усербаева А.А., Балтабекова А.Ж.
Влияние наночастиц серебра и золота на параметры флуоресценции хлорофилла мутантов зеленой
микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang ……………………………………………………………..
Каиров У.Е., Зиновьев А.Ю., Карпенюк Т.А., Раманкулов Е.М. ДНК-микрочипы: от основ технологии
к анализу данных
Керимкулова А.Р., Султанова Н.А., Гильманов М.К., Мансуров З.А., Абилов Ж.А., Жусупова Г.Е.,
Бурашева Г.Ш., Жандосов Ж.М., Ескалиева Б.К. Применение наноструктурированных углеродных
адсорбентов для выделения биомолекул и лекарственных растительных субстанций ….........
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
Алдибекова К.Н. Электромагниттік өрісті геоаномальды бөлімдердің техногендік ерекшеліктерін
зерттеу......................................................................................................................................................................
Атабаева С.Д., Кенжебаева С.С. Трансгенные растения для фиторемедиации...........................................
Атамбаева Ш.А. Свойства онкогенов рака молочной железы ........................................................................
Бари А.А., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Характеристики связывания miR414 с mRNA генов хромосомы
4 Arabidopsis thaliana .......................................................................................................................
Берилло О.А., Исабекова А.С., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Характеристики связывания межгенных,
интронных и экзонных miRNA с mRNA генов, кодирующих интронные miRNA ....................
Богуспаев К.К., Фалеев Д.Г., Перова И.А., Ережепов Д.А. Влияние биогумуса на поглощение
тяжелых металлов (Cd, Zn) гиперакумулятором тяжелых металлов Helianthus annuus L ...................
Богуспаев К.К., Касымбеков Б.К., Фалеев Д.Г., Оразова С.Б., Ишангалиева С.С., Перова И.А.
Влияние эндомикоризы на некоторые биохимические показатели растений Avena sativa L. И Phaseolus
vulgaris L. при почвенном загрязнении тяжелыми металлами в условях лабораторного эксперимента ......
Исабекова А.С., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Связывание межгенных microRNA человека с сайтами
mRNA генов, участвующих в развитии рака толстой кишки ..............................................................
Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У., Оразова С.Б.
Поиск микроводорослей и микроорганизмов, синтезирующих арахидоновую кислоту и ее производные
Колумбаева С.Ж., Бегимбетова Д.А., Ловинская А.В., Калимагамбетов А.М. Содержание первичных и
вторичных продуктов перекисного окисления липидов в печени лабораторных крыс при воздействии
фипронила и фипронил-сульфона ..................................................................................................
Нурмаханова А.С., Атабаева С.Ж., Айдосова C.С., Махашова А., Қалдыбекқызы Г.,
Кенжебаева С.С., Асрандина С.Ш., Чунетова Ж.Ж.Тұздану жəне мыс иондарының əртүрлі
бидай сорттарының өсуіне əсері ..........................................................................................................................
Оразова С.Б., Джокебаева С.А., Актамбаева А., Джумабаева Л., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В.
Балдырлардың моно- жəне аралас дақылдарындағы липидтердің жинақталуы .............................................
Романова С.М. Значение гидрохимических и гидробиологических показателей для исследования качества
4
232
235
239
244
247
248
251
253
256
259
262
267
270
274
278
280
285
288
292
300
304
307
312
316
319
323
327
природных вод Казахстана ....................................................................................................................
К.Р. Утеулин, С.К. Мухамбетжанов, Г. Бари, А. Искакова Влияние комплексной обработки семян
композицией хелатированных микроэлементов, стимуляторов роста и пленкообоазующих веществ на
адаптацию растений кукурузы к солевому стрессу ...........................................................................................
К.Р. Утеулин, А. Отаров, А. Искаков, С.К. Мухамбетжанов, Г. Бари Влияние обработки
карбосиметилцеллюлозой и поливиниловым спиртом в качестве пленкооброзователей на прорастание и
всхожесть семян риса ............................................................................................................................................
Т.Л. Тажибаева Действие низкотемпературного стресса на изопероксидазы пшеницы, различающиеся по
изоэлектрическим точкам ................................................................................................................................
О.М. Цивилева, И.М. Учаевa, А.Н. Панкратов, Ю.Д. Маркович, В.Е. Никитина Акридон-n-уксусная
кислота в искусственной культуре базидиомицета: первоначальное исследование на примере Lentinula
edodes ......................................................................................................................................................
ИННОВАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
А.И.Абугалиева, К.К.Кожахметов, Т.В. Савин Оценка и маркирование диких сородичей пшеницы и их
гибридов с коммерческими сортами по содержанию Fe, Zn и составу глютенина ……………………...
П.Г.Алексюк Изучение способности сапонинов, полученных из корня растения Allochrusa Gypsophiloides
формировать iscomatrix …………………………………………………………………………
Д.Ж.Асаубаева, Н.Б. Ахматуллина, О.Г.Чередниченко Индукция эффекта свидетеля в лимфоцитах
человека при воздействии ионизирующей радиации ………………………………………………………….
DA Bekbolsynov, VB Ogay, EK Raimagambetov and AE Mukhambetova Mesenchymal stem cell in
hyaluronic acid scaffold as a therapeutic tool for osteoarthritis – preliminary report ……………………………
З.Б. Есимсиитова, У.С.Шапенова Морфологическое исследование почек крыс в эксперименте
С.А.Ибрагимова, Н.Г. Ригер, Е.Ю. Гуккенгеймер, Д.П. Сафонов, Ш.М. Нурмолдин, А. С. Есиббаева
Изучение свойств нового
биосенсора для экологического мониторинга раннего антропогенного
загрязнения природных водоемов ………………………………………………………….
Т.Р. Рыспеков Cовременная постагрогенная сукцессия на различных ландшафтах как экологический
объект изучения природы ………………………………………………………………………………………..
И.А. Солдатова, М.С. Абитаева, Э.С. Омиртаева, А.П. Богоявленский
Изучение иммуностимулирующей и профилактической активности растительного препарата S.O. …
А.С. Турмагамбетова, П.Г. Алексюк, И.А. Зайцева, А.П. Богоявленский, В.Э. Березин Изучение
антивирусной активности растений Dianthus caryophyllus и Stellaria media .
Ремеле В.В. Микологический мониторинг зерна основных культур Казахстана
Пономарева Е.Г., Шелудько А.В., Никитина В.Е. Сравнительная характеристика лектинов бактерий рода
azospirillum
Райымбекова Л.Т., Кузнецова Т.В., Олейникова Е.А. “Қайсар сүт” жəне “Ақбұлақ ” мал кешендерінің
сүтінің қауіпсіздігі мен микробиологиялық көрсеткіші жəне сүт қышқылы бактерияларын бөліп алу".
А.П. Науанова, А.С. Кошаева, А.Ж. Назарова Влияние различных технологий обработки почвы в
зернопаровом севообороте на распространение целлюлозоразрушающих микроорганизмов в почве
Г.Мунхцацрал, О.Энхтуяа, С.Дэлгэрмаа Некоторые результаты исследования антибактериального
действия лишайника вида Xanthoparmelia Camtschadalis (Ach.) Hale, собранного на территории Монголии
5
331
33
33
340
34
351
353
35
3
36
36
36
371
37
37
38
382
385
ПЛЕНАРНЫЕ ДОКЛАДЫ
М.Г. Саубенова
ДОСТИЖЕНИЯ ИНСТИТУТА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ КН МОН РК
Институт микробиологии и вирусологии (ИМВ) АН КазССР был образован на базе Сектора
микробиологии Института ботаники АН КазССР постановлением Президиума Академии Наук КазССР
№ 13 от 30.01.1956 г.
Основой для возникновения Института микробиологии и вирусологии была возглавляемая членкорреспондентом АН КазССР, профессором Д.Л. Шамисом лаборатория технической микробиологии,
которая успешно занималась насущными проблемами промышленности Казахстана в области
виноделия, хлебопечения, кормопроизводства, молочной промышленности. Результаты исследований
находили широкое практическое применение.
Одной из основных проблем второй половины ХХ века была недостаточность кормовой базы
животноводства. К чести нашего Института, именно в нем были заложены научные основы
силосования растительного сырья; выделены, изучены и внедрены в практику кормопроизводства
бактерии, используемые в качестве заквасок при ферментации и консервировании как легко-, так и
трудносилосующихся растений. Предприятия по производству заквасок функционировали в различных
областях Советского Союза. И неслучайно, что «Казбиосил» - специализированные
концентрированные закваски, содержащие высокоэффективные штаммы молочнокислых бактерий,
предназначенные для силосования широкого набора кормовых растений, получили в настоящее время
дальнейшее развитие и, соответственно, столь высокую оценку. В плане продолжения исследований в
данном направлении была разработана и в последующем широко внедрена технология твердофазной
ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства, в том числе неутилизируемых отходов
– рисовой соломы, шелухи зерновых и лузги подсолнечника, с получением корма с высокими
показателями поедаемости, перевариваемости, питательности. Решения этой задачи добивались многие
научные коллективы Советского Союза, однако столь малозатратная, простая и эффективная
технология была разработана только в нашем институте. То же самое можно сказать и о способе
протеинизации малоценных кормов путем выращивания кормовых дрожжей на дрожжерастильных
установках, также успешно внедряемых в различных областях СССР, в том числе на Беланском
маисовом комбинате (г. Владикавказ).
Одним из наиболее актуальных вопросов, решаемых в лаборатории физиологии микроорганизмов
(ранее лаборатории технической микробиологии), был вопрос, стоящий перед молочной
промышленностью Казахстана. Следует отметить, что Майя Хажетдиновна Шигаева в течение многих
лет являлась научным консультантом лаборатории. Именно под ее руководством и при
непосредственном участии были развиты исследования микрофлоры казахских национальных
напитков, и разрабатывалась проблема повышения сроков их хранения.
Являясь заместителем директора по науке ИМВ АН КазССР, М.Х. Шигаева в той или иной
степени влияла на научные исследования, проводимые в других лабораториях института. Перейдя же
на должность заведующего кафедрой микробиологии КазГУ им. С.М. Кирова в 1971 году, Майя
Хажетдиновна не только не утратила научных связей с ИМВ, но и способствовала обеспечению его
квалифицированными кадрами, успешно трудящимися все последующие годы на благо
микробиологии и вирусологии.
В настоящее время РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК на праве
хозяйственного ведения (ИМВ на ПХВ) является ведущей научной организацией в Республике
Казахстан, разрабатывающей фундаментальные и прикладные проблемы в области микробиологии и
вирусологии, направленные на укрепление научно-технического потенциала Республики и развитие
социально-экономической сферы.
Основным предметом деятельности Института является проведение научных исследований в
области микробиологии и вирусологии, разработка микробных и вирусных препаратов для защиты
окружающей среды, сельского хозяйства, медицины, пищевой и других отраслей промышленности, а
также подготовка научных кадров в области микробиологии и вирусологии.
Основными направлениями научной деятельности Института являются:
 разработка
технологий
биоремедиации
окружающей
среды
с
использованием
микроорганизмов, а также изучение механизмов трансформации металлов;
 разработка технологий и бактериальных препаратов для микробиологической очистки
водоемов, почвы и промышленных стоков от нефтяных загрязнений;
6
 разработка фундаментальных основ совершенствования диагностических критериев
фитопатогенов и средств защиты растений от заболеваний сельскохозяйственных культур;
 создание препаратов пробиотиков, а также столовых молочнокислых напитков, для
профилактики и лечения кишечных инфекций и дисбактериозов у людей и сельскохозяйственных
животных;
 поиск и изучение новых антибиотиков, повышение активности продуцентов известных
антибиотиков;
 изучение проблем длительного сохранения промышленно ценных штаммов микроорганизмов,
повышение активности продуцентов биологически активных веществ, сохранение и пополнение
коллекционного фонда микроорганизмов;
 изучение механизмов циркуляции вируса гриппа на территории Республики Казахстан,
выделение штаммов вируса гриппа от человека, животных и птиц,
их биохимический,
иммунохимический, молекулярный и филогенетический анализ;
 выделение штаммов парамиксовирусов птиц, имеющих большое практическое значение для
сельского хозяйства Казахстана, их биохимический, иммунохимический, молекулярный и
филогенетический анализ;
 совершенствование методов иммунодиагностики и молекулярной диагностики орто- и
парамиксовирусов, разработка усовершенствованных тест-систем для упрощенной экспрессдиагностики вирусных инфекций;
 разработка вакцинных препаратов нового поколения на основе очищенных вирусных белков,
поиск и изучение новых иммуностимуляторов для повышения эффективности вакцинных препаратов;
 разработка новых лечебных и профилактических антивирусных препаратов растительного и
микробного происхождения для лечения и профилактики вирусных инфекций;
 изучение механизмов патогенного действия вируса гриппа и его структурных компонентов на
клеточные структуры и органы.
РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК являлся головной
организацией
основного научного направления «Биологические основы промышленной
микробиологии и биотехнологии» программы фундаментальных исследований «Закономерности
функционирования биологических систем – основа создания инновационных технологий для
медицины, сельского хозяйства и охраны окружающей среды» на 2009-2011 гг. В настоящее время в
институте выполняются научные исследования по 20 – ти проектам грантового финансирования, 6-ти
проектам Республиканских научно-технических программ на 2012-2014 гг.
Институт микробиологии и вирусологии разработал и рекомендовал производству ряд новых
технологических решений.
В области экологии
 «Бакойл KZ» – высокоэффективный бактериальный препарат для микробиологической очистки
водоемов, почвы и промышленных стоков от нефтяных загрязнений. Основой препарата являются
активные штаммы нефтеокисляющих бактерий. Результаты полевых испытаний препарата показали
снижение содержания нефти в нефтезагрязненной почве на 77-86 %.
В области сельского хозяйства
 «Ризовит – АКС» – высокоэфективный препарат, созданный на основе штаммов клубеньковых
бактерий. Действие препарата основано на способности клубеньковых бактерий фиксировать
атмосферный азот. Препарат повышает урожай, качество готовой продукции и плодородие почвы,
позволяет получать экологически чистый продукт, снижает заболеваемость растений. Рынок сбыта
налажен.
 «Казбиосил»
- специализированные концентрированные закваски, содержащие
высокоэффективные штаммы молочнокислых бактерий, продуцентов молочной, уксусной кислот.
Биоконсерванты предназначены для силосования широкого набора кормовых растений.
 «Кальдарин» - препарат на основе целлюлолитических бактерий для получения корма с
повышенными показателями поедаемости, переваримости и питательности путем твердофазной
ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства, в том числе неутилизируемых.
 Кормовая добавка «Бентобак» – пробиотик физиологического назначения, способствует
лучшему усвоению грубых кормов, снижению риска ацидоза у животных. Препарат приводит к
приросту живой массы сельскохозяйственных животных на 30%, уменьшению затрат корма на 5%.
Препарат представляет собой ассоциацию пропионовокислых и целлюлозолитических бактерий.
В области защиты растений
7
 Триходермин – грибной препарат для борьбы с корневыми гнилями картофеля, сахарной
свеклы и других овощных культур.
В области ветеринарии
 Лактовит – лечебно-профилактический препарат на основе молочнокислых и
пропионовокислых бактерий для профилактики колибактериоза и сальмонеллеза молодняка
сельскохозяйственных животных и птиц.
В области здравоохранения
 Розеофунгин – широкоспектральный противогрибковый полиеновый антибиотик для лечения
глубоких и поверхностных микозов. Спектр действия данного антибиотика значительно шире
известных противогрибковых препаратов.
 Плантафермин – лечебно-профилактический препарат на основе молочнокислых и
бифидобактерий. Предназначен для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии,
воспалительных и инфекционных заболеваний желудочно-кишечного и урогенитального трактов.
 Полилактобак – пробиотик, составленный из ассоциации молочнокислых и пропионовокислых
бактерий. Испытан для лечения больных доброкачественной гипертензией предстательной железы 1 и
2 степени, осложненной после катеризации воспалением нижних мочевых путей. Применение
препарата повышает эффективность стандартного антибактериального лечения в 2,5 –3,7 раза.
 Ферментированный свекольный сок – продукт для диетического и лечебного питания.
Обладает положительной терапевтической эффективностью при лечении хронических заболеваний:
гастрита, энтероколита, гепатита, холецистита. Может быть использован в комплексной терапии при
желудочно-кишечных, сердечно-сосудистых и злокачественных заболеваниях, а также при диабете,
атеросклерозе.
В соответствии в Указом Президента Республики Казахстан от 17 ноября 2011 года №176 работе
«Технология создания и организация производства биопрепаратов «Казбиосил», «Ризовит-АКС»,
«Бакойл-KZ» для сельского хозяйства и охраны окружающей среды», представленной Институтом
микробиологии и вирусологии, авторами которой являются Саданов Аманкелди Курбанович,
Айткельдиева Светлана Айткельдиновна, Гаврилова Нина Николаевна, Ратникова Ирина
Александровна и другие, присуждена Государственная премия в области науки и техники. Эти
препараты широко внедряются в Республике Казахстан.
Таким образом, Майя Хажетдиновна как человек, отдавший много сил как в области научных
изысканий, так и в подготовке кадров высокой квалификации для Института микробиологии и
вирусологии, внесла достойный вклад в его процветание.
З. А. Мансуров
НАНОТЕХНОЛОГИИ: 20 ЛЕТНЯЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ
Рассмотрены основные направления и разработки в области нанотехнологий в Институте проблем горения.
Значимость и перспективность полученных результатов определяется их признанием и внедрением на предприятиях
Республики Казахстан. Представлены инновационные разработки в области наноматериалов различного функционального
назначения на основе исследований карбонизации отходов растительного сырья, проведенных в Институте проблем
горения за последние 20 лет в области сельского хозяйства и медицины.
Шигаева Майя Хажетдиновна – известный в Казахстане и странах дальнего и ближнего
зарубежья ученый в области микробиологии. В 1949 г. окончила лечебный факультет Казахского
государственного медицинского института им. В.М. Молотова. Трудовая деятельность академика
Шигаевой М.Х. в Казахском национальном университете аль-Фараби началась в 1972 г. заведующим
кафедрой, деканом биологического факультета. Свой юбилей Майя Хажетдиновна встречает в
расцвете своей славы, в кругу близких родных, коллег, учеников, которым она дала путевку в жизнь,
открыв двери в увлекательный мир Науки! Академик Шигаева М.Х. – человек удивительной научной
судьбы, ее научные интересы находятся на стыке биологии и медицины, а в последнее время
нанобиотехнологии, неудивительно, что тематика конференции, посвященная юбиляру, включает и
секции нанотехнологии.
Ниже представлены последние инновационные разработки ИПГ в области биологии, сельского
хозяйства и медицины.
Разработаны наноструктурированные материалы, имеющие практическое значение в качестве
сорбентов для:
 селективного выделения биостимулятора фузикокцина;
8
 очистки крови (в частности, от липидо-полисахаридов);
 детоксикации организма энтеросорбцией.
20 лет назад при изучении образования каталитического углерода на хромитовом шламе были
получены углеродные нанотрубки рис. 1. Наблюдается образование нескольких УНТ из одного
источника – явление октопус [1].
Рисунок 1. Электронные микрофотография углеродных нанотрубок полученных при изучении
образования каталитического углерода на хромитовом шламе
Одним из приоритетных направлений является создание нанокомпозиционных систем. Большое
внимание уделяется синтезу углеродных наноматериалов различного назначения, в частности,
высокоэффективных и доступных углерод-содержащих сорбентов, которые могут быть использованы
для очистки промышленных выбросов от сероводорода, оксидов серы и азота, а также стоков от
загрязнений фенолами и другими органическими соединениями. Перспективным сырьем при
получении таких углеродных композиционных систем является ежегодно возобновляемые отходы
сельхоз продукции (виноградные, абрикосовые косточки, рисовая шелуха) с широким спектром их
применения.
Полученные наноструктурированные материалы используются в качестве сорбентов для очистки
промышленных сточных вод и питьевой воды от ионов тяжелых металлов и органических примесей,
для извлечения благородных металлов, в качестве катализаторов гидроочистки и гидрообессеривания
для облагораживания бензинов, для получения олефинов и ароматических соединений из бытового
газа и газовых промышленных выбросов. Синтезированные углеродные наносорбенты были испытаны
для очистки и выделения физиологически активного вещества цитокинина из сложной смеси. Изучено
действие их в качестве медиаторов на повышение стрессоустойчивости важнейших злаковых культур
Казахстана ин всхожесть семян пшеницы в условия засоления почвы.
Разработка нового материала для детоксикации крови и организма (ИНГО-1 и ИНГО-2) [13].
Задачей технического решения является разработка способа получения из растительного сырья
мезопористого углеродного сорбента, применяемого в качестве гемосорбента, отвечающего
следующим требованиям: высокая степень химической чистоты; высокая сорбционная емкость по
отношению к удаляемым веществам; инертность по отношению к форменным элементам крови;
отсутствие пылеобразования (выделения ультрадисперсных частиц).
Нами разработано изделие ИНГО-1 – стерильная, однократного применения колонка с
сорбентом для очистки крови от токсинов. Новизна состоит как в конструкции колонки, так и в
свойствах сорбента. Основные преимущества нашей колонки:
- колонка выполнена по технологии предотвращающей пылеобразование в процессе сорбции;
- колонка снабжена встроенным фильтром для предотвращения попадания в кровь дисперсных частиц;
- колонка обеспечивает штатное подключение к большинству аппаратов для гемодиализа и
гемосорбции.
На рис. 2 представлен общий вид гемосорбента блочного типа изготовленного из
карбонизированной рисовой шелухи.
Геометрия макроструктуры гемосорбента оптимизирована для снижения повреждения
форменных элементов крови.
На рис. 3 представлена схема гемосорбента в картридже для использования очистки крови. В
настоящее время закончены положительные предклинические исследования на собаках.
9
Рисунок 2. Общий вид блочного
гемосорбента
Рисунок 3. Гемосорбент в картридже
На рисунке 4 представлена адсорбция ЛПС карбонизованной рисовой шелухой.
Рисунок 4. Адсорбция ЛПС карбонизованной рисовой шелухи
Применение энтеросорбентов ИНГО-2 в качестве сорбционной терапии может обеспечить
решение комплексной задачи – детоксикации желудочно-кишечного тракта и нормализации кишечной
микроэкологии. Благодаря наличию развитой пористой структуры энтеросорбент на основе
карбонизованной рисовой шелухи ИНГО-2 имеет высокую удельную поверхность и способен
адсорбировать различные органические и неорганические вещества, в том числе микробный
липополисахарид, что обеспечивает возникновение качественно новых сорбционных свойств, а именно
позволяет препарату сорбировать высокомолекулярные и средне молекулярные соединения, к
которым, в частности, относятся энтеротоксины микробного происхождения.
Проведенное электронно-микроскопические исследование показало, что между микробными
клетками и карбонизированным материалом регистрируется сорбционное взаимодействие (рис. 5).
Рисунок 5. Сорбция клеток L. fermentum на поверхности ИНГО-2
Видно, что клетки на поверхности ИНГО-2 расположены в основном в виде микроколоний. Этот
факт может иметь существенное значение, поскольку межбактериальное агрегирование, происходящее
в микроколониях – начальный этап образования биопленок, в которых бактерии значительно лучше
защищены от неблагоприятных воздействий [4-6].
Полученный энтеросорбент ИНГО-2 обладает высокой сорбционной способностью, а также
наличием в его макромолекулах различных функциональных групп. Это позволяет связывать и
выводить энтеральным путем бактериальные клетки и продукты их жизнедеятельности, эндогенные и
экзогенные токсины, проникающие в желудочно-кишечный тракт. Энтеросорбент ИНГО-2
восстанавливает биоценоз кишечника, снижает концентрацию токсинов в крови, плазме и
10
асцитической жидкости, другие биохимические показатели, нарушенные при экзо- и эндотоксинемии.
В таблице 1 приведены данные по влиянию искусственной желудочной среди на биотитр препарата.
Таблица 1. Влияние искусственной желудочной среды на биотитер препарата
Вид препарата
Колонии,
образующие Кратность падения титра
единицы
До процесса
Жидкий концентрат
3,7 х 109
лактобактерий
Лактобактерии
на 1,6  108
активированном углероде
Лактобактерии
на 1,1  108
карбонизованной
рисовой
шелухе
После
процесса
5,2 х 105
7100
1,1  106
145
3,23  106
34
Из таблицы 1 следует, что лактобактерии, адсорбированные на карбонизованной рисовой
шелухой в пять раз больше удерживаются в среде желудка, чем в случае использовании традиционного
углеродного сорбента.
В целом, эта разработка имеет огромное социальное значение – выпуск новой наукоемкой
продукции для внутреннего потребления и на экспорт, основанной на новейших научных разработках;
улучшение здоровья нации; экономическая безопасность – независимость от внешнего рынка
фармацевтической продукции; создание новых рабочих мест (порядка 300 чел); наполнение рынка
отечественными товарами высокого качества казахстанского содержания; развитие высоких
технологий путем формирования совместных кластеров науки и производства; сохранение и развитие
кадрового потенциала науки.
Нанопористый углеродный сорбент для молекулярно-ситовой хроматографии белковолипидного комплекса
Большая часть фармацевтических препаратов и биомолекул чувствительна к повышенным
температурам, поэтому в фармацевтических производствах широко используют хроматографию с
применением разных видов сорбентов [7]. Однако совершенствование хроматографических сорбентов
становится невозможным без применения идей и методов нанотехнологий. В этом плане большой
интерес представляют собой наноструктурированные, нанопористые сорбенты, имеющие лучшие
характеристики, чем стандартные сорбенты (например, сефарозы и сорбенты для гидрофобной
хроматографии – октил – и фенилагарозные гели) [8-10]. На мировом рынке практически не имеется
сорбентов пригодных для очистки биомолекул в производственных масштабах. Существующие
сорбенты крайне дороги, их стоимость колеблется от нескольких сот до нескольких тысяч долларов и
предназначены они в основном для аналитических целей. Эти сорбенты большей частью изготовлены
из таких углеводных полимеров как декстрановые или агарозные гели [11, 12]. Они имеют очень
низкую механическую прочность. Такие гели легко атакуются грибками и микробами, поэтому все эти
сорбенты недолговечны и срок их эксплуатации не превышает нескольких месяцев. Они
малопригодны для разделения веществ в препаративных количествах. Поэтому существует острая
необходимость, основываясь на принципах нанотехнологий создания принципиально нового
поколения сорбентов предназначенных для очистки биомолекул и биоструктур [13].
Цель настоящей работы – разработать такие сорбенты, которые бы отличались высокой
механической прочностью и выдерживали большое давление, обладали большой емкостью и высокой
износоустойчивостью, позволяющий им работать в длительное время [14-16].
На рис. 6а представлен снимок поверхности целой частицы углерода из абрикосовых косточек
карбонизованных при температуре 800°С. Для анализа взяты образцы, диспергированные до 1 мм.
Общий вид частицы представлен на рис. 6б. Как видно из этого рисунка, частицы имеют пористую
структуру. Нами проведено углубленное электронно-микроскопическое исследование структуры
материала, карбонизованного при температуре 800°С, при больших увеличениях.
При увеличении до 1100 раз можно увидеть, что на поверхности образца присутствуют крупные
поры от 1500 нм до 3000 нм и на границах крупных пор видны двойные пористые оболочки. Как видно
на микроснимке, при более сильном увеличении на внутренней поверхности крупных пор
присутствуют поры размером 200 нм и менее.
11
Рисунок 6. Электронный микроснимок поверхности частиц карбонизованных образцов при 800°С,
масштаб а – 1 : 100, б –1 : 1100, в – 1 : 4000.
В качестве цветного маркера для МСХ мы взяли общепризнанные стандарты: 1 – голубой
декстран фирмы “Фармация” с молекулярной массой 2 млн. г/моль, 2 – пищевой краситель, имеющий
фирменное название “Sunset Yellow” (оранжево-желтый) с молекулярной массой 300 г/моль (рис. 7).
На рис. 7 приведен график разделения этих двух молекулярно-ситовых маркеров. Как видно из
графика применение нашего сорбента позволило провести разделение маркеров с высоким
разрешением.
Рисунок 7. Хроматограмма молекулярно-ситовых маркеров: 1 – голубой декстран,
2 – пищевой краситель “Sunset Yellow”.
Следующей задачей исследования явилось применение углеродного сорбента для очистки
крупного белок-липидного комплекса (БЛК) которым является субклеточная органелла растительной
клетки – сферосома. Так как БЛК представляют собой округлые тельца диаметром ~1 мкм, то для ее
очистки необходим сорбент с очень крупными порами. Для этих целей годятся агорозные гели
“Сефарозы” типов 2В или 4В.
Для получения бесклеточного экстракта 6 г сухих семян пшеницы сорта “Стекловидная-24”
тщательно растирали в фарфоровой ступке в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.4. Полученный гомогенат
центрифугировали при 10000 × g в течение 10 мин. Затем, полученный бесклеточный экстракт
фракционировали на колонке с углеродным сорбентом. Результаты фракционирования представлены
на рисунке 8. Как видно из рис. 8, БЛК выходят в первом высокомолекулярном пике. А все вещества с
более низкой молекулярной массой выходят во втором пике. Полученные результаты свидетельствуют
о полной пригодности данного углеродного сорбента нанопористой структурой для молекулярноситовой хроматографии крупных белок-липидных комплексов, таких как сферосомы.
Рисунок 8. Молекулярно-ситовая хроматограмма БЛК из зерна пшеницы на колонке с углеродным
сорбентом
12
Определены особенности молекулярно-ситовой хроматографии белок-липидного комплекса на
углеродном сорбенте. Полученные результаты говорят о пригодности данного углеродного сорбента
нанопористой структурой для молекулярно-ситовой хроматографии крупных белок-липидных
комплексов, таких как сферосомы.
Микроудобрение «Фитомикрофертилайзер» (ФМФ)
Микроудобрение получено методом нанотехнологии из экстракта проростков пшеницы, и имеет
сертификат соответствия (КZ.7500317.01.01.16379) и стандарт организации (СТ ТОО 060540013624-022010).
По физико-химическим свойствам микроудобрение представляет собой прозрачную жидкость
желтовато-зеленого цвета содержащую основное химическое соединение дитерпенового ряда фузикокцин (С38Н58О13), являющееся катализатором синтеза ростовых веществ, а также комплекс
микроэлементов, амино - и фенолкислот, что предопределяет разностороннее его влияние на процесс
развития сельскохозяйственных культур.
Определение структуры микроудобрения и чистоты выделенного фузикокцина осуществлено
Институтом биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.
Первые опыты по его применению были заложены на посевах озимой пшеницы сорта
«Стекловидная-24» в РГП «Научно-производственный центр земледелия и растениеводства (2006г.).
Затем в 2008г. микроудобрение испытано на посевах сахарной свеклы в ПСК «Жер-Ана» Алматинской
и озимой ржи в ТОО «Бишкульская птицефабрика» Северо-Казахстанской областей. Установлено, что
созревание происходит на 15 дней раньше, а урожайность повышается на 20-30 %.
Казахским НИИ защиты и карантина растений при проведении серии лабораторных и полевых
опытов по определению физиологической активности микроудобрения «Фитомикрофертилайзера» на
яровой пшенице и ячмене установлено, что накопление листо-стебельной массы и корневой системы
превысило над контрольными посевами соответственно на 47,2 % и 39,7 %, а прибавка урожая
составила 7,3 ц/га.
На производственных посевах ТОО «Астана Жаңа Ағысы» в Есильском районе Акмолинской
области, где культура земледелия уступает опытным посевам ТОО «НПЦЗХ им. А.И.Бараева», с
каждого из 48 га с использованием ФМФ в среднем собрано по 21,6 ц против 15,8 ц/га полученных с
посевов произведенных без обработки микроудобрением или производственная эффективность
составила почти 30,4%.
Преимущества применения микроудобрения
- простота технологии, ФМФ целесообразно использовать в баковых смесях при предпосевной
обработке семян и протравливании посевов, т.е. не требуются дополнительных затрат;
- оптимизация норм высева семян за счет повышения полевой всхожести, развития корневой системы,
лучшей перезимовки растений;
- гарантированное повышение урожайности на 25-30 %.
Влияние на экологию окружающей среды:
- восстановление плодородия почв за счет усиления развития корневой системы, активизации
микрофлоры почвы (азотфиксируюших и фосфатмобилизующих бактерий, симбиотических грибов и
т.д.).
- уменьшение заболеваемости растений и повышение их устойчивости к климатическим и солевым
стрессам за счет активизации «генов устойчивости»;
- уменьшение полегания колосовых зерновых за счет утолщения стенки стебля и снижения норм
высева семян.
1. Мансуров З.А. Карбонизованные наноструктурированные материалы // Углеродные наноструктурированные
материалы на основе растительного сырья. - 2010.- С. 32-46.
2. Дигель
И.Э.,
Жубанова
А.А.,
и
др.
Возможности
использования
наноструктурированных
карбонизованныхматериалов для предотвращения септического шока// Углеродные наноструктурированные материалы на
основе растительного сырья. - 2010.- С. 223-259.
3. Савицкая И.С., Жубанова А.А., Кистаубаева А.С. Перспективы использования пробиотиков, иммобилизованных на
сорбентах с наноструктурированной поверхностью // Углеродные наноструктурированные материалы на
основе
растительного сырья. - 2010.- С. 260-295.
4. Волков М.Ю. Эффективные формы пробиотиков, иммобилизованных на природных адсорбентах // Пищевые
ингредиенты. Сырье и добавки. – 2007. – №1. – С. 48-51.
5. Савицкая И.С. Микроэкологчиеский статус кишечных лактобацилл в норме и при микроэкологических состояниях
// Бюллетень Московского общества испытателей природы, отд. Биологический, 2007. – Т. 112. В.1 – С. 96-99.
6. Dunne W.M. Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – Vol. 15. - P. 155-156.
7. Чижков В.П.,Бойцов В.Н., Демин А.В. Общая теория разделения и жидкостная экстракция // Журн. физ. химии.
2011. Т.85. № 3. С.565.
13
8. Maнсурова. Р.M. Физико-химические основы синтеза углеродсодержащих композиции // Монография. Алматы,
XXI век, 2001. 180 с.
9. Mansurov Z.A., Gilmanov M.K.// Nanostructural Carbon Sorbents for Different Functional Application/ in the book
Sorbents: Properties, Materials and Applications, 2009 “Nova Science Publishers, Inc (New York). Editor: Thomas P. Willis. Chapter
7. pp 217-284.
10. Патент РК №20922 от 25.12.2008. Способ повышения урожайности сельскохозяйственных культур // Мансуров
З.А., Гильманов М.К., Керимкулова А.Р., Басыгараев Ж.М., Ибрагимова С.А., Гильманов С.М, Бийсембаев М.А., Тулейбаева
Ш.А.
11. Гильманов М.К., Дильбарканова Р., Гуккенгеймер Е.Ю., Кульбаева Г.А. Методы очистки и изучения сферосом
семян злаковых культур // Статьи методического сборника ИМБиБ Методы молекулярной биологии, биохимии,
иммунохимии и биотехнологии.- Алматы, 1999. – С. 98-103.
12. Гильманов М., Фурсов О., Францев А. Методы очистки и изучение ферментов растений. // Наука, 1981. 123 с.
13. Kerimkylova A.R., Sabitov A.N., Gilmanov M.K., Mansurov Z.A. Purification of spherosome by chromatography on
nanostructural nanocarbocorb// Вестник КазГУ. Серия биологическая. – 2008. – №1(36). – С. 137-138.
14. Мансуров З.А., Шабанова Т.А., Мансурова Р.М. Морфология микро - нано частиц карбонизированного
растительного сырья // Вестник КазНУ. Сер. химическая. - 2004. - № 2 (34). - С. 129-135
15. Mansurov Z.A., Zhylybaeva N.K., Ualieva P.S., Mansurova R.M. Obtaining Procedure and Properties of the sorbents from
Plant Raw Material // Chemistry for Sustainable Development, 10 (2002) C. 321-328.
16. Maнсуров З.А., Наноуглеродные материалы, Вестник КазНУ, серия химическая, 2003; 2 (30): С.29-31.
М.Х. Шигаева, Т.Д. Мукашева
РАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ
(ДГП НИИ «Проблем биологии и биотехнологии» РГП «КазНУ имени аль-Фараби»)
Освещены достижения в области синэкологического изучения разнообразия микроорганизмов.
результаты микробного разнообразия различных типов почв Казахстана.
Представлены
Биологическое разнообразие относят к числу фундаментальных понятий биологии. Характерной
чертой мира живых организмов является огромное разнообразие их жизненных форм. Именно с
разнокачественностью живых организмов (структурной, физиологической, генетической,
функциональной) связано устойчивое существование жизни как планетарного явления. Отсюда
разнообразие органического мира и способы его поддержания на Земле издавна служат предметом
изучения всех без исключения биологических дисциплин: ботаники, зоологии, микробиологии,
систематики, генетики, экологии, биогеографии, эволюционной биологии и др.
Понятие биологическое разнообразие довольно емкое и разные области знания придают ему
различное содержание. В самом общем смысле его определяют как меру разнокачественного состава
жизни, его видового и таксономического богатства на различных уровнях организации живого жизненных форм, видов, популяций, сообществ, экосистем. На каждом уровне используются свои
критерии оценки разнообразия, от стр>тсгурно-типологических до определения числа и соотношения
компонентов на надорганизменных уровнях организации [1, 2].
Микроорганизмы играют исключительную роль биоценологических и санитарных функциях
почвы, в поддержании жизни растений и животных, обеспечении естественной устойчивости
экосистем. Поэтому в центре внимания микробиологов всегда находились вопросы численности,
разнообразия и функционирования почвенных микроорганизмов. В последние годы исследования
микробного населения почвы проводятся на более высоком уровне - биоценологическом и
синэкологическом, позволяющим исследовать таксономическую структуру микробного сообщества,
понять механизмы устойчивости и стабильности сообществ. Стабильность же систем непосредственно
связана с экологическим разнообразием составляющих их компонентов.
Успех в изучении микроорганизмов во многом определяется эффективностью методов
исследования. В настоящее время почвенные микробиологи и экологи располагают значительным
арсеналом методов от классических, метода посева, прямого микроскопирования до молекулярногенетических [3]. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и ограничения.
Классический метод посева достаточно информативен, но трудоемок и требует опыта работы в
области систематики. Молекулярно - генетические методы обладают высокой пропускной
способностью, но не позволяют судить о физиологических особенностях и экологических функциях
обнаруживаемых бактерий.
Эффективность традиционного (чашечного) метода значительно возросла благодаря
использованию отдельных групп микроорганизмов в качестве удобных моделей. Основные
исследования выполнены на следующих модельных группах микроорганизмов: дрожжевых грибов,
мицелиальных грибов, актиномицетов и анаэробных бактериях. Так, при использовании этих методов
установлено, что видовая структура бактерий подзональных подтипов почв равнинной территории
Казахстана разнообразна. Во всех типах почв доминировали представители бактерий рода Bacillus,
14
Rhodococcus, и Pseudomonas, Kocuria. В серобурых пустынных почв Казахстана доминировали виды
Bас. megaterium, Bac mycoides, Agromyces ramosus, R. baikonurensis. В бурой пустынной, светло и
средне каштановых почвах в большом количестве обнаружены виды Bac. megaterium, Bacillus asahii
и Rh. erythropolis, в темнокаштановой почве Bас. megaterium и Rh. equi, а в черноземах
доминировали виды Rh. erythropolis, R. baikonurensis, Bас. мegaterium, Bacillus circulans,Ps. cepacia и
Ps. aeroginosa.
Видовой состав актиномицетов, выделенных из почв Казахстана также весьма разнообразен и
были выделены актиномицетные комплексы, которые были идентифицированы как представители
следующих родов: Actinomadura, Streptomyces, Micromonospora, Nocardiopsis, Chainia,
Streptoverticilium. Актиномицеты рода Actinomadura и Streptomyces встречались во всех типах почв
Казахстана и доминировали по сравнению с другими родами. Видовое разнообразие актиномадур
представлен А. citrea и А. еchinospora, которые являются доминантой группой для среднекаштановой и
темно-каштановой, карбонатной почвы. Во всех типах почв выявлены стпретомицеты, и представлены
следующими видами: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus и Streptomyces
coelicolor. В средне каштановой и темно-каштановой карбонатной почве были обнаружены
представители редких форм актиномицетов Nocardiopsis alborubidus. Для образцов черноземной почвы
доминантным видом является только Chainia alba.Показано, что актиномицетные комплексы
серобурой, пустынной почвы и чернозема обыкновенного представлены родом Micromonospora и
встречались виды Micromonospora inositola и Micromonospora olivasterospora.
При изучении состава микромицетов серо-бурой пустынной и бурой пустынной почв установлено,
что доминирующими являются грибы рода Cladosporium. В данных почвах также встречаются грибы
рода Aspergillus. Изучение видового состава микромицетов показало, что род Cladosporium
представлен единственным видом Cladosporium herbarum. Изоляты рода Aspergillus
идентифицированы как Aspergillus oryzae. Все они были охарактеризованы по ряду морфологических и
физиологических признаков. Выявлены видоспецифические особенности микромицетов [4].
Для каждого типа почвы характерна специфика в составе дрожжевой микрофлоры. Показано, что
численность и таксономическая структура дрожжевых организмов существенно изменяются в
зависимости от типа почвы. Серобурые пустынные и бурые пустынные характеризуются
малочисленностью и бедностью видового состава дрожжевых организмов. В светло-каштановых и
темно-каштановых почвах доминировали виды Aureobasidium pullulans, Lipomyces Starkeyi и Lipomyces
tetrasporus. В черноземе обыкновенном кроме Aureobasidium pullulans, Lipomyces Starkeyi и Lipomyces
tetrasporus, также доминировали Cryptococcus albidus, Cr. laurentii и Rhodotorula glutinis. В
каштановых и черноземных почвах аскомицентные дрожжи Candida curvata, C.sp.(podzolica) и
Cr.terreus являются минорными видами. Во всех без исключения почвах весьма широко представлены
виды Aureobasidium pullulans и Lipomyces Starkeyi [5] .
Основные результаты использования синэкологических подходов в изучении микробных
сообществ почв можно в тезисном виде сформулировать следующим образом: определены основные
источники и факторы, определяющие микробное разнообразие; пути миграции микроорганизмов вдоль
почвенных ярусов; установить связи между местоположением определенных микроорганизмов с их
функциями и стратегиями жизни.
Подобные исследования еще немногочисленны, но они показали перспективность использования
методов количественной синэкологии в оценке разнообразия микроорганизмов и их сохранения для
человечества. Еще в 1990 г. Заварзин Г. А. [5]. поднимал вопрос о необходимости сохранения
уникальных природных сообществ. В последние годы в ряде международных конференций вопрос
ставился более широко - о необходимости сохранения почв вместе с его живым населением.
Звягинцевым Д.Г. с сотр. [6], Добровольской Т.Г. с соавт [3] на большом экспериментальном
материале установлено, что сукцессионный подход, учитывающий распределение микроорганизмов в
пространстве и времени, наиболее полно выявляет микробное разнообразие. В ходе этих исследований
показано, что микробное разнообразие зависит от типа почв (субстрата) и определяется многими
экологическими факторами: содержанием органического вещества, влажностью, кислотностью,
содержанием солей.
Влияние типа субстрата на видовое разнообразие микроорганизмов обнаружено при изучении их
распределения в биогеоценозах в ряду: растений-подстилка- почвенные горизонты. На примере
коринеподобных бактерий установлено, что максимальное разнообразие бактерий наблюдается в
подстилке, где идет интенсивное накопление и разложение растительного материала. С дернового
горизонта почвы видовое разнообразие уменьшается вплоть до минимума в самых нижних почвенных
горизонтах.
15
Применение различных молекулярно-биологических методов в микробиологии дало возможность
более глубокого изучения микробных сообществ. Например, метод реассоциации связан с
определением скорости реассоциации ДНК, экстрагированной из почвы. Процесс реассоциации
выделенной и расплавленной ДНК исследуют спектрофотометрически, используя геном Escherichia
coli в качестве этанола. По мнению исследователей, константа реаасосиации является идеальной
количественной характеристикой, выражающей количество пар оснований в негомологичной ДНК.
Она эквивалентна размеру генома в целом и может быть использована для характеристики
разнообразия бактериальных сообществ, а также происходящих в них изменений, связанных с
различными воздействиями – природными и антропогенными. Получить количественную информацию
о метаболически активных или численно доминирующих популяций в почве можно используя метод
гибридизации с олигонуклеотидными маркерами in situ, меченными флуоресцентными красителями.
Метод основанный на выделении экстрактов ДНК из почвы при помощи дифференциального
центрифугирования в градиенте СsCl позволяет в дальнейшем провести более детально исследование
молекулярными методами – гибридизация, фингерпринт и т.д. Большинство работ по оценке
биоразнообразия почв и изучению филогенетических взаимоотношений внутри сообществ
микроорганизмов базируются на исследованиях нуклеиновых кислот при помощи полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с соответствующими филогенетическими маркерами (16S рРНК, 18S рРНК и
др.) [7, 8].
Определение микробного разнообразия почв при помощи молекулярно-генетических методов
проводится давно. Так, Ueda T., et. al. при изучении почвы под посевами сои констатировал наличие
крупных групп: грамположительные бактерии с высоким содержанием Г+Ц, зеленые серные бактерии,
протеобактерии, креноархеи и клоны, которые не попадают ни в один из известных основных
филотипов домена Bacteria, представленных в виде филогенетического древа
/8/. Широкое
использование молекулярно-генетических методов приводят к описанию новых видов
микроорганизмов. Так, при анализе атлантической лесной экосистемы (Бразилия) было описано, что
преобладающими группами являются Acidobacteria (63%), далее следуют Proteobacteria (25,2%),
Gemmatimonadetes (1,6%), Actinobacteria (1,2%), Bacteroidetes (1%), Chloroflexi (0,66%), Nitrospira
(0,4%), Planctomycetes (0,4%) и Firmicutes (0,26%). 48 последовательностей (6,5%) представлены
неизвестными бактериями /9/. Статистический анализ показал, что бактериальное разнообразие
находится под влиянием таких факторов, как высота, соотношение Ca2 + / Mg2 +, содержание Al3 + и
фосфора.
1Чернов И.Ю. Биологическое разнообразие: сущность и проблемы //Успехи совр. биологии. 1991, т.З, вып. 4. С 499507.
2Розанов С.К. Показатели разнообразия в оценке сущессионного состояния экосистем. //Успехи совр. биол. 1999, т.
119, №4. С. 404 -410
3Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Бактериальное разнообразие почв: оценка методов,
возможностей, перспектив. //Микробиология, 2001, N92. С. 149-167
4 Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж., Мукашеав Т.Д., Шигаева М.Х. Численность бактерий в подзональных почвах
равнинной территории Казахстана //Вестник КазНУ, серия экологическая 2011 № 4. - С. 14 – 17.
5Заварзин Г.А., Жилина Г.Н., Клевбрин В.В. Алкалофильное сообщество и его функциональное разнообразие.
//Микробиология, 1999, т. 68. С. 579-5995
6 Звягинцев Д.Г., Бабьева И.Н., ЗеноваГ.М., Полянская J1.M. Разнообразие грибов и актиномицетов и их
экологические функции.//Почвоведение, 1996, №6. С. 705-713
7 Kirk J. L., Beaudette L.A, Hart M., Moutoglis P., Klironomos J. N., Lee H., Trevors J. T. Methods of studying soil microbial
diversity//Journal of Microbiological Methods. – 2004. - № 58. – Р.69–188.
8 Ueda T., Suga Y., Matsuguchi T. Molecular phylogenetic analysis of a soil microbial community in a soybean field // Eur. J.
Soil. Sci. - 1995. - V.46. - P.415 – 421.
9 Faoro H., Alves A. C., Souza E. M., Rigo L. U., Cruz L. M., Al-Janabi S. M., Monteiro R. A., Baura V. A., Pedrosa F. O.
Influence of soil characteristics on the diversity of bacteria in the Southern Brazilian Atlantic forest // Applied and Environmental
Microbiology. – 2010. - Vol. 76, № 14. - Р. 4744-4749.
К.Х .Алмагамбетов, Н.Б. Молдагулова, С.С. Ануарбекова, З.С.Сармурзина
КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ
(Республиканская коллекция микроорганизмов, e-mail: [email protected])
В настоящей работе представлены сведения о коллекции промышленных микроорганизмов, касающиеся таксономии,
численности, технологий хранения и генотипирования культур. Столь же актуальны вопросы оценки интеллектуального
потенциала промышленных штаммов, развития коллекций тест-культур.
Микробиология является важной составляющей биологической науки, относится к
фундаментальным дисциплинам высшей школы, как в университетах биологического профиля, так и в
16
медицинских вузах. Никто не сомневается в том, что достижения и перспективы развития
биологических технологий в самых разных сферах человеческой деятельности основаны на
использовании микроорганизмов, наряду с объектами животного и растительного происхождения.
История развития микробиологии в нашей республике подобна вчерашним общесоюзным и
сегодняшним мировым тенденциям ее развития. Начиналась она с микробиологии почвы и воды, с
сельскохозяйственной микробиологии, далее самостоятельное развитие получили медицинская и
санитарная микробиология, затем и промышленная микробиология. Со второй половины прошедшего
столетия берет начало развитие микробиологической промышленности, производство биопрепаратов
на основе микробиологического синтеза и процессов брожения, а с конца ее – развиваются технологии
получения при помощи генно-модифицированных микроорганизмов рекомбинантных белков, в том
числе медицински значимых гормонов и цитокинов.
Развитие микробиологии в Казахстане связано с научной и педагогической деятельностью
ученых-микробиологов, открывавших соответствующие научные институты и кафедры при вузах,
создавших научные школы, являющихся авторами монографий, учебников и учебных пособий по
микробиологии, а также крупных внедрений практических разработок в производство. Это Макиров
К.А., Шамес Д.Л., Жуматов Х.Ж., Чулаков Ш.А., Иллялетдинов А.Н., Шигаева М.Х., Ахматуллина
Н.Б., Никитина Е.Т., Тулемисова К.А., Жубанова А.А., медицинские микробиологи - Котова А.Л.,
Снопкова В.А, Сарбасова Ш.И. и др.
Среди научных организаций и вузов республики больший вклад в развитие микробиологии
внесли коллективы Института микробиологии и вирусологии (ИМиВ) и кафедры микробиологии,
вирусологии и иммунологии КазНУ им. аль-Фараби. В лабораториях этих организаций начиналось
интенсивное развитие фундаментальных и прикладных исследований; они и сегодня остаются в
Казахстане признанными флагманами научных исследований и разработок в области микробиологии.
Каковы сегодняшние направления научных исследований и разработок в области
микробиологии? Анализ тематик грантов, выигравших конкурс Комитета науки МОН РК на 2012 -2014
годы по направлениям «Науки о жизни», «Интеллектуальный потенциал...», «Глубокая переработка...»
и «Энергетика...» показало следующее.
По направлению «Науки о жизни» тематика 14 грантовых исследований связана с разработкой
микробных биопрепартов. Это пробиотики, заквасочные культуры, кормовые добавки,
биоинсектициды, биоудобрения и нефтедеструкторы.
По направлению «Интеллектуальный потенциал» - 11 грантов, в том числе 2 по разработке
биопрепаратов для ростостимуляции и борьбы с фитопатогенами сельскохозяйственных растений, 1 по
селекции энтомопатогенных микроорганизмов, 2 по исследованию гетеротрофных бактерий реки
Есиль, 2 по селекции микроорганизмов-нефтедеструкторов и 4 гранта по сохранению и развитию
коллекций промышленных микроорганизмов.
По направлению «Глубокая переработка.» 5 грантов, в том числе по разработке пробиотиков для
птицеводства, получению пробиотических продуктов на основе верблюжьего молока, по
биконсервантам на основе бактериоцинпродуцирующих лактобацилл и 1 по биовыщелачиванию урана.
По направлению «Энергетика» - 1 грант по разработке технологий получения биодизельного
топлива на основе микроводорослей, 1 грант нацелен на получение рекомбинатных микроорганизмов,
эффективно экспрессирующих целлюлазы (табл.1).
Таблица 1. Количество «микробных» грантов в рамках приоритетных направлений развития
науки на 2012-2014 гг.
Темы грантов
Биопрепараты:
Пробиотики
Корм. добавки
Нефтедеструкторы
Биоудобрения
Закваски
Биоинсектициды
Биоконсерванты
Диагнс. препараты
Сохран. и развитие коллекций
Науки о жизни
Интеллектуальн.
потенциал
4
1
1
3
1
2
-
1
1
4
Глубокая переработка
1
1
1
1
-
Формально по названию тематик грантов можно говорить о классике, в какой-то мере об
устоявшихся направлениях научных разработок по биопрепаратам. Но при оценке содержания грантов
17
однозначно то, что запланированные исследования отличаются от прошлых по таксономическим
группам микроорганизмов (родам, видам и штаммам), используемым в качестве объекта научных
исследований и разработок. Более важно то, что в научных исследованиях и разработках все шире
используются современные, а именно молекулярно-биологические и генетические методы и
технологии.
Вместе с тем очень мало грантов по энзимологии микроорганизмов. Определение
ферментативной активности, выделение, очистка и стабилизация фермента очень важны при оценке
качества штаммов. Как пример можно привести всего лишь один грант - "Разработка научных основ
применения микробных липаз для очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности и
бытовых стоков» (ИМиВ).
Отсутствуют грантовые исследования по мутагенезу и селекции промышленных штаммов,
получению штаммов-сверхпродуцентов. В 1970-80 годы штаммы-сверхпродуценты антибиотиков,
ферментов, аминокислот, витаминов и других биологически активных соединений были получены
именно этими методами.
Не менее актуальна проблема разработки генно-модифицированных микроорганизмов,
продуцирующих рекомбинантные белки, биологически активные низкомолекулярные пептиды.
Особенно остро они востребованы в медицинской практике. Это инсулин, интерлейкины,
интерфероны, ростовые факторы и др. Можно привести в качестве примера лишь два гранта,
нацеленных на получение рекомбинантных белков, используемых в диагностической практике и в
переработке растительного сырья. Соответственно, это гранты
«Получение рекомбинантных
полимераз, востребованных в научных исследованиях и диагностической практике» (НЦБ) и
«Создание рекомбинантных штаммов микроорганизмов, эффективно экспрессирующие гены целлюлаз
для получения биотоплива из целлюлозосодержащего сырья» (КазНУ).
Такова картина грантовых исследований, связанных с использованием в качестве биообъекта
микроорганизмов.
Микробиологические ресурсы, это, прежде всего, промышленные мироорганизмы, используемые
в разных отраслях производства (в растениеводстве, в производстве и переработке пищевой
продукции, в животноводстве в качестве кормовых добавок, в медицине, ветеринарии и защите
окружающей среды). Это консорциумы микроорганизмов, используемых в качестве заквасок,
пробиотиков, биоудобрений, биоинсектицидов и др. Это микроорганизмы - сверхпродуценты
антибиотиков, ферментов, витаминов, аминокислот и других биологически активных соединений.
Данная группа микроорганизмов получена именно методами селекции и мутагенеза, особенно
интенсивно использовавшихся во второй половине прошедшего столетия. Это генномодифицированные микроорганизмы, продуцирующие рекомбинантные белки.
Микробиологические ресурсы общепринято связывать с коллекционными культурами
промышленных микроорганизмов, находящимися на хранении в чистом виде и жизнеспособном
состоянии, с сохранением целевой биологической активности. Культуры хранятся современными
технологиями
лиофилизации
и
криоконсервации,
а
также
классическими
методами
субкультивирования. В коллекциях в плановом порядке проверяется жизнеспособность и
аутентичность культур, используя с этой целью микробиологический, достаточно трудоемкий метод
посевов и пересевов. Проводится подсчет количества жизнеспособных клеток трудоемким методом
серийных разведений, наряду со спектрофотометрическим измерением оптической плотности
суточных культур при определенной длине волны и многие другие виды коллекционных работ.
На предмет сохранности культур в коллекциях научных организаций были проанализированы в
сравнительном аспекте два Каталога микроорганизмов. Первый был издан в 2003 году и включает
перечень микроорганизмов, хранившихся в то время в 7 организациях (ИМиВ, Институт
фармбиотехнологии, КазНИИ пищевой промышленности, НИИ плодоводства и виноградарства,
КазНИВИ, Алматинский биокомбинат и НИСХИ). Второй Каталог издан в 2010 году и составлен
только по коллекции ИМиВ.
Каталог 2003 года состоит из 665 культур, в том числе бактерий – 285, включая 74 культуры
актиномицет, мицелиальных грибов – 280 и дрожжей – 76. Среди бактерий, хранящихся в коллекциях
доминируют бациллы (Bacillus thuringiensis и B.subtilis)- 47 культур и лактобациллы (Lactobacillus
spp.) - 55 культур. Из 665 культур 230 относятся к патогенам растений и животных (коллекции НИСХИ
и КазНИВИ), 110 культур насчитывала в то время коллекция ИМиВ.
Каталог коллекции ИМиВ, составленный в 2010 году включает 357 культур, в том числе
актиномицет 212 штаммов, бактерий 79, дрожжей 39 и мицелиальных грибов 28.
18
Сопоставлении коллекционных культур, хранящихся в ИМиВ по Каталогам 2003 и 2010 гг.
Показало следующее. Так, присутствующие в Каталоге 2003 года 17 культур актиномицет,
выделенных профессором Чормоновой Н.Т. в Каталоге 2010 года
отсутствуют. Культуры
актиномицет, принадлежащие к родам Actinomadura, Amycolata и Nocardia, присутствующие в
Каталоге 2003 года также отсутствуют в Каталоге 2010 года. Из 8 культур, заложенных на хранение в
свое время профессором Никитиной Е.Т. (Катлог 2003 г.) остались только 2 (Каталог 2010 г.).
Отрадно, что штамм Streptomyces griseoruber (продуцент антрациклиновых антибиотиков, а также
стимулятор роста растений), выделенный в свое время М.Х.Шигаевой и К.А.Тулемисовой сохранился
по сей день, он есть в списках Каталогов 2003 и 2010 годов.
Но вместе с тем, Каталог изданный в 2010 году показывает, что коллекция ИМВ пополнилась
большим количеством стрептомицет, продуцентов витаминов группы В и антибиотика целикомицина
(авторы Балицкая А.К. и Сартбаева У.А.). Число дрожжевых культур увеличилось с 17 до 39 культур,
они в основном представлены сакшаромицетами и кандидами. Мицелиальных грибов в 2003 году было
4 культуры, а в 2010 в ИМиВ их уже 28.
К сожалению, ни в Каталоге 2003 года, ни в Каталоге 2010 года нет сведений о числе
коллекционных культур, защищенных патентами.
В музее коллекционных культур Республиканской коллекции микроорганизмов (далее РКМ) в
настоящее время 414 культур (табл.2), хранящиеся теми или иными альтернативными способами, часть
коллекционных микроорганизмов генотипирована (табл.3).
Таблица 2. Перечень коллекционных культур РКМ
Микроорганизмы
Молочнокислые бактерии
Бациллы
Актиномицеты
Иные таксономические группы бактерий
Мицелиальные грибы
Дрожжи
Микроводоросли
Всего
Таблица 3. Количество
генотипированных
Микроорганизмы
Молочнокислые
бактерий
Бациллы
Актиномицеты
Иные группы бактерий
Мицелиальные грибы
Дрожжи
Микроводоросли
Всего
культур, находящихся
Количество культур
107
81
17
57
79
40
33
414
на хранении
в
РКМ,
в том
Субкультивирование
63
Лиофилизация
35
Криоконсервация
79
Генотипирование
41
11
7
30
79
40
33
263
14
32
11
92
66
10
25
79
33
332
21
15
11
19
107
числе
Наряду с количественными характеристиками более важны качественные показатели. В РКМ
очень малое число защищенных патентами коллекционных культур, малый процент генотипирования
штаммов, недостаточен охват коллекционных культур технологией лиофилизации.
Очень важно наличие сведения о культурах, используемых в биопроизводстве. Эти сведения
позволили бы говорить о конечных результатах работы по селекции промышленных микроорганизмов,
в том числе по коллекционной работы.
В 1970 - 80-е годы в г.Степногорске была развитая биотехнологическая промышленность
союзного значения. В промышленной зоне города было налажено крупнотоннажное
микробиологическое производство кормовой аминокислоты – лизина, антибиотиков для
животноводства – менонзина и тилозина, средств защиты растений – бактоларвицида, лепидоцида и
19
других биопрепаратов. С распадом Союза крупнотоннажное микробиологическое производство в
г.Степногорске прекратило свое существование. Примерно такая же участь постигла и второе по
масштабам микробиологическое производство Казахстана того времени - Алматинский биокомбинат.
В настоящее время имеет место малое биопроизводство, на уровне опытно-промышленных
объемов. Это выпуск биоудобрений, заквасок, пробиотиков и других биопрепаратов, выпускаемых
малыми партиями. Промышленная микробиология, биотех-нология микророганизмов пока остается на
обочине индустриально-инновационного развития государства.
Охраноспособность коллекционных культур и их реальное использование в биопроизводстве
актуальны с позиции их нематериальной, интеллектуальной ценности.
Коллекционные штаммы микроорганизмов, продуцирующие те или иные биологические
активные вещества являются результатом многолетней работы как отдельных ученых, так и целых
коллективов. Многие годы с затратой бюджетных средств чистые культуры этих микроорганизмов
хранятся в жизнеспособном состоянии, проводятся работы по поддержанию их изначальной
биологической активности. Само собой разумеется, можно оценить материальные затраты на
поддержание коллекционых культур, но более важно учесть нематериальные активы, вложенный в них
интеллектуальный труд ученых.
Есть Постановление Правительства Республики Казахстан от 2002 года по оценке
интеллектуальной собственности. В отношении микроорганизмов – это патентование штамма и
оценка стоимости патента через лицензированных оценщиков интеллектуальной собственности, т.е.
оценка через охранный документ – патент. Путем оценки патентов можно пополнить уставной
капитал предприятия, амортизировать их в качестве нематериальных активов.
Но подавляющее большинство коллекционных культур не имеет патентной поддержки, можно
ли на этой основе говорить об отсутствии интеллектуальной компоненты, об отсутствии
нематериальных активов в коллекциях промышленных микроорганизмов. Наверное нельзя.
Сейчас функционируют инновационные патенты, требующие от патентуемого штамма только
локальную новизну и полезные свойства. Можно ли путем получения инновационных патентов
увеличить число защищенных охранными документами коллекционных культур. Насколько прочную
правовую основу дадут инновационные патенты при оценке нематериальных активов,
интеллектуальной ценности коллекций культур промышленных микроорганизмов.
О тест-культурах и референс-штаммах. Это достаточно специфическое направление работы
коллекций микроорганизмов. Тест-микроорганизмы, необходимы для микробиологического контроля
лекарственных средств, для оценки чувствительности к антибиотикам, определения антагонизма,
мутагенности, других контрольно- аналитических работ, а также для научных исследований и для
образовательного процесса. К примеру, для микробиологического контроля лекарственных средств
можно использовать только культуры из коллекции ATCC, а при оценке антагонизма,
антибиотикочувствительности достаточны референс-штаммы. Вместе с тем, недостаточно
целенаправлены работы по формированию коллекций тест-культур, необходимых для обеспечения
ими потребностей научных организаций и производств, нет развития их сервисной востребованности.
***
Өндірістік микроорганизмдер коллекцияларының таксономиялары, саны, сақтау технологиялары мен генотиптелуі
түралы мəліметтер келтірілген.Өндірістік штамдардың интеллектуалды потенциалын бағалау, тест-дақылдар коллекциясын
дамытудың ақ манызы қарастырылған.
***
The article provides information about the collections of industrial microorganisms on the taxonomy, population, technology of
storage and genotyping of cultures. Evaluation questions of the intellectual potential of industrial strains and collections of test cultures
are equally relevant.
МИКРОБИОЛОГИЯ
Г.Ж. Абдиева, А.М. Имадиева, Г.Қ. Қайырманова, А.А. Жұбанова, Н.Ш. Акимбеков
АҒЫН СУДАН БӨЛІНІП АЛЫНҒАН ДЕСТРУКТИВТІ БЕЛСЕНДІ ГЕТЕРОТРОФТЫ
МИКРООРГАНИЗМДЕРДІ ИДЕНТИФИКАЦИЯЛАУ ЖƏНЕ ИММОБИЛИЗДЕУ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, e-mail: [email protected])
Экологиялық биотехнологияның маңызды мəселелерінің бірі судың қорын сақтау, су
қоймаларының əртүрлі ластағыштармен ластануының алдын алу жəне ағынды суларды тазарту болып
табылады. Қазақстанның барлық территориясында қазіргі таңда көптеген тұрғылықты жерлермен
20
өндіріс орындарының ағынды сулары табиғи жəне жасанды су қоймаларды ластауы бірден - бір кең
таралған өзекті мəселе болып отыр.
Ағынды сулардың құрамы орналасу орнына, шығу тегіне жəне ластану көзіне байланысты
əртүрлі. Қоршаған ортаның ластанған объектілерін тазарту мен биоремедиациялауда деструктивті
активті микроорганизм штамдарының маңызы зор. Ағын сулардың құрамындағы ластағыш
органикалық
заттарды тазарту мақсатында микроорганизм - деструктор қауымдастықтары
пайдаланылады. Ағын сулардың ластануы бүгінгі таңда өзекті мəселе болып отыр [1].
Жұмыстың мақсаты ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты микроорганизмдерді
идентификациялау жəне түрлі тасушыларға иммобилизденген клеткаларын пайдалану мүмкіндігін
зерттеу.
Əдістер мен материалдар
Зерттеу обьектілер ретінде Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп
алынған Б1 жəне Т1 гетеротрофты бактерия штамдары алынды.
Ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты бактерияларды идентификациялау дəстүрлі
микробиологиялық əдістері арқылы морфолого-культуралдық, физиология-биохимиялық қасиеттері
зерттелінді [2;3]. Гетеротрофты бактериялардың генетикалық идентификациясы 16S pPHK 8-806
гендерінің фрагменттерін секвенирлеу негізінде жүргізілді. Нуклеотидтердің тізбектерін білгілі ретпен
орналасуы “BigDye Terminanor v 3.1 Cycle sequencing Kit жиынтығы қолданылып Сэнгер əдісімен
анықталды.
Нəтижелер мен талқылау
Зерттеу нəтижесінде Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп
алынған Б1 штамының морфологиялық қасиеттері бойынша жеке-жеке орналасқан қысқа таяқша
пішінді грамм оң бактериялар, ал Т1 штамы дара, ұзын, грамм оң таяқшалар, екі дақыл да спора жəне
капсула түзетін, қозғалысқа қабілетті бактериялар екендігі анықталды (сурет 1). Қатты қоректік
орталарда Б1 штамы ақ-сұр, жылтыр, дұрыс формалы, дөңгелек, диаметрі 1-2 мм, аралығында
колониялар түзді. ЕПС қоректік орта лайланып, бетіне қаймақ түзіп өседі, ал Т1 штамы пішін дұрыс
формалы, шеті иректелген, жылтыр емес, күнгірт, беті кедір-бүдір, көлемі 2-3 мм болатын колониялар.
А
Б
Сурет1. Б1 жəне Т1 штамдарының морфологиясы: А) Б1 штамы; Б) T1 штамы
Гетеротрофты бактериялар физиология-биохимиялық қасиеттерін зерттеуде олардың етпептонды желатинді ортада жəне сүтте өсуі, көмірсулар жəне спирттерді ыдырату қабілеттілігі,
каталаздық белсенділігі жəне температураның əртүрлі мəнінде (300С, 370С, 480С) өсу ерекшеліктері
ескерілді.
Штамдардың физиология-биохимиялық қасиеттерін зерттеу нəтижесінде Б1 жəне Т1
штамдарының каталаза оң, протеолитикалық белсенділікке ие, сүтте өсуі жоқ, температураның 300Сқарқынды, 370С -əлсіз, 48 0С өсуге төзімсіздігі анықталды. Б1 штамы көмірсулар мен спирттерден
глюкоза, сахароза, галактоза, крахмал, сорбит, маннитті белсенді жəне орташа ыдыратқаны анықталды.
Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп алынған гетеротрофты
бактериялардың морфология-культуралдық, физиология-биохимиялық қасиеттері зерттелініп,
генетикалық идентификация жасалынып түрге дейін жіктелінді. Б1 штамы Bacillus subtilis жəне Т1
штамы Bacillus cereus өкілдері екендігі анықталды.
Гетеротрофты бактериялардың генетикалық идентификациясы бактерия клеткасының ДНҚ-сын
секвинерлеу арқылы жүргізілді. Нуклеотидтердің тізбектерін белгілі ретпен орналасуы Сэнгер əдісімен
анықталды. Идентификация үшін алынған нуклеотидтердің тізбегін дүниежүзілік геннің тізбегімен
салыстырғанда Б1 штамының гені Bacillus subtilis Т1 штамының гені Bacillus cereus, өкілдерінің геніне
сəйкес келгені анықталды.
21
М Б1
Т1
М
-К
Б1
Т1
+К
10000
3000
1000
500
100
Сурет 2. Агарозды гельде жасалған электрофорез үлгісі
Б1 штамының генетикалық идентификациясы:
Б1 Bacillus subtilis
AATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG
TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACC
GGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGA
CCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCT
GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA
GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCG
GATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGT
ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG
TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCC
GGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATT
CCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGG
TCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA.
Acces
Description
Max
Total
Query
E
Max
sion
score
score
coverage
value ident
JF738126.1 Bacillus subtilis strain B20-B 16S
1376
1376
100%
0.0
100%
ribosomal RNA gene, partial sequence
HQ640429.1 Bacillus subtilis strain wheat bran-1
1376
100%
0.0
100%
1376
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
HQ219927.1 Bacillus subtilis strain ATY8 16S
1376
100%
0.0
100%
1376
ribosomal RNA gene, partial sequence
Т1 штамының генетикалық идентификациясы:
Т1_ Bacillus cereus
TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC
ATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTT
CGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTG
AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAA
GAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT
ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGC
GCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGA
AACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
GATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAA
GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT.
Accession
Description
Max
Total
Query
E
Max
score
score
coverage
value ident
JF750734.1 Bacillus cereus strain EBT1 16S
1343
1343
100%
0.0
100%
ribosomal RNA gene, partial sequence
JF706262.1 Bacillus cereus strain BCC01 16S
1343
1343
100%
0.0
100%
22
ribosomal RNA gene, partial sequence
JF496498.1 Bacillus cereus strain WA6-16 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
1343
1343
100%
0.0
100%
Адсорбцияланған
клеткалар %
Экологиялық биотехнологияда қоршаған орта объектілерін əртүрлі ластағыштардан тазартуда
микроорганизмдердің бос жəне иммобилизденген клеткалары негізіндегі биокатализаторлар кеңінен
қолданылады. Иммобилизденген клеткаларды алуда клеткалардың адсобциялық белсенділігі,
тасушының табиғаты мен құрлысы, тасушыға бекінген клетканың десорбциялану көрсеткіші ескеріледі
[4].
Жұмыста Bacillus subtilis-Б1 жəне Bacillus cereus-Т1 штамдарының пенополиуретанға (ППУ),
полипропиленді талшыққа (ППТ) жəне цеолитке иммобилиздену динамикасы зерттелінді (сурет 3;4).
Bacillus subtilis-Б1 штамының ППУ, ППТ жəне цеолитке адсорбциялану белсенділігі анықталынды
(сурет 3).
Зерттеу нəтижесінде Bacillus subtilis-Б1 штамының ППУ, ППТ тасушыларына иммобилизденуі
алғашқы сағаттарынан бастап, қарқынды жүрген. Bacillus subtilis-Б1 ППУ сорбциялану 1-ші сағатта
54,5% клеткалар иммобилизденіп, 24 сағатта сорбцияланған клеткалардың саны 65%–ға жеткен (сурет
3).
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ППУ
ППТ
Цеолит
0
1
3
5
7
24
Уақыт,сағат
Сурет 3. Б1 штамының əр түрлі тасушыларға иммобилизденуі
Ал ППТ-ға алғашқы кезеңінде 45%, 24 сағатта 60% клеткалар сорбцияланған. Bacillus subtilis-Б1
цеолитке иммобилизденуі ППУ, ППТ сорбенттерге қарағанда төмен деңгейде болды. Bacillus subtilis-Б1
штамы иммобилизденудің 5 сағатында сорбцияланған клеткалардың саны 10% болып, 24 сағатқа 40%
жеткен. тасушының жоғары болғанын, ал цеолитке иммобилиздену динамикасы төмен болғаны
анықталды.
Сурет 4. Bacillus cereus-Т1 штамының əртүрлі тасушыларға иммобилизденуі
Bacillus cereus-Т1 штамының ППУ, ППТ жəне цеолитке қарағанда белсенді жүрген. ППУ –ға 1ші сағ. 22%, 24 сағатта 40% Bacillus cereus-Т1 штамының клеткалары сорбцияланса,
ППТ
тасушыларына 1-ші сағ. 2%, 24 сағатта 35% иммобилизденсе, цеолитке 5- ші сағатта 32%, 24 сағатта 24
% иммобилизденген. Алынған нəтижелер Bacillus cereus-Т1 штамының адсорбциялану белсенділігінің
төмендігін көрсетті (сурет 3).
23
Сонымен, гетеротрофты бактерияларды иммобилиздегенде Bacillus subtilis-Б1 штамы жəне
Bacillus cereus-Т1 штамдары пенополиуретанға жəне полипропиленді талшықта иммобилизденудің
жоғары динамикасын көрсетті, ал цеолитте иммобилизденудің динамикасы төмен болды.
Ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты Bacillus subtilis-Б1 жəне Bacillus cereus-Т1
штамдарын əртүрлі органикалық заттармен ластанған қоршаған орта объектілерін тазартуда тиімді
иммобилизденген деструктивті белсенді микроорганизмдер негізіндегі биокатализаторлар ретінде
қолдануға болады.
1.Научно- популярный и образовательный журнал. Экология и жизнь. 1(92) ’2010
2.Практикум по микробиологии: Учеб: пособие для студ.высш. учеб.заведений./А. И. Нетрусов, М.А Егорова, Л.М
Захарчук и др.; Под.ред А.И Нетрусова.- М.: Издательский центр «Академия», 2005.-608 с.
3.Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск.ун-та, 1976.307 с
4. Синицина А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Издво Мгу, 1994.288 с
***
В работе идентифицированы гетеротрофные бактерии-деструкторы различных органических загрязнителей,
выделенные из городских очистных сооружений. Изучены сорбционная активность бактерии-деструкторы на различные
носителей.
***
In this research work has been identified heterotrophic destructive bacteria of organic pollutants isolated
from wastewater treatment facilities and studied their sorption activity on various types of sorbents.
ОƏК: 633.16:631.461.61:630*443
Р.С. Айдаркулова, А.П. Науанова, М.Б. Айтенова
ФУНГИЦИДТІ ҚАСИЕТКЕ ИЕ СHAETOMIUM ТУЫСЫНА ЖАТАТЫН САҢЫРАУҚҰЛАҚ
ШТАМДАРЫН АРПАНЫҢ ТАМЫР ШІРІГІ АУРУЫНА ҚАРСЫ ҚОЛДАНУ
(С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университеті)
Бұл мақалада зертханалық жəне танаптық жағдайларда арпа өсімдігінің тамыр шірігі ауруын қоздыратын
Fusarium жəне Bipolaris фитопатогендеріне қарсы Chaetomium туысына жататын целлюлозаны ыдыратушы
саңырауқұлақтардың фунгицидтік қасиеті зерттелді. Зерттеу жұмыстарының нəтижесінде Chaetomium туысы
саңырауқұлақтарының антагонистік белсенділігі туралы зертханалық жағдайда алынған мəліметтер танаптық
жағдайдағы тəжірибелермен дəлелденді.
Өткен ғасырдың 70 - ші жылдарының басында академик А.И. Бараев ұсынған егіншіліктің
топырақ қорғау жүйесінде топырақты аудармай аңыз қалдырып өңдеу тəсілі Қазақстан мен Батыс
Сібірдің далалы аймағында кең қолданысқа ие болды. Топырақты аудармай өңдеу тəсілі қысқы жауын
– шашынды жинау арқылы құрғақшылықты жеңуге, топырақты дефляция мен су эрозиясынан
қорғаудың мəселелерін шешуге көмектескенмен, егістіктің арам шөптермен ластануына əкеп
соқтырады [1]. Топырақтың жоғарғы қабатында өсімдік қалдықтарын қалдыру ауыл шаруашылық
дақылдарының ауруларын тудыратын патогенді микроағзалардың жиналуына ықпал етеді [2].
Топырақ құнарлылығын сақтау жəне арттыру тек өсімдік қалдықтарын шірітіп, қарашірікке айналдыру
ғана емес, сонымен қатар өсімдіктерді фитопатогендерден қорғау ауру тудырушы инфекцияның жалпы
потенциалын төмендетіп, сол арқылы химиялық пестицидтердің қолданылу мөлшерін азайтатын
экологиязациялаумен тығыз байланысты. Топырақ патогендері, əсіресе тамыр шірігі ауруын
қоздырушылар топырақтың құнарлығына тікелей əсер етеді [3].
Дəнді дақылдардың саңырауқұлақ ауруларымен күресуде антагонист-саңырауқұлақтарды
пайдаланудың болашағы зор. Олар өсімдіктердің аурумен зақымдануын төмендетіп, өсуі мен дамуын
ынталандырып, өнімділікті арттырады жəне қоршаған ортаны ластамайды [4].
Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтар – целлюлозаны ыдыратушы нағыз сапрофиттер.
Олардың кейбір түрлері фунгицидтік қасиеттерге ие, сонымен қатар топырақтың қара шірік қабатын
жақсартатын жəне оның құнарлығын арттыратын, көптеген өсімдіктерге өсуді ынталандыру
белсенділігі бар антибиотиктер мен басқа да метаболиттерді бөлуге негізделген [5].
Қазіргі таңда өсімдіктердің потенциалды өнімділігін жəне бейімделушілік қасиеттерін жүзеге
асыруды қамтамасыз ететін, өсімдік қалдықтарын белсенді шірітетін, фитопатогенді ауру
қоздырғыштарының дамуын тежейтін немесе шектейтін полифункционалды микроағзалар штамдарын
іздеу мен іс жүзінде қолдану ауыл шаруашылығы ғылымдарының саласындағы негізгі міндеттерінің
бірі. Топырақтағы целлюлозаны ыдыратушы микроағзалардың қызметін өсімдіктердің табиғи
көмекшілері ретінде пайдаланудың маңызы зор. Осыған орай Солтүстік Қазақстанның оңтүстік
24
карбонатты қара топырағынан бөлініп алынған Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ
штамдарының целлюлазалық жəне антагонистік белсенділік танытуы экологиялық егіншіліктің өзекті
мəселелерін шешуде қолдануға болатындығын айқындайды.
Ғылыми зерттеу жұмысының мақсаты Chaetomium туысына жататын целлюлозаны ыдыратушы
саңырауқұлақ штамдарының зертханалық жəне танаптық жағдайларда арпаның тамыр шірігі ауруының
қоздырғыштарына қарсы антагонистік белсенділігін анықтау.
Зерттеу əдістері
Тəжірибелер 2009 жылы зертханалық жəне танаптық жағдайларда С. Сейфуллин атындағы Қазақ
агротехникалық университетінің микробиология зертханасында мен Ақмола облысы, Целиноград
ауданына қарасты, Қосшы ауылындағы «Нива» шаруа қожалығында жүргізілді.
Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын бөліп алуға арналған топырақ үлгілері
А.И.Бараев атындағы Қазақ астық шаруашылығы ғылыми зерттеу институтынан əкелінді.
Н.А.Красильниковтың [6] сериялық сұйылту əдісі арқылы дайындалған топырақ суспензиялары
целлюлоза көзі қосылған Гетчинсон – Клейтонның қатты қоректік ортасына себілді. Chаetomium
туысына жататын саңырауқұлақтың 8 штамы бөлініп алынды.
Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын идентификациялау Т.С.Кириленко [7]
мен Н.П.Черепанованың [8] анықтағыштары қолданылды.
Chаetomium туысына жататын саңырауқұлақтардың негізгі ауру қоздырғыштарға антагонистік
қасиеті Н.А.Красильниковтың [6] ұсынған агарлы блок əдісімен зерттелді. Өсу жəне қарым-қатынас
сипаты өсірудің 7 тəулігінде анықталды. Chаetomium штамдарының гиперпаразиттік белсенділігі
Л.Л.Великанов жəне т.б. сандық бағалау шкаласы бойынша анықталды [9]. Өсірудің жетінші тəулігінде
патогеннің өсуінің тежелуі пайыздық мөлшерде келесі формула арқылы есептелді: Р = (К - А)/К 100,
мұндағы өсудің тежелуі, %; К – бақылаудағы өсу; А – Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ
штамдарының өсуі.
Бөлініп алынған штамдардың астық дақылдарының өсіп, өнуіне əсерін зерттеу үшін танаптық
тəжірибелер жүргізілді. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтың 3 штамының өсімдік
қалдықтарын шірітуде арпаның Донской сортының өсуі мен өнуіне əсерін салыстырмалы бағалау үшін
ұсақ мөлтекті танаптық тəжірибе жасалды.
Зерттеу нəтижелері
Зертханалық жағдайда Chaetomium туысы саңырауқұлақтарының антагононистік белсенділігін
зерттеу үшін целлюлозаны ыдыратушы жəне фитопатогенді саңырауқұлақтар Петри табақшасындағы
агарлы қоректік орталарға себілді. Петри табақшасындағы қос культура 25°С температурадағы
термостатқа өсіруге қойылды. 7 тəуліктен соң тест-ағзаның агарлы блогының айналасында
фитопатогенді саңырауқұлақтардың өсуінің тежелу аймағы анықталды.
Кестеде көрсетілгендей целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың барлық штамдары
фитопатогендердің өсуін тежегені байқалады (кесте 1).
Кесте 1 - Chaetomium саңырауқұлақтарының тамыр шірігі ауруын тудырушы фитопатогендердің өсуін
тежеуі
Штамм
Саңырауқұлақтардың тежелу аймағы, мм
A. tenius
B. sorokiniana
F. sporotrichiella
Бақылау
51.8±0,40
53.6±0,32
45.3±0,10
Ch. №1
6.8±0,03
5.9±0,08
7.6±0,11
Ch. №3
8.0±0,05
6.0±0,05
10.9±0,05
Ch. №4
8.0±0,09
12.8±0,34
12.3±0,12
F. sporotrichiella саңырауқұлағының тежелу аймағы 7.6 мм-ден 12.3 мм аралығында ауытқыды.
A. tenius саңырауқұлағының тежелуі 6.8 мм-ден 8.0 мм-ге дейінгі аймақты алып жатса, Bipolaris
sorokiniana саңырауқұлағында бұл көрсеткіш 5.9 – 12.8 мм құрады. Целлюлоза ыдыратушы
саңырауқұлақтарының ішінде антагонистік белсенділік Ch. spirochaete №4 штамдарында жоғары
болды. Əсіресе F. sporotrichiella фитопатогенді саңырауқұлағының өсуі қатты тежелді.
Гиперпаразиттік белсенділік Ch. angustum №1 жəне Ch. spirochaete №4 саңырауқұлақ
штамдарында айқын байқалды (сурет 1).
25
8 - F №7 + Ch. №1 штамдары; 2- В №15 +Ch. №1 штамдары; 18- A №41 +Ch. №1 штамдары.
Сурет 1 – Арпаның тамыр шірігі ауруын қоздырушы фитопатогенді саңырауқұлақтардың өсуінің
тежелуі
Ch. angustum №1 жəне Ch. spirochaete №4 патоген өскен ауданның 50-60% жаулап алды жəне
спора түзуі байқалды. Ch.angustum №3 саңырауқұлағының гиперпаразиттік белсенділігі 25-50%
аралығын қамтыды (кесте 2).
Кесте 2 – Chaetomium саңырауқұлақтарының фитопатогенді саңырауқұлақтармен қарым –қатынасы
жəне гиперпаразиттік белсенділігі
Штамм
Патоген мен антагонист арасындағы
Штамдардың гиперпаразиттік белсенділігі
қарым-қатынас
A. tenius B. sorokiniana F.sporotrichiell A. tenius B.
F. sporotrichiella
a
sorokiniana
Бақылау Ch. №1
А
А
А
2++
2
2+
Ch. №3
Б
Б
Б
1+
2
1
Ch. №4
Б
Б
А
2+
2
3++
2009 жылы танаптық жағдайда целлюлозаны ыдыратушы Cladosporium жəне Chaetomium
туысына жататын саңырауқұлақтардың өсімдіктердің тамыр шірігі ауруымен қарқынды зақымдалуы
мен дəнді дақылдардың өнімділігіне əсері зерттелді.
Арпаның тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы вегетациялық кезеңнің барысында
бақыланып отырды. Осы жылы аурудың дамуы 36.1%-дан 17.5%- ға дейін тежелсе, аурудың таралуы
61.5 –дан 34.4% -ға дейін шектелді. Тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы бақылаумен
салыстырғанда, 16.4% -53.2 жəне 24.3-63.2% төмендеген (кесте 3).
Жүргізілген танаптық сынақтар Донской арпа сортының өсуі мен дамуына айқын
ынталандырушы ықпалы бар целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың штамдарының
тиімділігін анықтауға мүмкіндік берді. Танаптық жағдайда жүргізілген құрылымдық талдау
нəтижелері өсімдіктерінің шығымына, масақтағы дəндерінің санына целлюлоза ыдыратушы
саңырауқұлақтардың жоғары деңгейде жағымды əсер ететінін көрсетті.
Кесте 3– Арпа егістігінде тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы
Нұсқа
Аурудың таралуы, %
Аурудың дамуы, %
Бақылау
73,6
47,6
Ch. №1
34,4
30,5
Ch. №3
61,5
36,1
Ch. №4
36,5
17,5
Арпаның өнімділігі Chaetomium саңырауқұлақтарының əр түрлі штамдарына байланысты 372.4 ден 472.2-ге дейін г/м2 ауытқыды. Chaetomium саңырауқұлағы штамдары аурудың дамуын шектеп,
өнімділікті орташа есеппен 24.1-79.8% арттырды (кесте 4). Өнімділіктің максимальды деңгейі Ch.
angustum №1 нұсқасын пайдаланған байқалады, өнімділік 488.4 г/м2 құрады.
Кесте 4 – Целлюлоза ыдыратушы саңырауқұлақтарын қолданылған арпаның Донской сортының
құрылымдық талдауының көрсеткіштері, 2009 ж.
Нұсқа
Сақталуы,
Өнімді
Өсімдік
Масақтың
МасақӨнімдідана
сабақтардың
биіктігі,
ұзындығы, см шалар-дың лігі,
26
саны, дана
Бақылау
Ch. №1
Ch. №3
Ch. №4
130
147
182
211
см
4,39
3,65
4,1
3,68
саны, дана
47,9
47,2
47,0
45,8
6,05
5,79
6,45
6,29
17,0
15,1
15,9
15,2
г/м2
327,3
488,4
372,4
472,2
Арпаның тамыр шірігі ауруына қарсы биологиялық тиімділігі дəндердің Ch. spirochaete №4
саңырауқұлағының штамдарымен өңделген мөлтектерінде байқалды (сурет 2).
63,2
80
60
35,9
40
20
32,98
24,1 26
18,25
0 0
0
бақылау Сһ. шт 1 Сһ. шт 3 Сһ. шт 4
биологиялық тиімділігі
Сурет 2 - Целлюлозаны ыдыратушы микроағзалармен инокуляцияланған Донской арпа сортының
биологиялық жəне шаруашылық тиімділігі
Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтармен өңделген арпа дəндерінің шаруашылық
тиімділігі Ch. angustum №1 штамдарының негізінде ең жоғары болды жəне 18.25% жəне 32.98% сəйкес
келді.
Жалпы алғанда целлюлоза ыдыратушы микроағзаларды арпа егістігінде пайдалану тамыр шірігі
ауруын тежеп, дақылдың ауруға төзімділігін жəне өнімділігін арттырды, бұл əрине, биологиялық жəне
шаруашылық тиімділігіне əсер етті.
Қорыта айтқанда тамыр шірігі ауруларының қоздырғыштарына целлюлозаны ыдыратушы
саңырауқұлақтардың ішінде Ch. spirochaete №.4 штамдары жоғары антагонистік белсенділік көрсетті,
оның фитопатогендерді тежеу аймағы 8.0 мм-12.8 мм аралығын құрады. Ch.angustum шт.1 жəне Ch.
spirochaete шт.4 саңырауқұлақтарының гиперпаразиттік белсенділіктері жоғары болды. Олар патоген
өскен ауданның 50-60% жаулап алып, қарқынды спора түзді. Ch.angustum шт.3 саңырауқұлағы 25-50%
гиперпаразиттік белсенділікке ие болды. Chaetomium саңырауқұлақтарының штамдары аурудың
таралуы мен дамуын 53.2 -63.2% шектеп, арпаның өнімділігінің артуына əкеп соқтырды. Chaetomium
туысына жататын саңырауқұлақтармен өңделген арпа дəндерінің шаруашылық тиімділігі Ch.angustum
шт.1 штамдарының негізінде ең жоғары көрсеткішке ие болды жəне 30.68% жəне 32.98% сəйкес
келді.
1. Каличкин В.К. Минимальная обработка почвы в Сибири: проблемы и перспективы //Земледелие. -2008. - №5. - С.
24-26.
2. Науанова А.П., Чуркина Г.Н. Биологическая активность черноземов Северного Казахстана. – Шортанды. 2007. - 137
с.
3. Семынина Т.М. Влияние агротехнических приемов на численность конидий Bipolaris sorokiniana в почве // Защита и
карантин растений. - 2008. - №9. - С.24-25
4. Тулемисова К.А., Мазунина В.И., Кулдыбаев М.М. Роль микробных метаболитов в повышении урожайности
растений.- А.: Наука. - 1981. -172 с.
5. Биологическая защита растений /под ред. Н.Н. Штернсис. - М.: Колос. - 2004. - 264 с.
6. Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. - М.: МГУ. - 1966. -215 с.
7. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов. – Киев: Наук. Думка. - 1978. - 264 с.
8. Черепанова Н.П. Сумчатые грибы рода Cheatomium. - Л.: Изд. Ленин. ун-та. - 1989. - 168 с.
9. Великанов Л.Л., Сухоносенко Е.Ю., Николаева С.И., Завелишко И.А. Сравнение гиперпаразитической и
антибиотической активности изолятов рода Trichoderma Pers.: FR. и Gliocladium Virens Miller, Giddens et Foster по
отношению к патогенам, вызывающим корневые гнили гороха //Микол. и фитопатология. -1994. - Т.28. - вып.6. -С.52-56.
***
В этой статье исследованы в лабораторных и полевых условиях фунгицидные свойства целлюлозоразрушающих
грибов рода Chaetomium против возбудителей корневой гнили ячменя Fusarium и Bipolaris. В результате антагонистических
27
свойств грибов рода Chaetomium исследования полученные данные в лабораторных условиях были подтверждены на полеых
опытах.
***
In this article exploring in laboratory and field conditions fungicidal quality of cellulosadestruction mushrooms Chaetomium
against stimuli rooted decay of barley mushrooms Fusarium and Bipolaris. In result antagonistic qualities of mushrooms Chaetomium
investigations obtained datum in laboratory conditions there were confirmated on field experiences
С.А. Аленькина, К.А. Трутнева, В.Е. Никитина
ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СОДЕРЖАНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В
КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
(Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов (Россия),
е-mail: [email protected]
В настоящей работе изучено в динамике изменение эндогенного содержания и соотношение свободной и связанной
форм салициловой кислоты в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов двух штаммов азотфиксирующих
ассоциативных бактерий рода Azospirillum – A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A.brasilense
Sp7.2.3. Установлены различия в ответной реакции растений на воздействие лектинов этих двух штаммов. Полученные
данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны выступать в качестве индукторов адаптационных
процессов корней проростков пшеницы
Необходимым условием развития экологического земледелия является создание методов и
технологий формирования, поддержания эффективного функционирования высокоинтегрированных
микробно-растительных систем, сочетающих в себе полезные свойства и растений, и
микроорганизмов. В настоящее время информации о функционировании ассоциативных симбиозов
пока еще недостаточно для глубокого понимания этого явления, и многие вопросы остаются пока
неясными. Кроме общепризнанных ведущих факторов, синтеза фитогормонов и вклада в азотное
питание растений за счет фиксации молекулярного азота, несомненно, существует и ряд других
аспектов позитивного воздействия микропартнера ассоциативного симбиоза на жизнедеятельность
макропартнера.
Учитывая функциональные особенности гемагглютинирующих белков азоспирилл было
выдвинуто предположение, что лектины наряду с другими поверхностными структурами способны
участвовать не только в адгезии бактерий на корнях растений [1], но и влиять на метаболизм
растительной клетки. Действительно, оказалось, что лектины способны стимулировать прорастание
семян [2], проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую
активности [3, 4], изменять уровень сигнальных соединений - цАМФ, оксида азота (NO), перекиси
водорода в корнях проростков пшеницы, и тем самым участвовать в формировании защитных реакций
растений [5, 6].
Частью защитных реакций растений является увеличение уровня салициловой кислоты (СК) в
растительной клетке. Известно, что под воздействием различных биогенных факторов содержание СК
в тканях растений может возрастать в десятки раз [7].
Задачей настоящего исследования явилось изучение влияния лектинов азоспирилл на
содержание СК в корнях проростков пшеницы.
Объектом исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода
Azospirillum – A. brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии РАН (г. Москва) и A.
brasilense Sp7.2.3 – мутант по лектиновой активности [8], а также корни проростков пшеницы (Triticum
aestivum L.) сорта Саратовская 29.
Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в
течение 18 ч [9].
Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом Eshdat и Sharon [10].
Очищенные препараты лектинов получали ранее описанным способом [5].
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [11].
В работе использовали 3-суточные проростки пшеницы. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным
этанолом и проращивали на дистиллированной воде при 22°С.
Для изучения влияния лектинов на содержание СК корни проростков инкубировали с
растворами лектинов в течение двух часов. Контролем служили корни, не обработанные растворами
лектинов.
Получение свободной и связанной форм СК проводили по методу, изложенному в работе [12]. 1г
корней был тщательно отмыт дистиллированной водой и фиксирован горячим 96%-ным этанолом.
28
Корни гомогенизировали, затем СК экстрагировали из корней 80% кипящим этанолом. Экстракт был
разделен на две части для получения свободной и связанной форм СК. Определение содержания СК
проводили на газовом хроматографе Shimatzu GH-2010 (Япония) с использованием колонки Eguity-1
(Supelco) при температуре 200°.
ФАЛ (КФ 4.3.1.5) экстрагировали из тканей проростков 0.1 М боратным буфером с рН 8.8 при
+4°С в течение 30 мин при соотношении масса:объем 1:17. Реакционная смесь состояла из 0.1 мл
ферментного препарата и 0.4 мл боратного буфера рН 8.8, содержащего 12 мМ L-фенилаланина. В
контроль вместо фермента добавляли 0.1 мл боратного буфера. Реакционную смесь инкубировали в
течение 1 ч при 37°С. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом по
изменению оптической плотности при 290 нМ. Активность ФАЛ выражали в единицах оптической
плотности (ΔЕ/г сырой массы)[13].
Опыты проводили в 3-кратной биологической и 5-кратной аналитической повторностях.
Цифровой материал обработан статистически с помощью программы «Анализ данных электронных
таблиц Microsoft Excel». В таблицах приведены средние арифметические из всех определений и их
стандартные отклонения.
Как уже было отмечено выше, в работе были исследованы лектины двух штаммов азоспирилл –
A. brasilense Sp7 и мутантного штамма A. brasilense Sp7.2.3. Лектины этих двух штаммов являются
гликопротеинами, выделенными с поверхности бактериальных клеток с молекулярной массой 36 кДa и
специфичностью к L-фукозе и D-галактозе [8]. Лектин мутантного штамма отличался от лектина
родительского штамма антигенными свойствами. Предыдущими исследованиями было показано, что
эти белки обладают различной функциональной активностью [2-6].
Изменение содержания СК в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов
родительского и мутантного штаммов свидетельствует о том, что они оказывают заметное влияние на
этот показатель. Для исследований были взяты четыре концентрации лектинов - 5, 10, 20, 40 мкг/мл. В
ходе проведенных экспериментов мы измеряли количество свободной и конъюгированной форм СК,
поскольку формы СК легко переходят одна в другую и при этом обладают разной биохимической и
физиологической активностью [14]. Результаты показали, что лектины изменяли содержание СК лишь
через час инкубации с корнями. Оба лектина вызывали увеличение концентрации свободной и
уменьшение концентрации конъюгированной форм СК при всех изучаемых концентрациях. Для
лектина родительского штамма наблюдалось снижение эффекта с увеличением концентрации лектина.
Максимум увеличения свободной СК отмечался при концентрации 5 мкг/мл, Для лектина мутантного
штамма максимальное значение наблюдалось при 10 мкг/мл. Что касается связанной формы СК, то для
обоих штаммов с увеличением концентрации происходило снижение оказываемого лектинами
эффекта. Максимальное снижение происходило при концентрации лектинов – 5 мкг/мл. Лектин
мутантного штамма по сравнению с лектином родительского штамма наиболее эффективно
увеличивал количество свободной СК и менее эффективно изменял содержание связанной формы СК.
Как видно из рис.1 количество образовавшейся свободной СК и количество гидролизованной
связанной СК неравнозначно, особенно в случае с лектином мутантного штамма.
В связи с этим возникает вопрос, является ли аккумуляция СК результатом только гидролиза
конъюгатов, или же наряду с процессом гидролиза происходит и ее синтез de novo. Для ответа на этот
вопрос определяли активность фермента, ответственного за синтез СК – фенилаланин-аммиак-лиазы.
мкг/г сырой массы
A. brasilense Sp7
A. brasilense Sp7.2.3
10
8
6
4
2
0
1
2
контроль
лектин 10 мкг/мл
лектин 40 мкг/мл
1
2
лектин 5 мкг/мл
лектин 20 мкг/мл
Рисунок 1. Содержание конъюгированной (1) и свободной (2) форм СК в корнях проростков
пшеницы в контроле и при предобработке лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3
Как показали результаты, индукция активности ФАЛ происходила как в случае с лектином
родительского, так и мутантного штамма, но лектин мутантного штамма в данном случае проявлял
29
большую активность, особенно при концентрации – 10 мкг/мл. Из рис. 1 и табл. 1 видно, что при
воздействии лектина мутантного штамма прослеживается очень четкая корреляция между изменением
содержания свободной СК и активностью ФАЛ в корнях для изучаемых концентраций лектина, что не
отмечается при инкубации с лектином родительского штамма.
Таблица 1. Активность ФАЛ в корнях проростков после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7
и Sp7.2.3
Обработка
Активность ФАЛ, %
Вода (контроль)
Лектин A. brasilense Sp7 - 5 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7 - 10 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7 - 20 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7 - 40 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 5 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 10 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 20 мкг/мл
Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 40 мкг/мл
100 ± 3
115 ± 5
105 ± 4
110 ± 6
120 ± 3
150 ± 4
210 ± 3
110 ± 9
105 ± 3
Полученные результаты свидетельствуют о том, что лектины повышают активность βглюкозидазы, о чем свидетельствуют ранее полученные нами данные [3], которая превращает
конъюгированную форму СК в свободную и активируют ФАЛ, отвечающую за синтез СК. Однако
степень участия лектинов в первом и во втором случае различна. Лектин родительского штамма
обладает большей регулирующей активностью по отношению к β-глюкозидазе, лектин же мутантного
штамма – к ФАЛ.
Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны выступать в
качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.
1. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли клеточной поверхности
азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология.- 1996.- Т. 65.- № 2.- С. 165-170.
2. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Влияние лектинов азоспирилл на способность
семян к прорастанию // Известия АН. Серия биологическая.- 2004.- № 4.- С.- 431-435.
3. Alen’kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic
enzymes // Plant and Soil.- 2006.- V. 283.- № 1-2.- P. 147-151.
4. Чернышева М.П., Аленькина С.А., Никитина В.Е., Игнатов В.В. Внеклеточные протеолитические ферменты
штамма Azospirillum brasilense Sp7 и регулирование их активности гомологичным лектином // Прикл. биохимия и
микробиология.- 2005.- Т. 41.- № 4.- С. 444 - 448.
5. Аленькина С.А., Матора Л.Ю., Никитина В.Е. Оценка влияния лектинов азоспирилл на уровень цАМФ в
растительной клетке // Микробиология.- 2010.- Т. 79.- №6.- С. 856-858.
6. Аленькина С.А., Никитина В.Е. Изменение содержания оксида азота в корнях проростков пшеницы под влиянием
лектинов азоспирилл // Доклады РАСХН.- 2011.-Т. 79.- №6.- С. 12-14.
7. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота. // Прикл.
биохимия и микробиология.- 2007.- Т. 43.- №4.- С. 405-411.
8. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта по лектиновой активности //
Микробиология.- 1998.- T. 67.- № 6.- C. 782-787.
9. Sadasivan L., Neyra C.A Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum // J. Bacteriol.1985.- V. 163.P. 716-723.
10. Echdat Y., Ofek I., Yachow-Yan Y., Sharon N., Mirelman D. Isolation of mannose-specific lectin from E.coli and its role
in the adherence of the bacterial to epithelial cells // Biochem. Biophis. Res. Commun. // Biochem. Biophis. Res. Commun.- 1978.- V.
85.- P. 1551-1559.
11. Bradford M. M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding // Anal. Biochem.- 1976.- V. 72.- P. 248-254.
12. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Свободная и коньюгированные формы салициловой кислоты:
содержание и роль в картофеле // Прикл. биохимия и микробиология. -2005.- Т. 41.- №3.- С. 1-4.
13. Zucker M. Induction of phenylalanine ammonialyase in Xaritin leaf disk. Photosythetic reguirement and effect of daylegth // Plant Physiol.- 1969.- V. 44.- P. 91-112.
14. Тарчевский И.А., Максютова Н.Н., Яковлева В.Г., Гречкин А.Н. Янтарная кислота – миметик салициловой
кислоты // Физиология растений.- 1999.- Т.46.- №1.- С. 23-28.
30
УДК 637.
М.К. Алимарданова, С.А. Надирова, А.Б. Султанбекова
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО БЕЛКОВО–
УГЛЕВОДНОГО СЫРЬЯ
(Алматинский технологический университет)
В настоящее время на современном уровне развития промышленности, в производстве продуктов
питания огромное значение придается экономии сырьевых ресурсов, снижению их себестоимости и
выпуску продуктов высокого качества.
Известно, что сыворотка - это ценный молочный продукт, укрепляющий здоровье,который
получается при изготовлении сыра или творога. Сыворотка практически не содержит жиров, в то же
время богата ценными белками.
В молочную сыворотку переходят практически все соли и микроэлементы молока, а также
водорастворимые витамины, причем в подсырной сыворотке их значительно больше, чем в творожной.
Выявлено, что в сыворотке содержатся такие ценные минеральные вещества, как калий, кальций,
магний, фосфор, а также много витаминов.
Палитраэнергетические вещества и различные минеральные соли сыворотки позволяет
использовать его в качестве основы различных диет.
Спектр лечебного действия сыворотки очень широк: улучшение работы почек и нормализация
функции печени; улучшение кровообращения и предотвращение развития атеросклероза;
положительное воздействие на нервную систему; профилактика заболеваний сердечно-сосудистой
системы, желудочно-кишечного тракта, сосудов головного мозга, сахарного диабета.
Основной составной частью сухих веществ молочной сыворотки является лактоза, массовая доля
которой составляет более 70 °/о сухих веществ сыворотки. Особенностью лактозы является ее
замедленный гидролиз в кишечнике, в связи с чем ограничиваются процессы брожения, нормализуется
жизнедеятельность полезной кишечной микрофлоры, замедляются гнилостные процессы и
газообразование. Кроме того, лактоза в наименьшей степени используется в организме для
жирообразования.
Сывороточные белки содержат в своем составе больше незаменимых аминокислот, чем казеин,
являются полноценными белками, которые используются организмом для структурного обмена, в
основном для синтеза белков печени, образования гемоглобина и плазмы крови.
Доказано, что состав белков молочной сыворотки больше соответствует составу белков женского
молока, чем состав белков коровьего молока, что позволяет использовать белки сыворотки в
производстве детских молочных продуктов. Особенностью молочного жира сыворотки является более
высокая, чем в молоке, степень его дисперсности, что положительно влияет на его усвояемость.
Содержание составных частей молока и биологические свойства сыворотки позволяют отнести ее
к ценному промышленному сырью, которое можно переработать в различные пищевые и кормовые
средства.
Благодаря своему мягкому вкусу молочная сыворотка сочетается практически со всеми
продуктами: применяется как ингредиент различных коктейлей, при выпечке хлебобулочных изделий
и т.д.
Таким образом, молочная сыворотка и продукты из нее являются незаменимыми в питании
пожилых людей и людей с избыточной массой тела, а также с малой физической нагруженностью.
В Алматинском технологическом университете в течение ряда лет проводятся исследования
возможности использования сыворотки для создания напитков, а также для выделения мембранными
технологиями концентратов сывороточных белков с целью дальнейшего применения их для
фортификации пищевых продуктов и создания функциональных продуктов питания.
Одним из путей использования молочной является выпуск продуктов на основе молочной
сыворотки с натуральными ингредиентами, приносящими пользу здоровью людей, повышающими его
сопротивляемость заболеваниям, способные улучшить многие физиологические процессы в организме,
позволяющие человеку долгое время сохранять активный образ жизни.
Широкие перспективы при производстве продуктов с натуральными ингредиентами на основе
молочной сыворотки возникают при применении в качестве обогатителей продуктов местного
фитосырья. Сырьевые возможности позволяют удовлетворить пищевую промышленность в этих видах
сырья.
31
1. Крусь Н., Тиняков В.Г., Фофанов Ю.Ф., «Технология молока и оборудование предприятий молочной
промышленности», -М.: Агропромиздат, -1986.
2. Берман C.JI. «Углеводы молока». Труды Вологодского молочного института. вып. № 3, -Москва; -1966.
25-43 с.
3. Горбатова К.К. «Биохимия молока и молочных продуктов». Легкая и пищевая промышленность, -Москва;
-1984. -344 с.
4. Храмцов А.Г., Евдокимов И.А. «Рациональная переработка молочной сыворотки». Молочная
промышленность, вып. №4, -Москва; -1996. С. 10-12.
5. Храмцов А.Г. и др. «Молочная сыворотка: переработка и использование». «Сыроделие». – Москва; -1999.
- №2. -С. 23-25.
6. Алимарданова М.К. «Комбинированные функциональные продукты и их роль в питании», -Алматы; 2006. -52 с.
7. Алимарданова М.К. «Казахские национальные молочные продукты», - Алматы; -2006. -176 с.
УДК 579.083.13:579.22
К.Х. Алмагамбетов, З.С. Сармурзина, Н.Б. Молдагулова, Г.К. Абитаева
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ
(РГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» КН МОН РК)
Развитие фармтехнологий, основанных на применении лекарственных средств растительного
происхождения особо актуально [1, 2]. Растительные лекарственные средства, производимые
отечественными фармпроизводителями применяются при лечении самых различных заболеваний
соматического, инфекционного и онкологического генеза [3-6]. Вместе с тем совершенно недостаточно
исследовано влияние оригинальных фитопрепаратов на нормальную микрофлору кишечника, на ее
резидентных и транзиторных представителей. А подобные исследования уместны в силу широкой
распространенности дисбактериоза кишечника [7].
Материалы и методы
Использованы СО2-экстракты салсоколлина, экдифита, атеролида, саусалина, гроссгемина,
арглабина нативного, пиностробина и эфирные масла аяфрола и эферола. Изучено их влияние на
представителей микрофлоры кишечного биотопа - Lactobacillus fermentum, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и Klebsiella ozaenae. Оценивались жизнеспособность и
биологические свойства данных микроорганизмов при культивировании их на питательных средах,
содержащих различные концентрации (от 0,000032 до 0,02 г/мл)
вышеперечисленных
фитосубстанций. Оценивалась антагонистическая активность L. fermentum по отношению к тесткультурам: E. coli, Ser. marcescens, Pr.mirabilis, Kl. ozaenae, S. aureus и Candida albicans методом
отсроченного антагонизма. Для изучения плазмокоагулазной активности St. aureus использовали
сухую цитратную кроличью плазму (ЗАО «БИОЛЕК», Украина). Определение гемолитической
активности Str. pyogenes осуществляли путем посева на 5% кровяной агар. Оценка антимикробной
активности фитосубстанций.
Результаты и обсуждение
Исследована жизнеспособность микроорганизмов на питательных средах, содержащих
фитосубстанции эндемичных лекарственных растений в различных концентрациях (0,02; 0,004; 0,0008;
0,00016; 0,000032 г/мл). На таблицах 1 и 2 приведены данные о влиянии на микроорганизмы
кишечного биотопа фитосубстанций в 2-х концентрациях: минимальной - 0,000032 и максимальной 0,02 г/мл. В минимальной концентрации
все
фитосубстанции не оказывали влияния на
жизнеспособность микроорганизмов, за исключением арглабина и саусалина, которые
слабо
ингибировали рост S. aureus. В максимальной концентрации (0,02 г/мл) фитосубстанции эффективно
подавляли жизнеспособность микроорганизмов (табл.1).
Таблица 1 - Влияние фитосубстанций на жизнеспособность микроорганизмов
Фитосубстанции
арглабин
салсоколлин
атеролид
саусалин
экдифит
L. fermentum
+++
+++
+++
S. aureus
+++
+
+++
+++
32
Str. рyogenes
+++
+++
+++
E. coli
+++
++
-
Kl. оzaenae
+++
+++
гроссгемин,
++
++
++
+++
+++
пиностробин
+
+
+
++
аяфрол
+
+++
эферол
+++
+++
Примечание: (+++) - высокая ингибирующая активность, (++) - средняя, (+) – слабая, (-) –
отсутствует.
Все фитосубстанции в концентрациях от 0,000032 до 0,04 г/мл практически не влияют на
антагонистическую активность лактобацилл по отношению к тест-культурам, за исключением
гроссгемина и пиностробина, которые ингибируют активность лактобацилл по отношению к Candida.
Наряду с изучением возможного негативного влияния фитосубстанций на полезную
антагонистическую активность резидентных представителей кишечной микрофлоры - лактобацилл,
также практически значима оценка влияния фитосубстанций на плазмокоагулазную активность
стафилококков и гемолитическую - стрептококков.
Оказалось, что низкие концентрации фитосубстанций не оказывали влияния на время
свертывания кроличьей плазмы культурой S. aureus. Но максимальная концентрация (0,02 г/мл) почти
всех фитосубстанций задерживала время свертывания плазмы на протяжении 2, 3 и 6 часов
наблюдения. Свертывание плазмы отмечено лишь к 18 часу наблюдения. А арглабин, экдифит,
саусалин и эферол полностью ингибировали плазмокоагулазную активность S. aureus (в течение 2-24
часов наблюдения свертывания плазмы не отмечено). Вместе с тем атеролид, даже в максимальной
концентрации не оказывал влияния на плазмокоагулазную активность стафилококков.
Гемолитическая активность пиогенного стрептококка при культивировании в питательной среде,
содержащей фитосубстанции атеролида, гроссгемина и пиностробина не изменяется. Но арглабин,
саусалин и экдифит в концентрациях 0,02 и 0,004 г/мл полностью ингибируют данную активность Str.
рyogenes (табл.2).
Таблица 2 - Влияние фитосубстанций на гемолитическую активность Str. рyogenes (зона гемолиза, в
см)
Фитосубстанции
Концентрации фитосубстанций (г/мл )
0,02
0,004
0,0008
0,00016
0,000032
контроль
арглабин
10,0
10,0
9,0
9,0
салсоколлин
8,0
8,0
8,0
8,0
9,0
атеролид
9,0
9,0
9,0
9,0
8,0
9,0
саусалин
10,0
9,0
9,0
9,0
экдифит
10,5
10,0
10,0
9,0
гроссгемин,
11,0
12,0
12,0
13,0
12,0
12,0
пиностробин
11,0
10,0
10,0
11,0
12,0
10,0
аяфрол
12,0
13,0
12,0
12,0
12,0
эферол
11,0
13,0
12,0
12,0
12,0
Примечание: (-) – отсутствие зоны гемолиза
Таким образом, фитосубстанции, исследованные in vitro в концентрациях сопоставимых c
терапевтическими дозами оказывают влияние на жизнеспособность и биологические свойства
микроорганизмов, представителей кишечного биотопа. Так арглабин, саусалин, экдифит и гроссгемин
в максимальной концентрации подавляют жизнеспособность всех исследованных микроорганизмов. А
салсоколлин и атеролид, наоборот, практически не оказывают влияния на их рост и размножение.
В последующих исследованиях предполагается оценить влияние фитосубстанций на кишечный
микробиоценоз в опытах на лабораторных животных, in vivo.
1.С.М.Адекенов Актуальные проблемы развития отечественной фармацевтической отрасли.//Фармацевтический
бюллетень.2011.-№№ 3-4.- С.11-18.
2. Васильев A.B., Полоз Т.П., Соколов H.H. Лекарственные растения России неиссякаемый источник для создания
новых высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов и БАД // Вопросы медицинской химии №2,2000;
3. Смагулов М.К., Ахметова С.Б., Садырбеков Д.Т., Алмагамбетов К.Х., Атажанова Г.А., Адекенов С.М. Химический
состав и антимикробная активность эфирного масла аянии кустарничковой (Ajania fruticulosa (Ldb.) Poljak).// В сб. «Химия и
применение природных и синтетических биологически активных соединений» Алматы.-2004.-с.155-160.
4. Ахметова С.Б., Смагулов М.К., Аксартов Р.М., Адекенов С.М. Антимикробная активность сесквитерпеновых
лактонов и их производных.// Российский биотерапевтический журнал.-2005.-т.3.-№1.-с.83-84.
5. Drozd J., Anuszewska E. The influence of plant raw materials, containing ellagic acid and selected antibiotics on
immunological response in mice.// Acta Pol. Pharm.–2005.– Vol. 62, N 3.– P. 237–240.
33
6. Федорова Ю.С., Кузнецов П.В., Сухих А.С., Карелина О.А., Герасимова Р.Н. Сравнительная оценка
антибактериальной активности фитопрепаратов из некоторых видов растений рода Hedysarum (Сем. Fabaceae). //
Фармацевтические науки. – 2011, №3. – С. 2107. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых // КМК Scientific Press. М. 2003. - 220 с.
***
Мақалада өсімдік экстрактылары (салсоколлин, экдифит, атеролид, саусалин, гроссгемин, арглабин нативный,
пиностробин) мен эфир майларының (аяфрол, эферол) микроорганизмдерінің биологиялық құрамына əсерін зерттеудің
нəтижелері көрсетілген. Бұл препараттардың тіршілік қабілеттілігі мен биологиялық белсенділігі əртүрлі концентрацияда
(0,000032-ден 0,02 г/мл дейін) Lactobacillus fermentum, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli жəне
Klebsiella ozaenae зерттелді.
***
The results of investigation of the effect of plant extracts (salsokollin, ekdifit, aterolid, saussalin, grossgemin, Arglabin native,
pinostrobin) and essential oils (ayafrol and eferol) on the biological properties of microorganisms presents this article. These drugs
were studied at different concentrations (from 0,000032 to 0,02 g / ml) on the index of viability and biological activity of Lactobacillus
fermentum, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli and Klebsiella ozaenae.
Л.И. Антоновская, Н.А. Белясова, И.П. Рокало
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ
СТЕПЕНИ БАКТЕРИОСТОЙКОСТИ МАТЕРИАЛОВ
(Белорусский государственный технологический университет, e-mail: [email protected])
Введение. Исходя из литературных данных [1], одной из серьезных проблем, с которыми
сталкиваются различные отрасли промышленности, является проблема биоповреждения материалов и
изделий. Понятно, что биокоррозия сокращает срок службы изделий и приводит к нарушению
режимов технологических процессов, однако серьезность этой проблемы состоит не только в порче
или разрушении материалов и изделий, но в том, что биоповреждения материалов зачастую могут
приводить к угрозе здоровья и жизни людей, поскольку бактерии и грибы, повреждающие материал,
могут быть причиной аварий, а также источником кожных, аллергических и других заболеваний.
Для решения этой проблемы в состав материалов вводят биоцидные вещества или наносят
защитные покрытия с антимикробными свойствами, эффективность которых должна быть адекватно
оценена.
Используемые на сегодняшний день методы оценки степени бактериостойкости материалов
обладают рядом существенных недостатков, ограничивающих их применение. Среди широко
используемых методов выделяют качественные, основанные на визуальной оценке степени
бактериостойкости материалов и количественные, основанные, либо на определении выживаемости
клеток в присутствии биозащищенного материала, либо на определении диаметра зон ингибирования
роста бактерий.
Целью нашей работы являлась разработка совершенно новых подходов для количественной
оценки степени бактериостойкости материалов, основанных на использовании метаболических
особенностей бактерий.
Объекты и методы исследований. Объектами исследования служили синтезированные в
ГНУ «Институт общей и неорганической химии» НАН Беларуси коррозионностойкие полимерные
композиции (КПК), предназначенные для использования в качестве биозащитных покрытий изделий и
конструкций из металла, эксплуатируемых в условиях повышенного содержания микроорганизмов, в
частности для защиты оборудования нефтяного комплекса. Из литературных данных [2, 3] известно,
что наиболее активными микроорганизмами, повреждающими материалы и изделия в данной отрасли
промышленности, являются сульфатредуцирующие бактерии (СРБ). Следовательно, в качестве тесткультур при оценке бактериостойкости КПК использовали выделенные нами из образцов промывных
вод нефтеперерабатывающего комплекса сульфатредуцирующие бактерии Desulfovibrio LSL-1,
которые осуществляют специфический способ запасания энергии – «сульфатное» дыхание,
сопровождающееся диссимиляционным восстановлением сульфатов с образованием сероводорода и
сульфидов.
Кроме КПК в качестве объектов исследования в данной работе использовали созданные в
лаборатории химии тонких пленок НИИ «Физико-химических проблем БГУ» керамические фильтры
(КФ), поверхность пор которых модифицирована наночастицами серебра. Необходимость биозащиты
этих материалов возникла в связи с тем, что при длительной их эксплуатации на поверхности
образуются заметные невооруженным глазом скопления микроорганизмов (биообрастания), которые
значительно ухудшают гидродинамическую проницаемость фильтров. Как показали наши предыдущие
34
исследования [4], наиболее часто в составе биобрастаний фильтрующих элементов встречаются
представители рода Pseudomonas. Поэтому, в качестве тест-культур при оценке бактериостойкости КФ
использовали выделенные нами из состава биообрастаний облигатно аэробные бактерии Pseudomonas
aeruginosa Р-С.
В качестве арбитражного для оценки бактериостойкости исследуемых материалов
использовали разработанный нами ранее и аттестованный в Белорусском государственном институте
метрологии (БелГИМ) адсорбционно-титриметрический метод [5], который заключается в
определении количества молочной кислоты, образующейся в культуральной жидкости за счет
жизнедеятельности адсорбированных на поверхности материала жизнеспособных клеток
молочнокислых бактерий. Концентрацию накопившейся молочной кислоты определяли кислотноосновным титрованием. Для дифференцировки испытуемых образцов материалов на биозащищенные
и незащищенные использовали относительный параметр степени бактериостойкости (DS). Материал
признается бактериостойким, если DS ≥ 0.45.
Для сравнения результатов оценки степени бактериостойкости образцов КПК по отношению к
сульфатредуцирующим бактериям использовали качественный метод, положенный в основу
ГОСТ 9.085–78 [6], который заключается в совместном инкубировании исследуемых образцов и СРБ в
питательной среде, содержащей железо, с последующей визуальной регистрацией образования черных
зон сульфида, которые учитываются при оценке бактериостойкости по трехбалльной шкале.
Результаты и их обсуждение. Для количественной оценки антибактериальных свойств КПК
нами разработан анаэробно-суспензионный метод. Его суть заключается в определении содержания
сероводорода в культуральной жидкости после совместного инкубирования сульфатредуцирующих
бактерий с исследуемыми образцами КПК в анаэробных условиях. При этом меньшее количество
сероводорода в культуральной жидкости является отражением более выраженных антибактериальных
свойств
исследуемого
материала.
Регистрацию
количества
сероводорода
проводили
фотоколориметрически на основе цветной реакции образования метиленового синего.
Для уменьшения влияния различного рода факторов на показатели, позволяющие судить о
степени бактериостойкости анализируемых материалов в анаэробно-суспензионном методе,
разработали относительный количественный параметр степени бактериостойкости ( AH S , отн. ед.),
2
который показывает во сколько раз уменьшается метаболическая активность СРБ при инкубировании с
биозащищенным образцом по сравнению с контролем.
AH2S  1 
где
Cî áð.
CK
(1)
,
– концентрация сероводорода в пробе культуральной жидкости (КЖ) с образцом
Cî áð.
материала, содержащим биоцидную добавку, мг/дм3; CK – средняя (по результатам трех измерений)
концентрация сероводорода в контрольной пробе КЖ, мг/дм3.
За результат принимали среднее арифметическое ( AH S ) трех параллельных определений параметра
степени бактериостойкости для каждой из трех проб КЖ с образцом материала, содержащим биоцидную
добавку.
Установлено, что для нескольких серий образцов КПК зависимость между параметрами AH S и
DS носит линейный характер и с ее помощью найдено пограничное значение параметра AH S , которое
составило 0.68 (соответствует параметру DS=0.45). Образцы КПК, для которых AH S ≥ 0.68 следует
считать бактериостойкими.
В табл. 1. Приведены результаты определения антибактериальных свойств нескольких новых
образцов КПК с помощью двух методов.
Табл. 1 – Степень бактериостойкости образцов КПК
Образец
КПК1
КПК2
КПК3
КПК4
КПК5
AH S , отн.ед.
0.92
0.90
0.91
0.45
0.50
0.65
0.61
0.63
0.27
0.31
DS , отн.ед.
2
2
2
2
2
Из представленных в табл. 1 данных следует, что как с помощью параметра DS, так и с помощью
параметра AH S , исследованные образцы КПК располагаются в ряду по степени ухудшения их
антибактериальных свойств: КПК1 → КПК3→ КПК2 → КПК5 → КПК4.
Иными словами, результаты оценки степени бактериостойкости материалов, полученные с
помощью анаэробно-суспензионного метода полностью совпали с результатами, полученными с
помощью арбитражного адсорбционно-титриметрического метода.
2
35
Поскольку в арбитражном адсорбционно-титриметрическом методе в качестве тест-культуры
использовали молочнокислые бактерии, а исследуемые покрытия разработаны для защиты
металлических изделий от биологического обрастания и биокоррозии под действием СРБ, сочли
целесообразным сравнить полученные результаты с результатами качественного метода, положенного
в основу ГОСТ 9.085–78 [4].
На рис. 1 представлены результаты оценки степени бактериостойкости образцов КПК,
полученные с помощью ГОСТ 9.085–78 .
Рис. 1 – Культуральные гели Desulfovibrio sp. LSL-1 после совместного инкубирования с образцами
КПК
Из рис. 1 видно, что лучшие антибактериальные свойства проявляют образцы КПК1, КПК2, и
КПК3 (0 баллов по ГОСТ 9.085–78), а образцы КПК4 и КПК5 вообще не способны ингибировать
развитие бактерий (II балла по ГОСТ 9.085–78).
Эти данные подтверждают полученные с помощью разработанного метода результаты:
действительно, антибактериальные свойства образцов КПК4 и КПК5 оцениваются параметром AH S , не
достигающим значения 0,68, и их нельзя считать бактериостойкими.
Таким образом, можно заключить, что разработанный анаэробно-суспензионный метод дает
более адекватную оценку антибактериальным свойствам материалов, чем стандартный качественный
метод по ГОСТ 9.085–78.
Для оценки антибактериальных свойств КФ нами был разработан количественный метод,
основанный на оценке респираторной активности облигатно-аэробных бактерий. В основу метода
положено инкубирование бактерий P. aeruginosa Р-С в питательной среде с биозащищенным
материалом и определения дыхательной активности клеток. Контролем служила суспензия бактерий в
среде без материала. Регистрацию кислорода в культуральной жидкости осуществляли с
использованием кислородомера АЖА-101МА. Получали графические зависимости концентрации
растворенного кислорода в культуральной жидкости с биозащищенным материалом и без него от
длительности инкубирования. Для каждой кривой задавали аппроксимацию полиномом степени,
соответствующей уровню достоверности аппроксимации R2≥0,995. В качестве показателя
антибактериальной активности использовали коэффициент эффективности ингибирования дыхания
клеток EI , который рассчитывали по формуле:
EI 
(2)
EI 
2
EI  min
где
EI 
– коэффициент эффективности ингибирования дыхания клеток для опытного образца;
EI  min – коэффициент эффективности ингибирования дыхания клеток для контрольного образца.
T
EI  
 c(t )dt
(3)
0
T
где c(t ) – уравнение зависимости концентрации растворенного кислорода в среде от
длительности инкубирования, полученное в результате аппроксимации, мг/дм3; T – длительность
инкубирования, мин.
Основывались на допущение, что антибактериальные свойства материалов выражены тем
сильнее, чем выше показатель EI .
Результаты оценки антибактериальных свойств материалов по респираторной активности
облигатно аэробных бактерий в сравнении с арбитражным адсорбционно-титриметрическим методом
[5] приведены в табл. 2.
Табл. 2 – Степень бактериостойкости образцов КФ
Образец
КФ31
КФ32
КФ33
1.30
1.21
1.22
EI , отн.ед.
Концентрация молочной
2.26·10-3
3.27·10-3
3.15·10-3
кислоты, моль/дм3
36
Используя метод оценки антибактериальных свойств материалов по респираторной активности
облигатно аэробных бактерий, удалось показать (табл. 2), что образец КФ31 демонстрирует более
выраженные антибактериальные свойства, чем образцы КФ32 и КФ33, что подтверждается результатами,
полученными с помощью арбитражного адсорбционно-титриметрического метода.
Поскольку молочнокислые бактерии, используемые в качестве тест-культур в арбитражном
адсорбционно-титриметрическом методе не учувствуют в процессе биообрастания фильтрующих
элементов, провели дополнительные исследования по оценке степени бактериостойкости КФ с помощью
описанного в литературе и широко используемого диффузионного метода, который заключается в
измерении ширины зон задержки роста тест-культур на агаризованной среде, формирующихся под
действием диффундирующих веществ с антибактериальной активностью. В качестве тест-культуры
использовали выделенные нами из состава биообрастаний бактерии P. aeruginosa Р-С. Результаты
представлены на рис. 2.
Рис. 2 – Зоны ингибирования роста бактерий P. aeruginosa Р-С в диффузионном методе
Как видно из рис. 2, все три опытных образца обеспечивают практически одинаковые по ширине
зоны ингибирования роста тест-бактерий. Это можно объяснить невысокой чувствительностью метода,
не позволяющей дифференцировать близкие по антибактериальной активности материалы.
Заключение. Таким образом, для оценки степени бактериостойкости материалов и изделий
разработано два количественных метода, позволяющих по степени ингибирования метаболической
активности тест-бактерий под действием биоцидных добавок в составе исследуемых материалов, судить об
их эффективности. Разработанные методы позволяют получать объективные количественные
показатели и различать схожие по антибактериальным свойствам образцы биозащищенных
материалов, характеризуются хорошей воспроизводимостью, небольшими трудозатратами и
доступностью используемых средств.
1. Sanchez-Silva M., Rosowsky D. Biodeterioration of construction materials: State of the art and future challenges // Journal
of Materials in Civil Engineering. – 2008. – Vol. 20, № 5. – P. 352–365.
2. А.Ф. Андреева [и др.]. Определение скорости коррозии стальных тонкопленочных матриц под воздействием
экзополимеров сульфатвосстанавливающих бактерий // Современные проблемы физического материаловедения. – К.: Ин-т
пробл. материаловедения НАН Украины. – 2009. – Вып. 18. – С. 121–125.
3. Beech I., Sunner J. Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals // Current Opinion in
Biotechnology. – 2004. – Vol. 15, № 3. – Р. 181–186.
4. Антоновская Л.И., Райский А.П., Белясова Н.А. Выделение и идентификация микроорганизмов из состава
биообрастаний половолоконных ультрафильтрационных мембранных элементов // Материалы Республиканской научной
конференции с международным участием «Научные стремления – 2010». Национальная академия наук Беларуси. – 2010. – Ч
2. – С. 449–452.
5. Антоновская, Л.И. Разработка метода определения степени устойчивости материалов и изделий с биоцидными
добавками к биообрастаниям // Молодежь в науке – 2009: прил. к журн. «Весцi нацыянальнай акадэмii навук Беларусi». –
2010. – Ч. 4.– С. 3–7.
6. Единая система защиты от коррозии и старения. Жидкости смазочно-охлаждающие. Методы испытаний на
биостойкость: ГОСТ 9.085–78. − Введ. 01.02.1979. − М.: Издательство стандартов. Государственный комитет СССР по
стандартам. Государственный стандарт Союза ССР, 1979. – 10 с.
37
УДК: 579.64:504.53.054
Қ. Баяқышова, Н.Н. Гаврилова, И.А. Ратникова
АССОЦИАЦИЯЛАР ҚҰРАМЫНА КІРЕТІН МҰНАЙТОТЫҚТЫРУШЫ
МИКРООРГАНИЗМДЕРДІҢ КУЛЬТИВИРЛЕУ ЖАҒДАЙЛАРЫН ІРІКТЕУ
(ҚР БҒМ ҒК «Микробиология жəне мирусология институты» РМК)
Зерттеу барысында А4, А5 жəне А6 ассоциацияларының құрамына кіретін микроорганизмдерді культивирлеу
жағдайлары жəне оларды бірге культивирлеу үшін ең қолайлы қатынастары іріктелініп алынды.
Қазақстан пайдалы қазбалар мен мұнай өндіруде əлемдегі жетекші елдердің бірі болып
саналады. Осыған байланысты, негізгі экологиялық проблемалар мұнай жəне тау-кен өндіру
саласындағы өнеркəсіптердің əрекеттерімен тығыз байланысты.
Əлемдік
практикада
кеңінен
қолданылатын
рекультивациялық
шаралар,
қазіргі
микробиологиялық рекультивация əдістеріне, мұнайтотықтырушы микроорганизмдердің белсенділігі
жоғары штамдарын пайдалануға негізделген. Қоршаған ортадағы нысаналарды мұнай жəне мұнай
өнімдерінен тазалау мақсатында тиімділігі жоғары биопрепараттарды дайындау – тек, штамдардың
физиологиялық ерекшеліктерін ескере отырып, ортаның ластану жағдайына бейімделген,
көмірсуларын тотықтырушы микрорганизмдер мен асасоциацияларды қолдануға негізделген, жəне
оған оларды өндірудің өзіндік технологиясын жасап шығарған жағдайда ғана мүмкіндік туады [1].
Зерттеу жұмыстың мақсатына: ҚР БҒМ ҒК «Микробиология жəне вирусология институты» РМК
алынған мұнайтотықтырушы микроорганизмдер мен олардың ассоциацияларын культивирлеу
жағдайлары мен қоректік орталарды іріктеу жатады.
Зерттеу əдістері жəне материалдар
Зерттеу нысанына мұнайтотықтырушы бактериялардың Arthrobacter sp. П-1, 24, К-3, Candida
sp. культуралары жатады. Культуралар қиғаштап қатырылған қоректік агар ЕПА-да өсірілді. Сұйық
қоректік ортаға егу, есертіліп отырған микроорганизмдердің бастапқы культураларын – ЕПА-дан
(n×108КОЕ/мл) 1% мөлшерде шайынды алынып егіледі. Өсіру 280С температурада 24 жəне 48 сағат
тербелгіште жүргізілді. Ассоциацияларды алу мақсатында, сұйық қоректік ортада өсірілген
мұнайтотықтырушы микроорганизмдер тең қатынаста араластырылды.
Бактериялардың тіршілікке қабылетті клеткаларын анықтау ЕПА тығыз қоректік ортасына
белгілі сұйылту дəрежесіне сай Петри аяқшасына егу жолымен жүргізілді. Бактериялардың
мұнайтотықтыру белсенділігі, 2% шикі мұнай қосылған сұйық қоректік ортада 10 тəулік бойы
тербелгіште өсіріліп, олардың мұнайды пайдалану (сіңіру) мүмкіндігі гравиметрикалық əдіспен
анықталды.
Нəтижелер жəне оларды талдау
Arthrobacter sp. 24 жəне К-3, Candida sp. дрожжылардан құралған А4 ассоциациясына қоректік
орталар жəне оларды культивирлеу жағдайларына іріктеу жүргізілді.
Қоректік орталардың мына нұсқалары сыналды (г/л):
1. NH4NО3 – 1,0; K2HPO4 – 1,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 – 0,2; CaCl2 – 0,02; FeCl3 – 2 тамшы
концентрленген ертіндісі; NaCl – 10,0; дистилденген су – 1л. дейін
2. Жүгері экстракты – 10,0; дрожжылар ферментолизаты – 3,0; NaCl – 10,0; су – 1 л. дейін, pH
7,2–7,5
3. КН2РО4 – 2,0; Na2HPО4 – 3,0; MgSО4 – 0,5; (NH4)2SО4 – 2,0; СаС12 – 0,01; FeС13 – 0,05; соя
ұны – 5,0, сахароза – 10,0; су – 1 л. дейін, рН 7,0–7,2.
4. ЕПС
5. № 1 қоректік орта нұсқасына + 10г/л қоректік сорпа + 10 г/л сахароза.
Культураларды егер алдынада қоректік ортаға 2% мөлшерде мұнай қосылды.
Культивирлеу тербелгіште 10 тəулік бойы жүргізілді. Содан кейін (1–2 тəуліктен соң) тіршілікке
қабылетті клеткалардың саны мен мұнайды пайдалану пайызы (10 тəуліктен кейін) анықталды [2].
Кесте 1 – Сұйық мұнай қосылған əртүрлі қоректік орталарда өскен мұнай тотықтырғыш
бактериялардың саны
Қоректік орталардың Бактериялар
Бактериялық клеткалар саны, КОЕ/мл
нұсқалары
штамдары
1
1 сутки
3,0×105
24
38
2 сутки
5,0×105
2
3
4
5
1
2
3
4
5
2,0×105
1,6×107
1,2×108
2,0×106
2,8×108
1,8×108
4,0×107
1,3×107
1,4×108
24
24
24
24
К-3
К-3
К-3
К-3
К-3
2,0×106
2,5×108
2,2×109
3,5×108
2,4×109
2,6×109
2,0×108
2,0×108
3,0×109
Кестеде көрсетілгендей, сынаққа алынған қоректік орталарға 2% сұйық мұнай қосқан кезде,
бактериялық клеткалар саны 2-тəулікте көбірек жиналатынын көреміз. Оның үстіне 24 штамм үшін ең
жақсы қоректік орта № 4 (ЕПС) болса, К-З штамын – №№ 1, 2 жəне 5 қоректік орталарда культивирлеу
қолайлы. Қоректік ортаға қою мұнайды қосқанда ең үздік көрсеткішті К3 штамы № 2 жəне 3, ал 24
штамм – № 3 қоректік орталарда көрсетті.
Жай көзбен бақылау барсында, бір қатар нұсқаларда: екі штамда да (сұйық мұнай қосылған) № 2
жəне 4 қоректік орталарда, К-3 штамында сонымен бірге № 3 қоректік ортада (қою мұнай қосылған) 5
тəулікте-ақ мұнайдың ыдырауы байқалады.
К-3 штамын № 2 жəне 3 орталарда өсіргенде, 10 тəулікте сұйық мұнайды 100%-ға, № 4 ортада №
32,3 % пайдаланды. № 5 қоректік ортада өсірген кезде 24 штамм мұнайды 77% сіңірді.
Культивирлеу мерзімінің ұзақтығы мен аэрацияның қажеттілігі – культураларды ЕПС-да өсіру
арқылы анықталды. Аэрацияның қарқаны – тербелгішке арналған көлемдері 50-ден 250 мл болатын
750-мл-лік колбаларға қоректік орта құйып, өсіру арқылы анықталды. Культуралар тербелгіште 280С
температурада 2 тəулік өсірілді.
Сынаққа алынған культураларды ЕПС-да өсірген кезде, бір тəуліктен кейін клеткалардың ең көп
мөлшерде (1,7-10,0×109 КОЕ/мл дейін) жиналатыны анықталды. 24 штамды көлемі 50 - 200 мл қоректік
ортада өсіргенде биомассаның жиналуы жағынан бəлендей өзгеріс байқалмады, ал қоректік ортаның
көлемін 250 мл көтергенде, бактериялық клеткалардың саны n×107 КОЕ/мл дейін төмендегенін
көреміз. Осыған байланысты, мұнайтотықтырушы бактериялардың сынаққа алынатын культураларын
ферментерда өсірген кезде, ауаның технологиялық шығыны 0,8-1,0 V/мин (қоректік ортаның көлеміне
шаққанда) болды. К3 штамын 50 - 250 мл қоректік ортада өсіргенде, биомассаның жиналуы жағынан
ерекше өзгеріс байқалмады. Бұл К3 штамын ферментерде өсіргенде, ауаның технологиялық шығыны 0,
6V/мин (қоректік ортаның көлеміне шаққанда) артпайтынын көрсетеді.
Candida sp. дрожжылары ең көп биомассаны, ВД қоректік ортасына 1 г/л ет-пептонды сорпа мен
1 г/л сахароза қосып даярланған модификацияланған (№ 5 орта) қоректік ортада 1 тəулік өсіргенде
жəне ауаның технологиялық шығыны 0, 6V/мин (қоректік ортаның көлеміне шаққанда) болған
жағдайда ғана түзеді.
А4 ассоциациясының құрамына кіретін микроорганизмдер культураларының əр қайсысын, жекежеке өсіру қажеттігі анықталды. Микроорганизмдерді жеке өсірген кездегі ассоциацияның
мұнайтотықтыру белсенділігі 54,7 %, ал бірге культивиргенде – 18,2 % болды.
Arthrobacter sp. 24, К-3 и П-1 бактериялары мен Candida sp., дрожжысынан тұратын, А5 жəне
Arthrobacter sp. 24, К-3 жəне П-1 бактерияларынан тұратын А6 ассоциацияларының биомасса
жинақтауына жағдайлар іріктеп алынды.
Микроорганизмдердің биомассаны жинақтауы үшін қоректік орта ретінде, ВД мен ЕПС-ға
қосымша 1 г/л ет-пептонды сорпа мен 1 г/л сахарозны қосылған орталар сыналды.
Сынаққа алынған культуралар қоректік орталардың екі нұсқасында да бірдей жақсы өсетіні
белгілі болды. Соның ішінде Arthrobacter sp П-1 культуралары екінші тəулікте клеткаларды мейілінше
көп жинақтаса, Candida sp., Arthrobacter sp. 24 жəне К-3 – бірінші тəулікте жинақтайды.
А5 ассоциациясын дайындауда микроорганизмдер үйлесімділігінің 9 нұсқасы алынды (таблица
2).
Кесте 2 – Микроорганизмдерді өсіру əдісінің А5 ассоциациясы бактерияларының титрі мен
мұнайтотықтыру белсенділігіне əсері
Бақылаумен салыстырғанда
Тəжірибе нұсқалары
Ассоциация титрі,
(бірге өсіру), мұнайтотықтыру
КОЕ/мл
белсенділігінің өсуі, %.
6
24+К-3+П1;Candida sp.
5,6×10
22±0,90
39
24+К-3; П-1+Candida sp.
4,1×107
17±0,06
7
24+ Candida sp; К-3+ П-1
2,4×10
12±0,07
24+ П-1; К-3; Candida sp.
4,6×108
31±0,30
24+К-3 + Candida sp; П-1
3,9×107
9±0,02
24+ Candida sр+П-1; К-3
2,8×107
30±0,40
Candida sр.+ П-1+ К-3; 24
3,0×107
30±0,60
Раздельное культивирование
1,8×108
30±0,50
А5 ассоциациясы нұсқалары ішінде микроорганизмдер клеткаларын жинақтауы жағынан ең
тəуірі, культуралары жеке культивирлеп, соңынан теңдей қатынаста (2,0×108) қосып араластырылған 8нұсқа мен Arthrobacter 24 Arthrobacter П-1-мен бірге жəне Arthrobacter К3-ды Candida sp.-мен
өсіріліп, соңынан теңдей қатынаста (4,6×108) араластырылған 3-нұсқа болатыны анықталды.
Культураларын жеке-жеке өсіріп бірдей қатынаста араластырып дайындалған ассоциация,
барлық 4 штамы бірге өсірілген ассоциацияға қарағанда мұнайтотықтыру белсенділігі жағынан 30 %-ға
артық болды. Arthrobacter 24, Arthrobacter П-1 жəне Candida sp. культуралары бірге, ал Arthrobacter К3
жеке өсірілген 6-нұсқада, жəне де Arthrobacter К3, Arthrobacter П-1 жəне Candida sp. бірге, ал
Arthrobacter 24 жеке өсіріп, соңынан 3:1 қатынаста араластырылған 7-нұсқада да дəл осындай нəтиже
алынды.
А6 ассоциациясының құрамына кіретін культураларды жеке-жеке өсірілгенде, оның
мұнайтотықтыру – 26%, ал 24 жəне П-1 культураларын бірге, К-3 культурасын жеке өсіріліп, соңынан
араластырылған нұсқада – 27 % болды.
Сонымен, зерттеу барысында А4, А5 жəне
А6 ассоциацияларының құрамына кіретін
микроорганизмдерді культивирлеу жағдайлары жəне оларды бірге культивирлеу үшін ең қолайлы
қатынастыры іріктелініп алынды.
1. Звягинцев Д.Г., Умаров М.М., Чернов Ю.И. и др. Микробиологические сообщества и их функционирование в
процессах деградации и самовосстановления почв / Деградация и охрана почв/ Под ред. Г.В.Добровольского.М.Изд-во МГУ,
2002.С.441-445.
2. Гаврилова Н.Н., Айткельдиева С.А., Ратникова И.А., Треножникова Л.П., Баякишева К., Хасенова А.Х. Подбор
условий культивирования нефтеокисляющих бактерий // Биотехнология. Теория и практика. – 2010. - №3. – С. 15-18.
***
Подобраны условия культивирования микроорганизмов, входящих в состав ассоциаций А4, А5 и А6 и оптимальные
их соотношения для совместного культивирования.
****
The conditions for cultivation of microorganisms belonging to theassociation, A4, A5 and A6 and their relationship to the
optimal co-cultivation.
Р.К. Блиева
ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ И СЕЛЕКЦИЯ МИКРОМИЦЕТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ
ФЕРМЕНТОВ
(РГП «Микробиология жəне вирусология институты» КН МОН РК)
В статье представлены результаты многолетних исследований о путях увелечения биосинтеза жизненно
необходимых для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства энзимов. Показана необходимость изучения
физиологической регуляции направленного биосинтеза ферментов, разработан новый более продуктивный и экономичный
способ выращивания микромицетов на подложке в нитчато-губчатый структуре. Разработан перспективный способ
селекции микромицетов-продуцентов ферментов, позволяющий не только восстановить утерянную активность культур,
но и увеличить ее активность от 3 до 10 раз, а в некоторых случаях до 30 раз.
Одной из центральных задач современной микробиологии является направленный биосинтез
таких востребованных и важных активных веществ как ферменты и разработка способов повышения
их образования. При отработке технологии получения ферментов необходимо стремиться к возможно
более полному использованию биологического потенциала применяемых штаммов микроорганизмов и
вести процесс биосинтеза с максимальной интенсивностью. Зная основные биологические
возможности выбранных продуцентов ферментов и параметры их образования, можно создать
необходимые условия культивирования и получить заданную производительность ферментационного
процесса.
Значительное количество гидролитических ферментов образуют некоторые штаммы
микромицетов и бактерий. Но большей агрессивностью в расщеплений органических субстратов
40
обладают микромицеты благодаря наличию более мощного биологического потенциала,
определяемого набором и количеством образуемых ферментов. Вот почему при производстве
ферментов предпочтение при выборе продуцентов отдают микромицетам.
Для нормального развития продуцентов ферментов существенное значение имеет правильное
выявление оптимальных компонентов питательной среды и их концентраций. Одной из важных
составляющих питательной среды является источник углерода. Он служит не только питательным
субстратом для микроорганизмов и источником энергии, но и способен иногда вызывать индукцию
образования гидролитических ферментов, таких как к примеру амилаза и пектиназа. Нами ранее было
установлено, что культура Asp.oryzae 3-9-15 для своего роста и развития, а также для максимального
достижения образования α-амилазной активности в качестве источника углерода использует крахмал и
продукты неполного его гидролиза. Для максимального биосинтеза пектинрасщепляющих ферментов
(ПР) нами установлено также, что необходимо присутствие в среде не только легкоусвояемых
углеводов, но и пектина, который индуцировал биосинтез фермента у Asp.niger П и Asp.awamori.
Образование ферментов заметно репрессировалось при концентрации легкометаболизируемых
источников углерода свыше 2%; в этом случае наблюдали разное понижение процесса образование ПР
ферментов. При использовании в качестве источника углерода смеси лактозы с пектином, мы
наблюдали максимум образовали ферментов у Asp.niger П (табл. 1).
Таблица 1. Влияние источников углерода и их смесей в среде на рост культуры и образование ПР
ферментов свободными клетками Asp.niger П
Источники Вес сухого
ПкА,
Продуцирующая
Добавлено пектина
Продуцирующая
углерода в
мицелия
ед/мл
способность 1 г
(0,5%)
способность,
среде
мицелия, ед/г
ед/г мицелия
Вес сухого
Пк А,
мицелия,г
ед/мл
Пектин
0,332
4,18
12,59
Крахмал
0,210
0,74
3,52
0,700
4,24
1,42
Инулин
0,280
0,50
1,79
0,700
1,98
2,83
Лактоза
0,020
0
0,330
10,14
30,72
Сахароза
0,270
0,84
3,11
1,190
3,52
2,68
Мальтоза
0,265
0,72
2,72
0,680
2,40
3,52
Фруктоза
0,140
0
0,700
4,06
5,80
Галактоза
0,9
0
0,470
1,44
3,06
Глюкоза
0,225
0
0,680
2,28
3,35
Глицерин
0,020
0
0,540
1,26
2,33
Это объясняется тем, что пектин индуцирует биосинтез ферментов, скорость потребления
которого выше, чем лактозы. Лактоза же медленно гидролизуется и при постепенном потреблении
усиливает биосинтез ферментов. Малые концентрации высвобождающейся глюкозы и галактозы не
вызывают репрессии синтеза пектинрасщепляющих ферментов. При использовании же в качестве
источника углерода пектина в сочетании с легкометаболизируемыми углеводами в больших
концентрациях наступает катаболитная репрессия. Поэтому легкометаболизируемые источники
углерода необходимо подавать в среду в ограниченном количестве.
Известные до сих пор способы культивирования продуцентов гидролитических ферментов,
создающие благоприятные условия для роста и развития культур микроорганизмов, содержат
оптимальный источник углерода, азота и минеральные соли. Однако недостатком этих способов
является невысокий уровень биосинтеза гидролитических ферментов при пышном росте продуцентов.
Для увеличения биосинтеза α-амилазы, повышения продуктивности культуры целесообразно
применять ингибиторы роста микромицетов – производные оксифосфоната гетероциклического ряда
(табл. 2).
Таблица 2. Влияние различных концентраций производных нитразоацетона на образование αамилазы Asp.oryzae 3-9-15
Испытуемые
Амилолитическая активность, ед/мл
вещества
Дозировки, г/л
без
0,00015
0,0005
0,002
0,008
0,015
добавления
Контроль без
4,24
добавления
41
испытуемых
веществ…
ИЗО-1
10,0
12,0
9,0
нет роста
ИЗО-2
9,0
11,0
9,0
нет роста
ИЗО-3
7,0
9,0
нет роста
ИЗО-4
7,0
9,0
1,0
нет роста
ИЗО-5
1,2
5,0
нет роста
Эти ингибиторы задавали в среду в количестве 0,0005 г/мл, что приводило к увеличении
биосинтеза α-амилазы более чем в 2-3 раза [1].
Действие этих веществ основано на угнетении роста культуры, вызывая изменения структуры
клетки. Ультраструктурные исследования показали, что клетка, борясь за выживания, образует дыры в
плазмолемме. Эти образования возможно способствовали большему вытеканию образовавшихся
ферментов из клетки в культуральную жидкость, увеличивая ее активность в 2-3 раза.
Усиление синтеза ферментов достигалось нами не только путем подбора активных продуцентов,
введением специфических индукторов, подбором состава питательной среды и оптимальных значений
рН роста в процессе культивирования, но и путем введения неспецифических эффекторов,
ингибиторов и активаторов роста микромицетов [2].
Изучение физиологии микромицетов тесным образом связано с методом культивирования. В
условиях глубинного культивирования мицелиальные грибы растут в виде пеллетов. Нами обоснован
новый принцип культивирования микромицетов, отличный от традиционного глубинного метода
культивирования. В предложенном методе культивирования микромицеты растут на подложке в
глубинных условиях роста в рыхлой нитчато-губчатой структуре. Создавая условия благоприятные для
их роста, мы преследовали цель формирования вегетативного мицелия при глубинном
культивировании клеток в естественной нитевидной форме без скручивания гиф в шарики путем
удлинения и разветвления нитей в линейном направлении на поверхности подложки с максимумом
доступа к клеткам кислорода и питательных веществ [3;4].
Разработанный
метод культивирования иммобилизованных клеток в нитчато-губчатых
структурах отрабатывался на промышленных штаммах продуцентов гидролитических ферментов – αамилазы и ПР фермент. Asp.niger П и Asp.oryzae 3-9-15 и подтвержден на продуцентах
протеолитически ферментов, коллагеназы и лиазы (Asp. awamori 21/96, Penicillium cyclopium-2-11)
[5;6].
Вследствие ряда факторов: иммобилизации клеток и роста продуцентов в нитчато-губчатой
структуре, накопления значительной концентрации активной биомассы на подложке, биосинтеза
ферментов системой клеток, увеличением клеточной проницаемости, происходит возрастание
ферментативной активности культуральной жидкости от 2 до 10 раз (в зависимости от этапов
процесса), удлинение стационарной стадии активного ферментообразования в 3-5 раз; значительно
увеличивается общий срок культивирования продуцента, обеспечивается многократность
использования иммобилизованной культуры и получения целевого продукта.
Производство ферментных препаратов, основанное на использовании микромицетов – наиболее
мощных производителей энзимов, может быть рентабельным лишь при условии применения
высокоактивных продуцентов. Поэтому задача получения высокоактивных штаммов продуцентов
ферментов является первоочередной и актуальной [7-10].
В отличие от непрерывного культивирования микроорганизмов, полунепрерывное выращивание
иммобилизованной культуры с периодической сменой питательной среды создает условия для
формирования гетерогенной системы популяции с многообразием вариантов. Изменчивость,
формирование большого разнообразия микромицетов в условиях иммобилизации и полунепрерывного
культивирования является установленным нами фактом. Среди множества вариантов, возникших в
процессе длительного выращивания иммобилизованной культуры отбирались только те, которые были
намного активнее по ферментообразующим свойствам [11,12].
Таким образом, создан один из эффективных методов селекции микромицетов – продуцентов
ферментов. Метод основан на отборе новых более активных форм микроорганизмов из непрерывно
выращиваемой длительное время на твердой подложке иммобилизованной культуры в условиях
полунепрерывной смены питательной среды. Этот метод позволил получить высокоактивные штаммы
микромицетов по протеолитической, коллагеназной и лиазной активности.
1. Азербаев И.Н., Блиева Р.К. и др. Способ культивирование продуцентов амилазы. Патент РФ №513074.
2. Блиева Р.К. Абиюров К.И. и др. Способ получения пектиназы. Патент РФ №696051.
42
3. Steliana Clapco. Селекция некоторых штаммов микромицетов продуцентов пектолитических ферментов и
оптимизация условий развития и биосинтеза: Автореф….. докт.биол.наук. – Румыния, 2006. – 26 с.
4. Блиева Р.К. Устройство для культивирования микроорганизмов в нитчато-губчатой структуре. Патент РФ
№1047954.
5. Блиева Р.К. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение преимущества культивирования
микромицетов-продуцентов ферментов в нитчато-губчатой структуре перед пеллетами (Биологические подходы к решению
актуальных проблем…) Кызылорда, - 2011. - С. 111-114.
6. Сафуани Ж.Е. Биосинтез протеолитических ферментов иммобилизованной культуры Aspergillus awamori 2-10 и
использование их для мягчения конского мясо: Автореф. …канд.биол.наук. – Алматы, 2005. – 17 с.
7. Калиева А.К. Penicillium cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің биосинтезі жəне оларды синтетикалық жуғыш
заттарда іс жүзінде қолдану: Автореф. …канд.биол.наук. – Алматы, 2006. - 17 с.
8. Шигаева М.Х. Селекция дрожжей. – Алма-ата: Наука, 1975. – 150 с.
9. Steliana Clapco. Селекция некоторых штаммов микромицетов продуцентов пектолитических ферментов и
оптимизация условий развития и биосинтеза. - Автореф…. докт.биол.наук. – Румыния, 2006. – 26 с.
10. Михайлова Р.В., Семашко Т.В., Лобанок А.Г. и др. Спонтанная изменчивость Penicillium funiculosum ( штамм БИМ
7-15) – продуцента глюкозооксидазы // Микробиология и фитопатология. – 2001. – Т.35. – Вып.5. – С. 73-79.
11. Михайлова Р.В., Жуковская Л.А., Лобанок А.Г. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adamezii ЛФ F2044 – продуцента глюкозооксидазы // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43. - №2. – С. 229-233.
12. Блиева Р.К., Искакбаева Ж.А. Селекция микромицетов-продуцентов ферментов // Биотехнология. Теория и
практика, - 2008. - №2. - С. 24-30.
***
Бұл мақалда көп жылдар бойы əртүрлі өндіріс аумағына жəне ауылшаруашылықта қолданылатын энзимдердің
биосинтезін жоғарылату жолдары зерттеулеріне нəтиже берілген. Ферменттердің мақсатты биосинтезі үшін физиологиялық
бақылау жүргізілуі керек екені көрсетілген жəне микромицеттерді экономикалық жағынан тиімді əрі өнімділігін жоғарылатыу
мақсатында жіпті-губкалы құрылымдағы табаншаларды қолдану əдісі өңделген. Ферменттердің микромицетпродуценттерінің жоғалған белсенділігін қалпына келтіретін жəне белсенділігін 3-тен 10 есеге дейін көтеретін, кейбір
жағдайда 30 есеге дейін жоғарылататын тиімді селекцияның əдісі өңделген.
УДК 579:631.811.98
Ж.Т. Ботбаева, А.П. Науанова, Р. Ж. Əбдукерім
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОГО БИОФУНГИЦИДА –
СТИМУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
(Казахский агротехнический университет им. С Сейфуллина, e-mail: [email protected])
В этой статье представлены методы разработки эффективного биофунгицида на основе селекционных активных
штаммов бактерий рода Bacillus, которые были генотипированы по гену 16s РНК. Определено распространение и
развитие фузариозно-гельминтоспориозной инфекции, а также
корневой гнили зерновых культур. Определена
биологическая и выявлена хозяйственная эффективность использования биофунгицида в технологиях выращивания
пшеницы.
Заболевания растений являются одним из факторов, серьезно ограничивающих продуктивность
сельского хозяйства во всем мире. Ежегодный ущерб, причиняемый фитопатогенными
микроорганизмами, значительная часть которых представлена паразитическими грибами, составляет,
по разным оценкам, от 15 до 20% общей продуктивности мирового растениеводства [1].
Сегодня практически нет незараженных семян и, в зависимости от погодных условий, в период
вегетации семена могут быть заражены до 70%. В семенном фонде большинства хозяйств, практически
отсутствует здоровый материал, почти каждая партия семян в той или иной мере заражена различными
патогенными микроорганизмами. Так, на ячмене преобладают Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker,
виды родов Altemaria, Fusarium. Во влажные годы в общем комплексе грибов на семенах ячменя
встречаемость Bipolaris sorokiniana может достигать 47,6%, видов р. А1ternaria – 31,7%, p. Fusarium –
17,5%; на озимой пшенице – видов p. Alternaria – 51,7%, p. Fusarium – до 15%. Пораженность семян
различных сортов яровой пшеницы находится в пределах 47,5 – 62,3%, из них p. Fusarium – 23 – 37,5%,
р. Altemaria – 10 – 34,4% [2, 3].
В настоящее время стратегия биологического метода защиты растений от болезней не ставит
задачу полного уничтожения вредных организмов, а ориентирует на регулирование популяции
патогена на уровне ниже экономического порога вредоносности /4/. В связи с этим применение
микробиологических средств защиты растений требует глубокого изучения биологических
особенностей взаимоотношения патогена с растением – хозяином и почвенным микробным ценозом. В
борьбе с грибными болезнями сельскохозяйственных культур перспективно использование микробов –
антагонистов. Они снижают пораженность растений болезнями, стимулируют рост и развитие,
увеличивают урожайность, не загрязняют окружающую среду [3, 4, 5]. Против возбудителей корневой
гнили разработаны способы обогащения ризосферы зерновых культур антагонистами путем обработки
43
семян фунгицидами [6]. Поэтому разработка эффекивныхфунгицидов на основе полезных
микроорганизмов-антагонистов в настоящее время является актуальной задачей защиты растений от
заболеваний.
Цель исследований – разработать на основе селекционных активных штаммов бактерий рода
Bacillus эффективного биофунгицида от фузариозно-гельминтоспориозной инфекции зерна и корневой
системы.
Материалы и методы исследования
Полевые опыты были проведены на полях ТОО «Нива» Акмолинской области Северного
Казахстана. Отбор почвенных образцов проводили методом конверта на глубину пахотного слоя (0-10,
10-20, 20-30 см). Для постановки модельного эксперимента использовали емкости со стерильной
почвой по 200 гр. в каждом варианте, затем почву инокулировали суспензией из консорциума
фитопатогенных грибов Fusarium heterosporum, Fusarium oxysporum, Bipolaris sorokiniana
перемешивали стерильным шпателем и добавляли наполнитель в количестве 20 гр., затем вносили по
20 мл культуральной жидкости 3-х суточной культуры микроорганизмов. Для получения биомассы
фитопатогенных грибов использовалась питательная среда Чапека-Докса, после стерилизации в среду
добавлялось небольшое количество спор грибов. Затем колбы ставились в термостатируемый шейкер
при 30С0 130 об/мин и культивировали 7 суток.
В качестве исследуемых объектов были использованы два консорциума на основе разных
штаммов микроорганизмов рода Bacillus, которые были отобраны по антагонистической активности. В
качестве наполнителей консорциумов подобран наполнитель - цеолит. Консорциум №1состоит из
Bacillus шт. 9, шт. 29, шт. 31, шт. 2+цеолит). Консорциум №2состоит из Bacillus шт. 18, шт. 46, шт. 31,
шт. 9+цеолит.
Выделение ДНК из исследуемых штаммов-антагонистов провели с помощью специального
набора фирмы «Fermentas». Чтобы увидеть фрагменты выделенного ДНК амплифицированных
фрагментов провели электрофорез при напряжении 5V/см3 в течение 1 часа. Для проведения
амплификации 16s РНК с помощью прямого праймера — AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG и
обратного праймера - GGA CTA CCA GGG TAT CTA AT. Очистка сиквенс продукт продуктов провели с
помощью Ac Na (ацетат нария).
Микологический анализ пораженных частей растений и семян проведен по методике М.К.
Хохрякова [7] и Н.А. Наумовой [8]. Для идентификации видового состава фитопатогенных грибов
используются определители: В.И. Билай [9], М.А. Литвинова [10], Б.А. Хасанова [11], монография
Б.Д. Ермековой [12]. Наработку эффективного фунгицида проводили в ферментере «Bioflo 110»
объемом 2 литра. Интенсивность поражения пшеницы корневой гнилью устанавливали по 4-х бальной
шкале [13].
Результаты и обсуждение
Для идентификации были взяты 6 штаммов микроорганизмов показавшие наиболее лучшие
результаты по антагонистической активности. Идентификация бактерий вида Bacillus основана на
обнаружении и амплификации фрагмента гена с помощью полимеразной цепной реакции, которая
представляет собой многократное цикличное повторение трех процессов: тепловая денатурация ДНК в
исследуемой пробе; гибридизация (отжиг) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными
зондами (праймерами); синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНКполимеразы. выделение суммарной ДНК; ПЦР, то есть реакция амплификации фрагмента гена 16s
РНК, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Подробное описание идентификации с помощью
молекулярно-генетических методов указанных штаммов ранее нами была опубликована [14] .
На основе проведенных молекулярно-генетических методов исследуемый штаммы рода Bacillus
sp.18, Bacillus sp. 46 относятся к виду Bacillus pumilus, что максимальная их гомология составляет
99,0%, штаммы Bacillus sp.2 Bacillus sp.29 относятся к Bacillus subtilis (99,%), и штаммы Bacillus sp.31,
Bacillus sp.9 гомологичны со штаммом Bacillus cereus (99 %). Для разработки эффективного фунгицида
необходимо наработка биомассу в ферментере. Наработку проводили в ферментере «Bioflo 110»
объемом 2 литра (рисунок 1а).
По окончании процесса культивирования, отбирают пробы для определения количества
бактерий и отсутствия посторонней микрофлоры. Культуральную жидкость из ферментера передают
в передвижные емкости. Далее бактериальную суспензию (рисунок 1б) концентрировали с помощью
центрифуги при 4000 об/мин., в течение 30 мин для хранения в разных температурных режимах (-200 и
-40 ).
44
а)
б)
в)
Рисунок 1- Процесс культивирования в ферментере штаммов– антагонистов из рода Bacillus
а) Процесс наработки микробной суспензии в ферментере «Bioflo 110»
б) передвижные емкости для приема культуральной жидкости из ферментера
в) Концентрированные микробные суспензии
На полях ТОО «Нива» заложен полевой опыт в пяти вариантах в трехкратной повторности с
растениями пшеницы инокулированых биофунгицидным препаратами консорциум №1 и консорциум
№2. Опыты заложены на естественном инфекционном фоне. В качестве контроля использовали посевы
пшеницы без инокулирования штаммами бактерий.
В текущем году исследований распространение и развитие корневой гнили пшеницы
наблюдалось в течение всего вегетационного периода. В условиях 2011 года развитие болезни в фазу
кущения колебалось в пределах 17,0 – 22,2%. Наибольшее распространение корневых гнилей в фазу
кущения варьировало от 33,3% до 52,6% (таблица 1).
Таблица 1 – Распространение и развитие корневых гнилей в посевах пшеницы, 2011 г.
Вариант
Распространение болезни, %
Развитие болезни, %
кущение
полная
кущение
полная
спелость
спелость
Контроль
57,7
35,4
21,5
13,7
Консорциум 1
52,6
27,2
17,5
8,8
Консорциум 2
48,9
22,7
17,0
6,8
В условиях Северного Казахстана яровые зерновые культуры, в частности пшеница, ежегодно
поражаются корневыми гнилями (возбудители – гриб Bipolaris sorokiniana и некоторые виды рода
Fusarium). Повреждение корневой системы, эпикотеля и основания стебля зачастую приводит к гибели
растений или отрицательно влияет на формирование элементов структуры урожая [15]. Развитие
болезни в фазу полной спелости находилось в пределах 6,8- 8,8%.
Наибольшее распространение и развитие корневых гнилей на момент уборки урожая отмечено
на контрольном варианте 35,4% и 13,7% соответственно. Биопрепараты ограничили развитие болезни в
среднем на 3,8-21,3% (таблица 2).
Таблица 2 – Биологическая и хозяйственная эффективность использования биопрепаратов против
корневой гнили в посевах пшеницы, 2011 г.
Вариант
Биологическая
Хозяйственная эффективность,
эффективность, %
%
Контроль
Консорциум 1
21,3
3,8
Консорциум 2
20,8
8,6
Из таблицы 2, можно сделать вывод, что против корневой гнили наиболее эффективным
фунгицидом является - Консорциум 2. Хозяйственная эффективность биофунгицида Консорциум 2
превышает на 8,6% контрольного варианта.
45
Заключение
Таким образом, можно сделать вывод, что в условиях острозасушливого 2011 года внесение в
почву биологического фунгицида снижает распространение корневой гнили на 5,1-24,4% по
сравнению с контролем в фазу кущения. Распространение болезни колебалось в пределах 22,7-52,6%.
Несмотря на это к фазе полной спелости выявлено снижение отмеченных показателей на вариантах,
где семена были обработаны Консорциумами 1 и 2, где развитие болезни не превышало 10-12%. В
2011 году фунгицидная активность препаратов привела к снижению корневой гнили на 4-10%.
Биологическая эффективность, т.е. процентное снижение развития болезни на опытном варианте по
сравнению с контролем Консорциумов 1 и 2 против корневой гнили пшеницы была высокая (20,821,3%).
Полученные результаты расширяют область использования экологически безопасных
технологий защиты растений. Среди биологических средств защиты растений от вредных организмов
антагонисты представлены весьма слабо. Полученные нами данные частично восполняют этот пробел.
1.Сатубалдин К.К., Менликиев М.Я., Сангинас Л.А., Никитин С.Б. Интеграл – высокоэффективный биологический
препарат комплексного действия //ЗАО научно производственная система «Элита-комплекс». - 2002. – С.3–4.
2.Санин С.С., Черкашин В.И., Назарова Л.Н., Соколова Е.А. Фитосанитарная экспертиза зерновых культур. - М.:
ФГНУ «Росинформагротех». - 2002. – 140 с.
3.Долженко В.И., Котикова Г.Ш., Здрожевская С.Д. Средства защиты растений для предпосевной обработки семян. –
Санкт-Петербург: Всероссийский НИИ защиты растений (ВНИИ). - 2001. – 54 с.
4.Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. – М.: Агропромиздат. - 1989. – 480 с.
5.Левитин М.М., Тютерев С.Л. Грибные болезни зерновых культур // Защита и карантин растений. – 2003. – №11. – С.
48.
6.Зинченко В.А. Химическая защита растений: средства, технология и экологическая безопасность. – М.: Колос С. 2006. – 232 с.
7. Хохряков М.К. Морфолого-биологическое обоснование систематики грибов рода Helminthosporium (sensu lato) на
злаках. -Aвтореф. докт. биол. наук. – Ленинград. - 1953. - 30 с.
8.Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. – М.: - 1960. –37 c.
9.Билай В.И. Фузарии. Киев. - 1977. – 442 с.
10. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: - 1967. – 303 с.
11. Хасанов Б.А. Обзор грибов из рода Bipolaris Shoem // Микология и фитопатология. - 1991. - Т.25. - вып.4. - С. 360366.
12. Ермекова Б.Д. Почвенные грибы и обыкновенная корневая гниль колосовых зерновых. - Алма-Ата: Наука. - 1988. 144 с.
13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М.: Агропромиздат. - 1985. -351 с.
14. Ботбаева Ж.Т. и др. Идентификация почвенных штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus молекулярногенетическими методами //Вестник КАТУ. - 2011. - №1 (67). - С.44-49.
15. Егорычева М.Т., Бурлакова С.В. Эффективность предпосевного протравливания семян // Защита и карантин
растений.– 2009. - №8.- С. 43-44.
***
Бұл мақалада 16s РНҚ гені бойынша генотипирленген белсенді Bacillus туысына жататын штамдары негізінде
дайындалған тиімді биофунгицидті өңдеу əдістері көрсетілген. Астық тұқымдастарындағы фузариозно-гельминтоспориозды
жəне тамыр шіріктері инфекцияларының дамуы жəне таралуы анықталған. Биофунгицидтерді астық тұқымдастарының
аталған ауруларына қарсы қолдану кезіндегі биологиялық жəне шаруашылық тиімділігі анықталған.
***
This article shous hou to develop effective biofungicida based on brecding strains of bacteria Basillus which were
genotipirovany RNA gene 16 S. Defined the dissemination and development of fuzariozno-gel’mintosproiznoj infection, as well as root
rot agriculture crops. Define biological and economic efficiency of the utilization of biofungicida identied in wheat cultivation
technology.
УДК 608.2:62.
М.Т. Велямов, Н.Н. Дарахунова, Р.Ж. Бержанова
ОБОГАЩЕНИЕ ОВОЩНЫХ НАПИТКОВ ПЕКТИНОМ ЯВЛЯЕТСЯ ЖИЗНЕННО
ВАЖНЫМ
(ТОО «КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности»1 КАИ МСХ РК,
Казахский национальный университет им. аль-Фараби2)
В настоящей работе проанализированы результаты исследований по актуальности производства овощных
напитков и эффективности получения ферментативным методом пектина, основанный на микробиологическом способе
извлечения, из выжимок овощей и обогащения им напитков для получения полноценных с оздоровительными свойствами
продуктов.
В современных условиях роста стрессовых ситуаций и ухудшения экологической обстановки
важное место в питании человека отводится биологически ценным продуктам переработки
46
растениеводческого сырья, в частности овощей, способствующих снижению уровня заболеваний и
повышению иммунитета жизнедеятельности человеческого организма [1].
Продукты полученные из столовой свеклы и моркови, из-за содержащихся в них углеводов,
витаминов, пектина, и других жизненно важных соединений, являются весьма полезными при
профилактике и лечении гипертонической болезни, атеросклероза, заболеваний сердечно - сосудистой
системы, благоприятствующего процессу кроветворения, страдающих заболеваниями печени, при
лечении злокачественных новообразований, лечения глазных болезней, при полиартритах, нарушениях
минерального обмена, дисбактериозах кишечника, нефритах и др [2].
Учитывая выше отмеченное использование данных продукций в ежедневном потребительском
рационе людей весьма необходимо. Однако, указанная проблема, в условиях Казахстана остаётся
нерешенной и крайне злободневной.
Основной причиной, которой является то, что до сих пор не налажена эффективная технология
переработки отмеченных овощей в Казахстане. Имеющиеся технологии переработки столовой свеклы
и моркови не совершенны, а следовательно полезные показатели полученных продукций низкие и
потребительская их восстребованность сниженна. Одним из аспектов улучшения их качественных
показателей и степени повышения рентабельности их переработки является более углубленное
совершенство технологии их переработки. По литературным сведениям известно, что в выпускаемых
продукциях (соках и напитках) из столовой свеклы и моркови почти не содержится такой ценный
продукт, как пектин, хотя в них он содержится в большом количестве[3].
Пектиновые вещества это высокомолекулярные гетерополисахариды, главным структурным
компонентом которых является a-D-галактуроновая кислота (полигалактуронид). Кроме
галактуроновой кислоты в значительно меньших количествах (10-17%) в составе пектиновых веществ
присутствуют также D-галактоза, L-арабиноза, L-рамноза и другие нейтральные моносахариды.
Пектиновые вещества открыты в 1825 году; название
происходит от греч. слова pĕctós свернувшийся, застывший. Они содержатся в большом количестве в плодах, клубнях и стеблях
растений; входят в состав межклеточного вещества, придают клеткам пластичность и играют важную
роль в процессах жизнедеятельности.
При этом пектин защищает организм от воздействия радиоактивных и тяжелых металлов
(свинца, стронция и других), задерживает развитие вредных микроорганизмов в кишечнике,
способствует выведению из организма холестерина. Пектиновая кислота может использоваться в
качестве носителя лекарственных веществ. Пектины оказывают противоязвенное действие и являются
легким слабительным, а с различными металлами образуют комплексные соединения - хелаты,
которые легко выводятся из организма. Поэтому продукты, содержащие пектины, особенно показаны
людям, проживающим на радиоактивно зараженной территории. Пектиновые вещества широко
используют в кондитерском производстве, хлебопечении, сыроварении, текстильной промышленности.
Кроме того, его присутствие в продукциях необходимо для стабильного сохранения комплекса
жизненно важных витаминов и микроэлементов, а также для их полноценного усвоения организмом
[4].
Поэтому весьма важна разработка эффективной технологии извлечения пектина из них и
обогащения полученных продукций. По литературным данным известно, что в процессе сокового
производства, они не растворяясь переходят почти всецело в продукты их переработки, в данном
случае в их выжимку[5]. В промышленности пектины получают из яблочных выжимок, кожуры
цитрусовых плодов, свекловичного жома, вымолоченных корзинок подсолнечника. В данном случае
используются различные технологии получения пектина. В большинстве пектиновые вещества из
растительного сырья извлекают при нагревании обычно 0,1 н раствором фосфорной или другой
кислоты; экстракт концентрируют, фильтруют и осаждают пектиновые вещества спиртом. Для очистки
используют образование пектатов, из которых пектиновые вещества освобождают действием кислот.
Количественное определение проводят гравиметрическим методом (осаждение спиртом), методом
потенциометрического титрования, основанного на взаимодействии пектовых кислот с гидроксидом
кальция и т.д [6].
Однако в современных условиях наиболее перспективным и эффективным является
ферментативный метод выделения пектина, основанный на микробиологическом способе извлечения.
Микробиологический способ получения пектина основан на кислотно-термическом гидролизе и
последующим спиртовым осаждением из гидролизата. Получение пектина зарубежными компаниями в
настоящий момент основано именно на такой технологии.
По оценкам многих экспертов за рубежом, производство пектина по классической технологии
целесообразно лишь при объемах производства не менее 2000 тонн пектина в год из-за огромных
47
затрат на производство, утилизацию кислых сред и амортизационные отчисления на восстановление
технологического оборудования.
Использование ферментных препаратов существенно упрощает технологический процесс
получения пектина и его аппаратурное оформление, сокращает расход этанола на стадии выделения
пектина. С этой целью используют целлюлазы и гемицеллюлазы или пектолитические ферменты.
Гидролиз
пектолитическими
ферментами
приводит
к
удалению
с
помощью
эндополигалактуроназ фрагментов полигалактуроновой кислоты из состава протопектина. При этом
структура комплекса целлюлозы и гемицеллюлозы не затрагивается, что физически затрудняет
процесс экстракции пектина и позволяет получать его препараты с более высоким относительным
содержанием полигалактуроновой кислоты. В этом варианте технолгии важно ограничить степень
гидролиза пектина в процессе экстракции, чтобы получить продукт достаточно высокой молекулярной
массы.
Большинство полигалактуроназ эндотипа синтезируются в сочетании с пектинэстеразой, которая
необходима для проявления их активности. В препаратах пектолитических ферментов соответственно
присутствуют оба вида фермента. При гидролизе растительного сырья пектолитическими препаратами
происходит не только вырезание фрагментов полигалактуроновой кислоты, но и частичная
деэтерификация последней. Это оценивается положительно в тех случаях, когда получают пектин
лечебно-профилактического назначения высокой комплексообразующей способностью. При
получении пектинов-структурнообразователей важно сохранить высокую степень этерификации,
поэтому целесообразно использовать первый путь ферментативного гидролиза сырья. При гидролизе
целлюлозы облегчается выход комплекса полигалактуроновой кислоты и гемицеллюлоз из клеточных
стенок.
Гидролиз гемицеллюлоз приводит к повышению содержания полигалактуроновой кислоты в
выделяемом пектине, при отсутствии в используемых ферментных препаратах пектолитических
ферментов полигалактуроновая кислота пектина не расщепляется, а степень ее этерификации не
изменяется. Получаемый пектин содержит частично метоксилированную полигалактуроновую
кислоту, ковалентно связанную с фрагментами гемицеллюлозы, поскольку полное отщепление
нейтральных полисахаридов обычно не достигается. Одновременно с этим из сырья выделяются
растворимые формы пектина, если они не извлечены на предшествующих стадиях переработки
сырья[7]
Следовательно, отработка эффективных технологий извлечения пектина,
щадящим
ферментативным способом, из выжимок овощей, в частности из столовой свеклы и моркови, после их
переработки, т.е. получения овощных соков, напитков, с последующим обогащением их пектиновым
экстрактом, является весьма необходимым в технологическом режиме их производства.
Как видно из отмеченного разработка глубокой технологии переработки овощей направленная
на вытяжку из отходов производства напитков из овощей (столовой свеклы и моркови) используя,
эффективный ферментативный способ извлечения пектина из их выжимом, с последующим
обогащением полученной продукции, несомненно, повысит технологические качественные показатели
продукции и их рыночную восстребованность, что является несомненно актуальной и жизненно
важной.
1. Есполов Т.И., Мамышов М.М., Сулейменова Н.Ш. Современное состояние сельскохозяйственных угодий и
перспектвы развития экологического образования в аграрном секторе республики Казахстан// Вестник сельскохозяйственной
науки Казахстана.-2010.-№ 7.- С.31-36.
2. Кусаинова А.Б. Текущее состояние и дальнейшие перспективы развития отраслей переработки
сельхозпродукции.//Пищевая и перерабатывающая промышленность Казахстана.- №1.-2008.- С.2.
3. Широков Е. П., Полегаев В. И. Хранение и переработка плодов и овощей. – М.: Агропромиздат, 1989.
4. Токтосунова Б. Стабилизация пектином каротиноидов морковного сока // Пищевая промышленность.-2007.-№6.-С.
16-18
5. Левченко Б.Д. Использование полезных свойств пектиновых веществ в медицинской практике // Электротехнология
пектиновых веществ: Тез. Докл. 4 н.-т. Сем.-К., 1993.- с.ЗО.
6. Бондарь С.Н., Голубев В.Н. Экстрагирование свекловичного пектина // Пищевая промышленность, 1992, №12, С.1819.
7. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. - Москва, 1995,-387с.
48
М.Т. Велямов, Р.Ж. Бержанова, М.М. Амирбаева, А.А. Амангелді
КӨКӨНІСТЕРДІҢ МИКРОБИОЛОГИЯЛЫҚ ЛАСТАНУЫНЫҢ МОНИТОРИНГІ КЕЗІНДЕГІ
НЕГІЗГІ КӨРСЕТКІШТЕРДІ ЗЕРТТЕУ
(ЖШҚ «Қазақ ҒЗИ қайта өңдеу жəне тағам өнеркəсібі» 1, əл-Фараби атандағы Қазақ Ұлттық
университеті 2)
Тағам жəне қайта өңдеу өнеркəсібінде жоғары сапалы өнімдерді кең көлемде алуда маңызды
болып, негізгі бөлігін қолданылатын шикізаттың сапасы болып табылады. Зиянды заттардың саны
айтарлықтай көп – бұл металлдар, пестицидтер, радионуклидтер, токсиндер, микроорганизмдер дəрілік
препараттар жəне т.б. /1/.
Бірақ, əр түрлі ластағыштардың (пестицидтер, ауыр металлдар, радионуклеотидтер жəне т.б.)
əсерінен микроорганизмдер қауымдастықтарындағы фитотоксикалық қасиеттерге əкелетін өзгерістер
басты қауіпті тудырады: олардың түрлік əркелкілігі артады, сандық реттелуі бұзылады, түрлік
басымдылық өзгереді. Осының бəрі елдегі экологиялык жағдайдың нашарлауын көрсетеді жəне бұл
тікелей адамның антропогенді іс–əрекетімен байланыстылығын анықтайды, дəлірек айтқанда, бұл
ауылшаруашылық өнімдерінің, соның ішінде өсімдік шаруашылығындағы гербицидтер қалдықтары,
ауыр металлдар мен микробиологиялық ластану жəне т.б. /2/.
Көріп отырғанымыздай, өсімдік шаруашылығы өнімдерінің жарамсыздығын тудыратын негізгі
себеп микроорганизмдер болып табылады.
Көкөністердегі микроорганизмдердің көбеюін зерттей келе, көкөністерде болатын негізгі
витаминдер көзі, микро жəне макроэлементтерге адам организміндегі иммундық жағдай тікелей
тəуелділіггі анықталды.
Берілген мақалада картоп, сəбіз, орамжапырақ, қызанақ көкөністерінің микробиодлогиялық
ластануы бойынша мониторинг жүргізу арқылы жеке зерттеулер нəтижелеріне жəне əдебиет көздеріне
негізделген аналитикалық ақпараттар берілген.
Жоғарыда аталғандай, картоп жəне көкөніс дақылдарының тағамға жарамсыздығының негізгі
себебі – сыртқы ортадан түскен микроорганизмдердің активті дамуы. Мысалы, орамжапырақтың
сыртқы жаппырақтары 1 г топыраққа есептегенде 1-2 млн. микроорганизмдер қауымдастықтары
болады. Одан да көп микрофлора картоп түйіндері мен тамыр жемістілерде болады, өйткені олар
топырақта қалыптасады, ал 1 г топырақта 2-3 млрд. микроб клеткалары жəне адам үшін патогенді
болып табылатын əр түрлі микроорганизмдер түрі кездеседі /3/.
Көкөністердің бетінде өнімнің тез бұзылуына жəне олардағы токсиндердің түзілуіне алып
келетін алып келетін ішек таяқшалары, сапрофиттер, протейлер, коккалар, актиномицеттер, зең
саңырауқұлақтар, ашытқылыр жəне т.б. микроорганизмдер болады /4/.
Жемістер мен көкөністерді сақтау кезінде қалыпты тіршілік процестерімен қатар түрлі
микроорганизмдер əрекетімен жəне дамуымен болатын өзгерістер жүреді, бұл өз кезегінде,
көкөністердің бұзылуы мен ауруына алып келеді. Ал қалыпты жағдайда өнімдердің беткі жағында ауру
тудырмайтын эпифитті микроорганизмдер кездеседі. Көп жағдайда саңырауқұлақтардың түрлерінен,
жиі бактериялар əсерінен ауру туындауы мүмкін /5/.
Көкөністер мен өнімдердегі судың жəне қоректік заттардың жоғары мөлшерде болуы көптеген
микроорганизмдер үшін қолайлы жағдай болып табылады сондықтан оларды булануды болдырмау
үшін ауа ылғалдылығының жоғары (85-95 %) жағдайында сақтауды қажет етеді. Осының нəтижесінде
аталған көкөністердің микроорганизмдер дамуының салдарынан бұзылуы оңай болады, яғни
өнімдердің нағыз иммунитеті тез төмендейді /6/.
Көптеген зерттеулер нəтижелері бойынша саңырауқұлақтардан (фитофтороз, фузариозды
құрғақ шірік, фомозды шірік жəне т.б.) бактериалдық аурулардан (ылғал шірік, қара тұяқ, сақиналы
шірік) жыл сайын 30% өнім ысрабқа ұшырайды /7/.
Фитофтороз – өте кең таралған ауру тудырғыш, қауіпті картоп ауруы болып табылады. ауру
қоздырушыс - саңырауқұлақ Phytophthora infestans (Mont) de Bary, ол қыс кезінде зақымдалған
түйнектерде сақталады да бириншілік инфекция ошағы болып табылады. Түйнектердің зақымдалуы
жинау кезінде, сонымен қатар, вегетация кезіндегі тамшылы су жаңбыры жəне өсу кезінде болады /8/.
Фузариозды шірік – ауру құрғақ жəне ылғалды шірік түрінде дамиды. Құрғақ шірік кезінде
сəбіздерде еніп кеткен ашық түсті дақтар байқалып , ұлпа ашық не ақшыл – қоңыр түсті болып, орта
жағы қуыстанған күйде болады. Қоздырушылары: Fusarium: F.coeruleum, F. solani, F. sambucinum, F.
oxysporum, F. Cumartii /9/.
Сакиналы шірік – қоздырушысы Corynebacterium sepedonicum картоп өсірілетін негізгі
аудандарда таралған. Өнім ыстабы 40% дейін жоғарылауы мүмкін /10/.
49
Ылғалды бактериалдық шірік – тамырөнімділердің бактериалдық ауруы. Зақымданған ұлпа
ылғалды созылмалы болып, коптеген бактериядан тұрады да жағымсыз иіс түзелі. Əдетте тамырдың
құйрақ жағынан басталады. Қоздырушысы – бактериялар туысына Pectobacterium. Corynebacterium,
Pseudomonas, Bacillus жатады. Ылғал шіріктен жыл сайын 10% өнім ысрабқа ұшырайды, ал кей
жылдары 30-60% . түйнектердегі осы жəне басқа да бактериялардың болуы картопты сақтау кезінің
жағдайларымен байланысты.
Бактериялардың барлық түрлерінің іс-əрекеті сақтағышта температура жəне ауа ылғалдылығы
жоғарылауы əсерінен болатын жеткіліксіз вентеляция кезінде айтарлықтай жоғарылайды. Бактериялар
түйнектерге механикалық зақымдалулар арқылы түседі, қотырмен зақымдалу, фитофтороз, фомоз,
құрғақ шірік, сонымен қатар, шіркейлер жəне фитогельминттермен зақымдалу кезінде.
Тасымалдау жəне сақтау кезіндегі сəбіздің негізгі ысрабы ақшыл жəне сұр шірік, фомоз, сұр зең
жəне бактериалды аурулардан болады. Сəбіз көкөнісі ішінен ең көп таралған шірік аурулары (сұр,
ақшыл, қара). Əсіресе, зиянды сұр шірік.
Сұр шіріктің қоздырушысы - Botrytis cinerea Pers саңырауқұлағы. Ол əдетте сақтауға қойған
уақыттан 1-2 ай өткеннен соң зақымдайды. Қоздырушысы топырақтағы өсімдік қалдықтарында
сақталып, сол арқылы сақтау орындарына, яғни қоймаларға барады.
Фомоз ( құрғақ шірік) – қоздырушысы Phoma rostrcepii саңырауқұлағы. Вегетация немесе
жерде сақтау кездерінде өсімдік зақымданады. Сақтау барысында өнімде қара түсті дақтар пайда
болады. Зақымданған ұлпа бұзылып, қуыстар пайда болады. Қоздырушысы ұрықтар мен топырақта
сақталады.
Картоп жəне сəбізді сақтау кезіндегі аурудың зияндылығын төмендеуі көп жағдайда арнайы
шаруашылықта қарастырылатын, агротехникалық, биологиялық жəне химиялық əдістер күресу
жағдайларының дұрыс жүргізілуіне тəуелді.
Сақтау кезіндегі микроорганизмдер əсерінен туындайтын негізгі аурулар механикалық
зақымданған ( қысымшылық, зақымдылық, айғыздар жəне т.б.), əлсізденген, тіптен еш зақым келмеген
түрде сипатталуы мүмкін. Олар өнім ұлпаларын тез бұзатын жəне химиялық құрамын өзгеріске
ұшырататын ферменттердің көптеген түріне ие болып келеді. Микроорганизмдерге қорек ретінде
клетка қабықшасы арқылы қоршаған ортадан түсіп отыратын əтрүрлі ерігіш заттар бола алады.
Микроорганизмдермен зақымданған өнімдер шіріп кетеді, бұзылады, тұтынушылық қасиеттерін
жоғалтады /11/.
Сақтаудың оптималды жағдайы сатылымға шығатын сау өнімнің жоғары қауіпсіздігін
қамтамасыз ете алмайды. Бұл патогенді микроорганизмдердің қолайсыз жағдайға жоғары бейімделу
қабілеттілігімен түсіндіріледі /12/.
Сақтаудың ұзақтылығы бірқатар факторлармен анықталады, дақылдарды өңдеудегі топырақклиматтық
əсерден бастап, сұрыптық ерекшеліктер тыңайтқыштарды рационалды қолдану,
агротехникадан, суарудан, зиянкестерден қорғау жүйесінен (аурулардан жəне арамшөптерден), жинау
əдістері жəні мерзімінен, өңдеу жəне де сақтау жағдайлары мен əдістерімен анықталады.
Көкөністердегі барлық биохимиялық процестердің бəрі температураға тəуелді. Жоғары
температурада зат алмасу процестері тез жүреді, ылғал, витамин, органикалық заттар азаяды. Зат
алмасу процестерінің температураға тəуелділігі Wan Hoff санымен анықталады. Мысалы, сəбіз жəне
орамжапырақ үшін бұл сан 2 жəне 3 аралығында болады, яғни, 10°С жоғары температурада тыныс алу
қарқындылығы екі немесе үш еселенеді /13/.
Организмнің микроорганизмдер əсеріне қарсы тұру қасиеті иммундылық деп аталады. Өсіп
жатқан, дамып жатқан жемістер, түйнектер, түйнек жемістер əлсіз немесе ескіргендерге қарағанда
ауруларға төзімдірек болып келеді. Белгілі, көптеген аурулар жинау жəне тасу барысында зақымданған
үлгілерде байқалады. Өнімдердің ауруларға деген тұрақтылығына ұлпалардың құрылымы мен өнім
қабығы əсер етеді. Қаншалықты ұлпа мен қабықша тығыз болса соншалықты микроорганизмге
клеткаға ену қиын болады. Өнімдердің эпидермис пен басқа да ұлпаларының қалыңдығы мен
құрылымы əр түрлі сорттарда ерекшеленеді. Сондықтан, эпидермисі қалың жəне микроорганизмдерге
ішіне енуі қиынға соғатын көкөністерді өсірген тиімді /14/.
Сондықтан, агротехникалық жағдайларды ескере отырып, көкөністер мен картопқа жүргізілген
микробиологиялық мониторинг көрсеткіштері - экологиялық таза жəне бəсекеге қабілетті өнім
шығаратын өндірісте жəне оларды алдын ала ескеру шаралары үшін ауылшаруашылық өнімдерді қайта
өңдеу бағытында маңызды болып табылады.
Жоғарыда айтылғандарға сүйене отырып санитарлық ережелерге жəне норма (СанПиН) «Тағам
өнімдерінің тағамдық құндылығына жəне қауіпсіздігіне гигиеналық талаптар» (№ 4.01.071.03
50
11.06.2003жыл) көкөністердің микробиологиялық көрсеткіштеріне мониторингтік зерттеулер
жүргіздік.
Көкөністердің – сəбіз, орамжапырақ, картоп, қызанақтың микробиологиялық ластануына
зерттеу үшін үлгілерді дайындау жəне таңдау ГОСТ-у 26668 бойынша жүргізіледі.
Сəйкесінше анализ жасалынған үлгілерде колония түзу бірлігін (КТБ), мезофилді аэробты жəне
факультативті анаэробты микроорганизмдер үшін ГОСТ 10444.3-75 бойынша, ашытқылар үшін ГОСТ
10444.12-75 бойынша, ал мицелиалды саңырауқұлақтар үшін ГОСТ 10444.13-75бойынша анықталды.
Таза дақылдарды алу үшін жəне микроорганизмдердің биохимиялық идентификациясы үшін
,өскени колонияларды стандартты агарлы немесе сұйық орталарда егу жүргіздік.
Көкөністердің жəне картоптың беткі қабатынан бөлініп алынған бактерия, ашытқы жəне
саңырауқұлақ микрофлораларының туыстарын идентификациялау үшін, сəйкесінше, бактерия,
ашытқы, саңырауқұлақ анықтауыштары арқылы жүргіздік /15,16,17/.
Көкөністердің микробиологиялық ластануына жүргізілген мониторингтік зерттеулер нəтижелері,
сау өнімнің (бақылау) эпифитті микрофлорасының сандық құрамы жəне ауру белгілері анықталған
(тəжиірбе) өнімдердің үлгілерінің микрофлорасы келесі кестеде берілген.
Кесте 1 – Классикалық микробиологиялық əдіс арқылы алынған КТБ нəтижелері
Өнімнің атауы
Үлгі
Көкөніс микрофлорасы
бактерия
картоп
орамжапырақ
сəбіз
қызанақ
ашытқы
мицелиалды саңырауқұлақ
бақылау
1х103
2х103
2х101
тəжірибе
8х104
30х103
4х101
бақылау
1х105
4х102
1х103
тəжірибе
5х105
16х103
2х101
бақылау
3х103
21х103
1х102
тəжірибе
2х105
40х103
1х103
бақылау
10х103
20х103
1х101
тəжірибе
2х105
50х103
4х102
Көкөніс жəне картоп үлгілеріне жүргізілген микробиологиялық зерттеулердің салыстырмалы
анализінде анықталғандай, бактерия, ашытқы, мицелиалды саңырауқұлақтардың КТБ анықтауда нақты
нəтижелер алынды. Сонымен қатар, берілген нəтижелер жоғарыда аталған Қазақстан Республикасында
тіркелген СанПиН көсеткіштерімен сəйкес келеді.
Картоп жəне көкөністерінің эпифитті микрофлорасын сапалы бағалаудағы микробиологиялық
зерттеулер нəтижелері төмендегідей микроорганизмдер бар екенін анықтады: бактериялар туысынан Azotobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Lactobacillus, Bacillus, Sarcina, Acidominococcus,
Corynebacterium, Enterobacter, Micrococcus; ашытқылардан - Saccaromyces; мицелиалды
саңырауқұлақтардан - Fusarium, Penicillum, бұлар жоғарыда аталған көкөністердегі аурулардың
этиологиясына қатысада.
Сонымен, өсімдік шаруашылығы өнімдерінің микробиологиялық ластануына зерттеулер
жүргізу арқылы, оларды сақтау жəне өсіру кезеңдеріне микроорганизмдердің КТБ анықтау бойынша
микробиологиялық зерттеу жүргіжу, алдын ала ескерту шараларды эффективті жасау мақсатында жəне
сапалы, қауіпсіз өнім алу үшін сонымен қатар, өнімдердің шығымының төмендеуі мен ұзақ мерзімде
сақталуы үшін өте маңызды екендігі бізге белгілі болды.
1 Тыныбек Е.Г. Виды пищевой продукции в законе «о безопасности пищевой продукции»// Ж. Пищевая и
перерабатывающая промышленность Казахстана,-№4,-2007г.
2 Кусаинова А.Б. Текущее состояние и дальнейшие перспективы развития отраслей переработки
сельхозпродукции.//Ж. Пищевая и перерабатывающая промышленность Казахстана,-№1,-2008г.-С.2.
3 Хранение и технология с/х продуктов. Под ред. Л.А. Трисвятского,М., Колос,1975.446с.
4 Калин Ю. Применение озона при хранении свежих овощей и фруктов, Молдова. .
5 Широков В.П., Полегаев В.И. Хранение и переработка плодов и овощей. – М.:Агропромиздат, 1982. – 196 с.
6 Лукьянец В.Н., Амиров Б.М. Столовые корнеплоды. Алматы, Алейрон, 2006.-68с.
51
7 Хранение картофеля. Рекомендации под ред. Бабаева С.А.– Кайнар, 2006. – 18 с.
8 Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля,- М.:Колос,1980.-с.304.
9 Искаков Н.С. и Сарсенбаев К.Б. Фузариозная сухая гниль картофеля на юго-востоке Казахстана и меры борьбы с ней
// Научная основа возделывания картофеля в Казахстане.-Алма-Ата,1980.-С.154-166.
10 Дьяченко В.С. Болезни и вредители овощей и картофеля при хранении.М.:Агропромиздат,1985.- С.4, 11, 41.
11 Турбекова А.С. Сохраняемость картофеля и моркови при использовании препаратов из растительного сырья.
Автореф. Дисс.на соиск.уч.степени канд.наук, Алматы. 1999.
12 Петак Г, Садовская Н.Особенности хранения моркови.
13 Ярмилка В. Современные способы хранения плодов, овощей, ягод и винограда, Украина. .
14. Избасаров Д.С, Урюпина Т.Л., Султанова З.К., Амиржанов Б.С. Формирование и прогнозирование устойчивости и
качества плодов яблони и винограда.//Монография-Алматы:Мектеп,2006,256 с.
15 Краткий определитель Берги. Под редакцией Дж. Хоулта – М.: Издательство «Мир», 1980, 494 с.
16 Определитель бактерий Берджи 9-е изд. в 2-х т. /Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильмс. /Пер. с англ.
под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина – М.: Мир, 1997. т.1. – 432 стр., т.2. – 368 стр.
17 Красильников Н.А. Определитель бактерии и актиномицетов. – М.-Л. – АНСССР. – 1949 – 201с.
УДК 608.2:62.
М.Т. Велямов, А.А. Амангелды, М.М. Амирбаева
КАРТОПТЫ, ОРАМЖАПЫРАҚТЫ, СƏБІЗДІ САҚТАУ КЕЗІНДЕ
МИКРООРГАНИЗМДЕРДІҢ ТҮРЛЕРІН АНЫҚТАУ
(ЖШҚ «Қазақ ҒЗИ қайта өңдеу жəне тағам өнеркəсібі»1, əл-Фараби атандағы Қазақ ұлттық
университеті 2)
Қазіргі кездегі қоршаған ортаның қолайсыз жағдайларында ерекше маңыздылықты
экологияның өзара байланысы жəне азық – түлік өнімдерінің қауіпсіздігі мəселесі алады. Көптеген
ғалымдардың зерттеулеріне сəйкес азық –түлік қнімдерінің қауіпсіздік мəселесі Қазақстан
Респбликасының барлық өңірлерін қамтыған. Осыған орай, тағамдық өнімдердің жəне шикізаттардың
əр түрлі микроорганизмдермен ластануы ерекше қауіп тудырады. Микроорганизмдермен ластанған
өнімдерді пайдалану адамдарда ауру туғызуы мүмкін.
Бұл мақалада картоп, орамжапырақ жəне сəбіз көкөніс өнімдерін сақтау кезіндегі үнемі
кездесетін микроорганизмдердің идентификациясы жайында мəліметтер көрсетілген.
Зерттеу материалы ретінде «Аксор», «Тамыр», «Тоқтар» -картоп сорттары, «Алау», «Шантенэ»
- сəбіз, «Бегабатская», «Ташкентская» -орамжапырақ сорттары, оңтүстікте 2 шаруашылықта: Алматы
облысының таулы аймағында орналасқан Қарасай ауданындағы Қайнар жəне Оңтүстік Қазақстан
облысының Сайрам ауданындағы Тассай ауылдарында өсірілген.
Зерттеу объектісі ретінде – бактерия, ашытқы жəне мицелиалды саңырауқұлақ
микроорганизмдері болды.
Микроорганизмдер санын қоректік орталарға тереңдік егу əдісін пайдаланып анықтады.
Инкубация бактериялар үшін +28...30°С температурада, саңырауқұлақтар мен ашытқылар үшін
+25...27°С температураларда жүргізілді. Өскен колонияларды санау (КТБ –колония түзу бірлігі)
бактериялар үшін 2 тəулікте, саңырауқұлақтар мен ашытқыларға 5-7 тəулікте жүзеге асырылды.
Микробиологиялық ластануды бақылау көкөніс өнімдерін сақтау мерзімінде өткізілді.
Зерттеулер мен нəтижелер
Микробиологиялық зерттеулер нəтижесінде көкөніс үлгілерінің (сəбіздің, орамжапырақтың,
қызанақтың) жəне картоптың микрофлорасы бактериялармен , ашытқылармен жəне зең
саңырауқұлақтарынан тұратыны анықталды.
Оңтүстік Қазақстан өлкесінен алынған зерттелетін үлгілердегі жоғарыда аталған
микроорганизмдер КТБ анықтау барысында, бастапқы кезеңдермен салыстырғанда 6 ай сақталғаннан
соң бұл көрсеткіштің барлық зерттелген микроорганизмдерде 1-2 lg10 ге дала шарттарындағы
көкөністердің технологиялық өңдеулердің белгілі дəрежесіндегі əсермен салыстыра анықтадық.
Сонымен қатар, кейбір ашытқылардың КТБ корсеткіштерінің жоғарылауын Петри табақшаларында
өсіру барысында ашытқылардың өсуін шектеген мицелиальды саңырауқұлақтар өкілі Alternaria
туысының азаюы немесе мүлдем болмауымен байланыстыруға болады. Алматы жəне Оңтүстік
Қазақстан облыстарынан алынған зерттеу сынақтарындағы (проба) зерттеу нəтижелерінің кейбір
өзгешеліктерін өсірілетін көкөніс сорттарының өсірудегі жəне табиғи өзгешеліктерімен түсіндіруге
болады.
Сонымен бірге, көрсетілген шаруашылықтардан алынған сынақ үлгілерінде өсірудің барлық
сатыларында келесі микроорганизмдер байқалды, сəбізде: бактериялар – Azotobacter, Micrococcus,
Pseudomonas,Bacillus, мицелиалды саңырауқұлақтар – Alternaria жəне саңырауқұлақ –
Saccharomyces;орамжапырақта белокачанды: бактериялар – Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus,
52
мицелиалды саңырауқұлақтар – Alternaria жəне саңырауқұлақ – Saccharomyces, картоп үлгілерінде:
бактериялар – Azotobacter, Micrococcus, Pseudomonas, Bacillus, Acidominococcus,жəне мицелиалды
саңырауқұлақтар – Botrytis,Alternaria жəне саңырауқұлақ – Saccharomyces. Бұдан басқа, п.«Тассай»
үлгілерінен осы кезеңде қосымша келесі микроорганизмдер анықталды. Сəбіздің «Шантенэ» сорты:
ашытқылар
–
Phaeococcus,
Torulopsis,
Rhodotorula,
Schizosaccharomyces,
белокочанды
орамжапырақтың «Ташкентская» сорты: бактериялар – Enterobacter жəне ашытқылардан –
Debоrymyces, Schizosaccharomyces,картоп үлгілерінің «Тохтар» сортында белгілі болды: бактериялар –
Pseudomonas жəне ашытқылар - Phaeococcus, Torulopsis, Rhodotorula, Schizosaccharomyces,
Criptococcus;«Аксор» сортында бактериялар – Micrococcus, Pseudomonas, ашытқылар – Phaeococcus,
Torulopsis, Rhodotorula, Criptococcus; Осы уақытта п. «Қайнар» алып келінген үлгілерде қосымша
орамжапырақтарда Rhodotorula ашытқылары, «Аксор» жəне «Тамыр» сорттарынан Debaromyces,
Torulopsis, Rhodotorula, Criptococcus ашытқылары жəне мицелиалды саңырауқұлақ - Monillia
анықталды.
Аналитикалық зерттеулердің нəтижесінде əдебиеттермен анықталғандай, Pseudomonas
туысының микроорганизмдері картоптың «Ылғалды шірік» ауруының этиологиясына қатысатындығы,
ал Bacillus бактерияларымен біріксе сəбіз жəне қызанақта аналогиялық ауруларға себеп болады.
Corynebacterium туысының бактериялары орамжапырақтарда «Сақиналы шірік» ауруына қатысады.
Fuzarium туысының бактериялары сəбіздің «Фузариозды құрғақ шірік», ал Bоtrytis – «Сұр шірік»
ауруларына себеп болады. Демек, микробиологиялық ластанудың мониторингін жүргізуде зерттелетін
көкөніс үлгілерінде аталған микроорганизмдердің
Осы мəліметтерді негізге алып, микробиологиялық тұрғыдан қауіпсіз жəне сапалы көкөністік
өнім алудаолардың микрофлорасын анықтау үшін мониторингтік зерттеулер жүргізілуі керек. Өйткені
корсетілген микрооганизмдер тағамдық өнімдерді дайындауда сақталуы мен қауіпсіздігіне əсер етеді.
1 Ремеле В.В., Абилева А.К., Атабаева Б.С., Махамбетова Р.И. Микробиологический мониторинг зерна различных
культур урожая 2007 г. в различных регионах Казахстана//Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана 2/2009,стр.63-64.
2 По итогам конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов»//Хранение и
переработка сельскохозяйственного сырья, 11/2004, стр.58-62.
3 Фробишер М. Основы микробиологии. Изд-во «Мир». – М.1965., 678 С.
4 Широкову Е.П «Практикум по технологии хранения и переработки плодов и овощей». – М. Колос, 1974.
***
В данной статье представлены результаты по идентификации наиболее часто встречающихся микроорганизмов в
стадии хранения овощных культур таких, как картофель, капуста и морковь.
***
In given article are presented results on identifications of most constantly meeting microorganisms to stages of cultivation of
vegetable cultures, in particular a potato, cabbage and carrots.
L. Damdinsuren, Ts. Selenge, D. Tsend-Ayush
МEAT VALUE CHAIN ANALYSIS,RENEWAL STRATEGYIN MONGOLIA
(Mongolian University of Science and Technology)
Моngolia besides fully supplying its population’s meat demand, it also has 30-40 thousand ton of meat reserve annually,
other value added products of butchering, total of 100 million USD export products, also meat processing and exporting experiences
[1]. Therefore guaranting pastoral Mongolian meat’s value, informing international market, improving value added meat and meat
products export has important significance in Mongolian meat industry, stock raising and its veterinary development. Моngolia has
enough meat reserve and its law, legal environment, state policy and strategy have been basically defined to support and develop
meat market. Mongolian meat market analysis results have been united and completed in SWOT analysis, and some strategysuggestions have been promoted for value chain’s renewal.
Key word:SWOT, production, supply, export, market
Preface
Моngolia supplies 8,2 million head of stock annually which is 223,1 thousand ton of meatfor its
population’s meat demand, and even though it is capable of exporting 30-40 thousand ton of meat and meat
products annually, its average annual meat export is 16-18 thousand ton[3]. One of progresses which occured
in meat export is mutton and goat meat’s export increase, total of 28,9thousand ton meat has been exported in
2010, and 41.7% is held by this progress. In 2010 stock meat, gut and byproducts export has exceeded by 1.5
times comparing with last year[4, 5].
53
In order to renew meat value chain wholly in Mongolian domestic market, reliable chain of supply with stock
origin, meat, product’s veterinary hygiene, sanitary fully guaranteed product is “hersmen-stock preparers-meat
factory-specialized trade units” and further it is possible to implement food safety control’s ISO 22000
standard in every participant’s activity of this chain[2,3].
1. Мeat value chain analysis
According to Mongolian state constitutional law,stock is under government protection, according to
Food law meat is “strategically important product” and that is why government is implementing “Моngolian
stock”, “Food safety”etc national programs and steps to perfect meat value chain in orderto protect stock
health, support meat production and export. Mongolian`s meat market survey’s result has been united and
analyzed with SWOT(Table 1).
Table 1
Мeat value chain SWOT analysis
Advantage
Мeat general reserve is sufficient, meat product
need is stable, according to Mongolian state law
meat is a strategically important product;
Моngolian government, administration,
international organizations, donor countries are
implementing plans and projects to improve stock
origin and breed, fight infectious and noninfectious stock diseases, support meat production
and export.
Foreign market agree that pastoral stock meat is
better than farm stock in nutritive biological
significance and its usagecharacteristics.
Opportunity
Implement law of agricultural originated goods and
product exchange, “Моngolian stock”, other plans
and projects,also increase factory processed meat
amount;
Increase production of value added product from 1
stock and increase cost chain participants’ revenue
Develop veterinary, meat processing factory, trade,
logistical enterprises’ collaboration and cooperation,
occupy stable place in foreign market with meat and
meat production, food and nutritional products and
technical products.
Disadvantage
Danger and risk
Мeat processing factory’s marketing control is
unsatisfactory and current asset is not enough;
Do no fully consider foreign market
requirementsfor meat processing technology
renewal.
High possibility of natural and climatic
unpleasant phenomenon and catastrophe;
Underestimate Моngolian stock and meat’s
value, block from entering foreign market, preparing
meat in illegal way and exporting has increased
recently.
Within government policyframe to improve herdsmen’s living standard and develop agro-business chain
“Аgricultural originated goods and product exchange law”, “Моngolian stock” and other programs have been
implemented and this provides opportunity to increase production of value added product from 1 stock,
increases revenue of value chain participants, improves cooperation and collaboration of veterinary, meat
processing factory, trade and logistical units, occupies stable rank in foreign market with meat, meat products,
food and nutritionaltechnical goods.
Meat value chain renewal goal and implementing strategy, result data have all been defined based on
SWOT analysis (Table 2).We have selected 2 factors which shows stock production, supply stages, value
chain’s internal factor’s advantages and disadvantages, 2 factors of external factor’s decent environment’s, and
also 2 main factors ofadverse environment. Out of 4 internal factors in stock production, supply stages and
value chain, the most influencing factor is dealer’s chain (33,4%), and meat butchering hygiene condition
(26,5%). However the most influencing external factor is herd structure(47,3%), investment and loan origin
(28,3%)(Figure 1).CI describes value’s reality compatible condition’s index, and CRdescribes its compatible
condition’s ratio. When CR<0.1 it is seen as value has reached compatibility. Мeat production, supply’s
internal factor is CR=0,024, external factor is CR=0.057 so it fulfills requirements.
Agricultural originated goods, establish herdsmen accomplice who will participate in product exchange
activity, level up its activities, provide value added meat and product for export, considering population’s
purchase ability locate low price product’s meat factory, explore new power, implement technological
renewing programs etc matters needs to be settled.
54
Table 2
Мeat value chain’s SWOT analysis matrix
Internal factors
External factors
Advantage (S)
Disadvantage (W)
Decent condition (O)
Adverse condition(T)
One. Мeat production, supply stages, value chain
1.Мeat reserve, need
3.Hygiene
1.Government support 3.Law and business
2.Production capacity
4.Dealers chain
2.Investment, loan
environment
origin
4. Herd structure
Internal factors’ valuation matrix
1
2
3
4
PV
1.
1
3
0,33
0,247024
1
2.
1
1
0,33
0,153274 λmax
4,066719
1
3.
0,33
1
3
0,264881 CI
0,02224
1
4.
3
3
0,33
0,334821 CR
1
0,024711
5,33
6
5,33
4,67
1
External factors’ valuation matrix
1.
2.
3.
4.
PV
1.
0,33
1
0,33
0,122024
1
2.
3
3
0,33
0,282738 λmax
4,154268
1
3.
1
0,33
0,33
0,122024 CI
0,051423
1
4.
3
3
3
0,473214 CR
1
0,057136
1
8
4,67
8
2
SWOT matrix
IC
EC
Current
-0,248
-0,261
2015
0,003
0,014
2021
0,245
0,247
Figure 1. Мeat value chain factors influencing amount
2. Value chain’s renewal strategy
Renewal’s strategical tendency that is based on meat value chain’s results aim to overcome
consequences and based on this sector’s internal environment’s advantages use external environment’s
pleasant opportunities in short time, weaken non-pleasant influences in medium term, remove its
disadvantages in medium term, also improve its weak point in dangerous conditions(Table 3).
Table 3
Мeat value chain’s SWOT analysis result, strategy tendency
SO-based on this sector’s advantages use external
WO – by improving sector’s disadvantages use
environment’s pleasant opportunities:
external environment’s pleasant opportunities:
Short-term strategy
Medium-term strategy
- Let herdsmen’s group and accomplice develop into Receive stock, drive herd to factory, determine
agricultural unit’s exchange participant, let
pastoral and herd driving road;
“dealers” get involved in stock preparing and
Advertise pastoral stock meat’s nutritional and
55
-
-
-
supply chain;
Grant current asset loan to meat processing
factories, establish price and reward structure based
on stock quality and hygiene index;
Based on renewal of meat factory’s technology,
stock reserve and population settlement implement
new factories building activity in Agricultural
master plan frame.
ST – based on sector’s advantages use overcoming
opportunities of external environment’s nonpleasant influence:
Medium-term strategy
Extend processing factory’s seasonal work
through feeding out stock, storing meat, meat and
bone flour, other types of fodder, stock raising
utility’s production etc, approve and support help
suggestionsfor herdsmen;
Improve soum’s veterinary, processing factory’s
hygiene control-rating laboratory’s ability
biological advantages, expand foreign channels,
receive foreign consulting service in order to increase
value added meat and meat products, technical and
nutritious goods export;
Meat value chain participants need to get
certificated training in stock and meat preparing and
supply, its storage, sales hygiene
WT –by improving its weak point in sector’s external
environment’s non-pleasant condition and overcome
its consequences:
Long-term strategy
Establish “Meat” complex and cluster in stock
reserve territory;
Implant meat value chain’s good agricultural
practice (GAP, GMP, GLP), danger analysis, critical
point control structure (HACCP), and ISO 22000
standard;
Establish “Organic Mongolian meat”, “Mongolian
sheep gut” brands, government and private sectors and
implement it together.
Strategy tendency will develop herdsmen’s group and accomplice into agricultural exchange
participant in short time, let “dealers” get involved in stock preparing and supply chain, grant current asset
loan to meat processing factories, establish price and reward structure based on stock quality and hygiene
index, based on technology renewal, stock reserve and population settlement implement new factories building
activity in Agricultural master plan frame, extend stock preparing and meat production’s seasonal work in
medium term, approve and support help suggestions for herdsmen, improve soums’ veterinary and processing
factory’s hygiene and control-rating laboratory’s ability, establish “Meat” complex and cluster in stock reserve
territoryin long term, implant meat value chain’s good agricultural practice(GAP, GMP, GLP), danger
analysis, critical point control structure (HACCP) and ISO 22000 standards, establish “Mongolian organic
meat”, “Mongolian sheep gut” brands and set its implementing goals.
Under unified goal to increase Mongolian organic meat, meat originated value added other products’
export, producer and government needs to implement special program(Figure 2).
Figure 2. Оrganic meat, goods, product export’s increasing tendency
In order to improve stock preparing and supply, set hygiene proper habit in meat production and sales
chain, standard implementation, provide product safety, improve local control and laboratory capacity,
producers have been doing lot of work. Keep hygiene good agriculture practice(GAP, GHP, GMP, GLP)in
meat value chain’s every stage, provide safety, execute local control, danger analysis, critical point control
structure (HACCP), needs close collaboration between EU and other international organization in order to
conduct ISO 22000 international safety control standard in food chain. This will become fundament for
Mongolian stock and meat production to enter non-traditional foreign market.
1. L.Dadminsuren. Mongolian meat industry development strategy.- // Collected report of International scientific practical
conferences, Bashkortoston, March 25-26 of 2010, pages 216-221
2. L.Damdinsuren. Mongolia’s meat market various analysis, strategy. - //“Proper usage of food-technology” Research
conference summa , UB., 2011
3. Report of Meat value chain study, Mongolian Organic Meat Research Center., UB.,2011
56
4. Mongolian Statistical Yearbook, 2010
5. Agriculture sector in 2010, National Statistical Office of Mongolia
6. www.monorgmeat.mn
С. Дэлгэрмаа, Ц.Цэрэндулам
БИОЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ
МИКРООРГАНИЗМОВ
(Монгольский Государственный университет науки и технологии, г.Улан-Батор, Монголия
*Институт пищевой инженерии и биотехнологии, г.Улан-Батор, Монголия
**Текстильный институт при Институте производственных технологий и дизайна, МГУНТ,
г.Улан-Батор, Монголия, E-mail: [email protected])
В настоящее время для защиты текстильных и ковровых материалов от биоразрушения под
действием различных видов микроорганизмов применяются разные способы защиты. Одним из таких
способов является использование при крашении волокон экстрактов растений, обладающих
бактерицидным действием.
В нашей стране такой способ обработки является новинкой, поэтому на пути его внедрения в
практику у нас возникают различные трудности. Прежде всего это связано с изучением химического
состава веществ, которые содержатся в наземных частях растений и оказывают биоцидное действие.
Поэтому для своей исследовательской работы мы выбрали пять наиболее распространенных растений,
которые могут содержать вещества, задерживающие рост микроорганизмов.
Цель работы – изучение антимикробного действия экстрактов растений и выявление химических
веществ, содержащихся в них.
В качестве объектов исследования мы выбрали ревень (Rheum undalatum L.), тимьян (Thymus
dahurica L.), подорожник (Plantago major L.), чистотел (Chelidonium majus L.), крапиву (Urtica dioica
L.), которые произрастают повсеместно на территории нашей страны.
Для работы мы приготовили 30%, 60%, 96%-ные спиртовые экстракты данных растений. Из этих
экстрактов 0.1 мл, 0.5мл, 1мл суспензий вносили в расплавленный и охлажденный до 45оС
питательный агар /мясо-пептонный агар/, который затем разливали в стерильные чашки Петри. После
остывания на поверхности питательной среды делали посев трёх различных видов микроорганизмов –
кишечной палочки E.coli, споровой бациллы Bacillus, плесневого гриба Penicillum. Данные
микроорганизмы культивировали при температурах 37оС /E.coli/ и 27оС /Bacillus, Penicillum/. После
культивирования проводили подсчёт колоний данных микроорганизмов. При этом обнаружено, что с
повышением концентрации экстракта в питательной среде число колоний микроорганизмов
уменьшается. При объеме 1 мл 96% спиртового раствора растений рост кишечной палочки совсем
прекращается, а количество колоний других двух микроорганизмов уменьшается в 5 раз /график 1, 2/.
200
150
150
100
0,
1
ml
100
0,1
ml
50
50
0
0
Thymus
Thymus
RheumChelidonium
rheum
chelidonium
График 1. Изменение числа колоний E.coli /60% экстракт растений График 2. Изменение числа колоний плесневого гриба
/60% экстракт растений/
Как видно из графиков, при увеличении объема суспензии экстрактов растений в питательной
среде число колоний в чашке Петри резко уменьшается. При объеме 1 мл суспензии культура
кишечной палочки не дает роста, а число колоний гриба в питательной среде с тимьяном уменьшается
с 188 до 8.
Для выявления различных химических соединений в данных растворах мы проводили
тонкослойную хроматографию. Для этого сначало мы фракционировали эти растворы в разных
органических растворителях: хлороформе, этилацетате, и брызгали раствором Драгендорфа. При этом
57
нами в экстракте чистотела обнаружен полярный алкалоид. С помощью спектрофотометра мы
проводили измерение в УФ поле при 254 нм, 365 нм длине волны. При использовании раствора
Драгендорфа алкалоид дает желтое пятно. /рис. 1/
Рисунок 1. Тонкослойная хроматография / 1-254 нм, 2-365нм, 3-раствор Драгендорфа /
При изучении состава флаваноида в экстрактах растений нами обнаружен рутин.
UV254 (NP)
UV365 (NP)
Рисунок 2. Хроматограмма сравнения рутина в фракции этилацетата ревеня и чистотела с рутин
тригидратом
Для подверждения результатов тонкослойной хроматографии мы провели паралелльно
исследование на аппарате жидкостной хроматографии. При этом в экстракте ревеня так же обнаружен
рутин. Стандартом служил стандартный раствор рутина. Запись хроматограммы показана на рисунке 3.
Рисунок 3. Сравнительная хроматограмма экстракта ревеня и стандартного раствора рутина
ВЫВОДЫ:
При проведении данной работы нами сделаны следующие выводы:
1.Отобранные нами для исследования растения хорошо экстрагируются в спирте и воде. В 60%ном спиртовом растворе этих растений содержание сухих веществ самое оптимальное и составляет 1818.2%.
2.При добавлении этих растворов в питательную среду для культивирования микроорганизмов
самым оптимальным объемом считаем 1 мл экстракта. При этом объеме рост микроорганизмов
уменьшается почти в 5-8 раз. Для кишечной палочки этот объем является губительным.
58
3.При изучении химического состава данных растений мы фракционировали данные экстракты в
различных органических растворителях и проводили тонкослойную хроматографию. При этом в
экстракте чистотела нами обнаружен полярный алкалоид.
4.Для выявления флаваноида мы проводили сравнение результатов тонкослойной
хроматографии с результатами жидкостной хроматографии. При этом установлено, что в фракции
этилацетата ревеня и чистотела содержится флаваноид-гликозид рутин.
УДК: 582.26. 27
Б.К. Заядан, Д.К. Кирбаева, А.К. Садвакасова, К. Болатхан
СОДЕРЖАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ СМЕШАННЫХ КУЛЬТУР
МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
(КазНУ имени аль-Фараби, г. Алматы)
В работе представлены экспериментальные данные о совместном культивировании смешанных культур
микроводорослей на модифицированных средах. Результаты эксперимента показали, что при культивировании смешанных
культур микроводорослей
на модифицированных средах наблюдается увеличение скорости роста клеток и,
соответственно, с повышением биологически активных веществ по сравнению с контролем.
Создание мощной промышленности микробиологического синтеза способно обеспечить человека
и животных белками, аминокислотами и физиологически активными соединениями. В этом аспекте
наиболее перспективным и экономичным представляется массовое выращивание микроводорослей,
позволяющее осуществлять микробиологический синтез ценных органических соединений за счет
энергии света и углекислоты в больших масштабах, т.к. давно доказано, что автотрофный путь
биосинтеза является более эффективным в отношении получения биомассы, чем гетеротрофный.
Особый интерес заслуживают протококковые водоросли, в частности хлорелла и сцендесмус,
обладающие уникальными составами и не требующие особых условий для выращивания 1; 2.
В настоящий момент одним из самых перспективных направлений в области исследования
микроводорослей является создание препаратов растительного происхождения, удачно сочетающих
высокую активность и мягкое действие на организм человека с минимальными побочными эффектами.
Удобрительные и питательные свойства фототрофных микроводорослей хлореллы, сценедесмуса
обусловлены высоким содержанием в них белков жиров витаминов и микроэлементов. Урожайность
биомассы микроводорослей чрезвычайно велика 3; 4.
В связи с этим целью исследований являлась разработка технологии массового
культивирования производственно-ценных штаммов смешанных культур микроводорослей (Chlorella
vulgaris Z-1 и Scenedesmus obliquus var. оbliquus) на стандартной и модифицированных средах для
получения биологически активных веществ.
Материалы и методы
Объектом исследования являлись микроводоросли Chlorella vulgaris Z-1 и Scenedesmus obliquus
var. оbliquus из коллекции из коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры микробиологии
КазНУ им. аль-Фараби.
Штаммы микроводорослей культивировали на жидких питательных средах 04 в лабораторном
фотобиореакторе в контролируемых условиях при освещении лампами интенсивностью 4000-5000
люкс, температуре 23-250С.
С целью перемешивания культуру барботировали воздухом, освобожденным от СО2
последовательным пропусканием через раствор щелочи. Контроль над темпом роста и размножением
микроводорослей в культуре осуществляли на основании учета изменений их численности и биомассы
с помощью камеры Горяева [5].
Содержание общего белка в биомассе опеделяли методом Лоури, пигментов – по спектрам
поглощения ацетоновых экстрактов, регистрируемых с помощью спектрофотометра Specord UV-VIS
[6, 7].
Результаты и обсуждение
В ходе эксперимента нами изучена динамика роста клеток и накопления биомассы при
культивировании смешанных культуры Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus на
разных оптимизированных средах в течение 10 суток. Для эксперимента питательная среда 04 была
модифицирована внесением концентраций экстракта куриного помета (10%) и бикарбоната натрия 0,2 г.
59
Смешанные культуры микроводорослей культивировали следующих средах:
Варианты опыта:
№1 вариант стандартная среда 04 (контроль);
№2 вариант среда 04 с экстрактом куриного помета (5%+ 0,2г NaHCO3);
№3 вариант среда 04 с экстрактом куриного помета (10%+0,2г NaHCO3);
Исходное число клеток смешанных штаммов Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var.
оbligus составило 0,1х106 кл/мл (Рисунок 1).
Число клеток млн/мл
60
50
40
30
20
10
0
0
2
контроль
4
6
вариант №1
8
10
12
суток
вариант №2
Рисунок 1 - Динамики роста клеток смешанных культуры микроводорослей на оптимизированных
средах
Как видно из рисунка 1, на 10 суток выращивания микроводорослей в лабораторной установке
число роста клеток в контроле достигло 47,4х106 кл/мл, тогда как в вариантах №1 и №2 эти показатели
составляет 50,9х106 и 58,6х106 кл/мл.
В эти же сроки нами определялось накопление биомассы клеток смешанных культур.
Установлено, что вес сухой биомассы смешанных штаммов в контроле достиг величины – 3,2 г/л,
тогда как в варианте №1 накопление биомассы составило 3,5 г/л, а в варианте №2 этот показатель
составил 4,1 г/л.
Таким образом, установлено, что при совместном культивировании клеток микроводорослей на
питательной среде 04 с добавлением экстракта куриного помета (10%) и бикарбоната натрия с
концентрацией 0,2 мг/л наблюдается увеличение скорости роста клеток по сравнению с контролем.
Далее нами определялось содержание хлорофиллов «а» и «в» в биомассах смешанных культур
Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus за 10 сутки при культивировании в
биореакторе (Таблица 1).
Таблица 1 – Накопление хлорофиллов (а и в) в биомассе смешанных культур микроводорослей
при массовом культивировании
Варианты
мг/л
хлорофилл а
хлорофилл в
контроль
1,9±0,02
1,1±0,01
опыт
2,5±0,06
1,4±0,03
Анализируя состав пигментов можно увидеть, что по сравнению с контрольными вариантам в
опытном варианте, наблюдается самое высокое содержание пигментов: хлорофилла «а» - 1,9 мг/л,
хлорофилла «в» - 1,1 мг/л, в контроле эти цифры составляют хлорофилла «а» - 2,5 мг/л, хлорофилла
«в» - 1,4 мг/л соответственно.
Таким образом, при культивировании смешанных культур микроводорослей на питательной
среде с добавлением экстракта куриного помета в концентрации 10% и 0,2 г NaHCO3 наблюдается
увеличение скорости роста клеток и, соответственно, повышение количества хлорофиллов по
сравнению с контролем.
Известно, что количество пигментов в клетках находится в тесной взаимосвязи с условиями
роста организмов. Особенно его количество увеличивается при внесении азотных удобрений. Среди
большого числа биологически активных соединений практический интерес представляют
водорастворимые белки и пигменты (каротиноиды, β-каротина), имеющие огромное значение и
практический интерес как для фармации и медицины, так и пищевой промышленности и
косметологии. Далее нами изучалось содержание общего белка в биомассе при совместном
60
культивировании микроводорослей. Для получения конечного продукта культивировании смешанных
культур микроводорослей проводили на лабораторной установке. Показатели содержания общего
белка в смешанных культур клеток микроводорослей - Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus
var. оbligus при выращивании их в лабораторном биореакторе, в контролируемых условиях
сравнивались с таковыми в контроле на стандартной среде 04 (Рисунок 2)
Контроль
45,5%
опыт
52,0%
Рисунок 2 – Накопление белка в биомассе смешанных культур микроводорослей на
модифицированном средах
Исследование накопления общей биомассы микроводорослей в течение 14 суток при росте на
стандартной и на модифицированных средах выявило следующее: в 1-варианте (контроль) белок
составляет 45,5%, во 2-варианте – 52,0%
Данные о содержании общее каротиноидов и β-каротин в смешанных культур микроводорослей
получавших в течение 14 дня биомассе представлены в рисунке 3.
0,5
1,28
0,7
1
1,6
1,5
1,1
количество пигментов, мг/л
2
0
контроль
опыт
каротиноиды
b-каротин
Рисунок 3 – Накопление каротиноидов и β каротина в биомассе смешанных культур микроводорослей
Как видно из рис. 3, химический анализ биомассы показал, что при внесении в среду 10% экстракта
куриного помета и бикарбоната натрия в среде 0,2 мг/л наблюдается значительные изменения.
Так, содержание каротиноидов и β-каротина увеличилось в 2 раза и составило: 1,6 мг/г –
каротиноидов, 1,28 мг/г - β-каротина, по сравнению с контролем (каротиноидов -0,9 мг/г и β-каротина
- 0,7 мг/г).
Таким образом, в проведенные нами исследования показали, что при совместном
культивировании смешанных культур микроводорослей на модифицированных средах может
накапливать в своих клетках огромное количество пигментов (каротиноидов и β-каротин) и является
самым богатым из известных в настоящее время природных источников провитамина А.
1. Soeder С. J. Massіve cultіvatіon of mіcroalgae: results and prospects // Hydro- bіologіa. - 1980. - Vоl. 72. - P.197-209.
2. Селяметов Р.А., Якубов Х.Ф. К изучению витаминного состава хлореллы и сценедесмуса. - В кн.: Культивирование
водорослей и высших водных растений в Узбекистане. Ташкент: Фан, 1971, с. 59-60.
2. Жубанова А.А., Заядан Б.К. Перспективы использования микроводорослей в биотехнологии, // Биотехнология.
Теория и практика, 2002, N4, стр. 63-70.
4. Мельников С.С. Хлорелла: Физиологически активные вещества и их использование / С.С. Мельников, Е.Е.
Мананкина - Минск: Наука тэхніка, 1991. 79 с.
5. Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования
водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наукова думка, 1975. - 247с.
6. Вecker Е. W. Bіotechnology and explotatіon of the green alga Scenedesmus obluguus // Іndіan Bіomass. – 1984. - Vоl. 4. Р.1-19.
7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под редакцией Скурихина И.М.,
Тутельяна В.А. - Москва, 1998. -342 с.
***
Жұмыста модификацияланған ортада өсірген микробалдырлардың аралас дақылдарының тəжірибелік көрсеткіштері
берілген. Тəжірибелік нəтижелер бойынша модификацияланған ортада өскен микробалдырлардың аралас дақылдарының
клеткаларының өсу жылдамдығы мен биологиялық белсенді заттары бақылауға қарағанда жоғарылағаны анықталды.
61
***
The experimental data combined cultivation of are mixed cultures of microalgae on the modified environments. Presented the
results of experiment show that during the cultivation of the mixed cultures of microalgae on the modified environments were observed
speed enhancing of cell growth and accordingly with the increase of bioactive substances as compared with control.
А.А. Зорина, Н.С. Степанченко, Г.В. Новикова, Д.А. Лось
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА И ФОСФОПРОТЕОМИКА СТРЕССОВЫХ ОТВЕТОВ У
ЦИАНОБАКТЕРИЙ
(Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, e-mail:
[email protected])
В работе рассматриваются проблемы идентификации систем восприятия и передачи сигналов стрессовых
ответов у цианобактерий с применением методов ДНК-микрочипов и фосфопротеомики.
Современные методы исследования экспрессии генов, помимо традиционных РНК-ДНК
гибридизации, обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией и др.,
предполагают использование ДНК-микрочипов для изучения транскрипции генов и массспектрометрический анализ белков для изучения и идентификации продуктов трансляции
соответствующих генов. Применение ДНК-микрочипов и масс-спектрометрии в сочетании с методами
направленного мутагенеза позволяют с высочайшей точностью определять влияние той или иной
мутации на транскрипцию генов или на посттрансляционные модификации белков. Это особенно
важно при изучении систем восприятия и передачи стрессовых сигналов или сигналов об изменении
параметров окружающей среды, которые состоят, как правило, из протеинкиназ и протеинфосфатаз,
осуществляющих фосфорилирование и дефосфорилирование белков, и таким образом регулирующих
их активность.
Двухкомпонентные системы регуляции состоят из сенсорной гистидинкиназы (Hik) и регулятора
ответа (Rre) и формируют центральное ядро фосфатной сигнальной системы у цианобактерий [1].
Сенсорная гистидинкиназа воспринимает изменения в окружающей среде через сенсорный домен.
Изменения его конформации приводят к автофосфорилированию Hik по консервативному остатку
гистидина с использованием донорной АТФ. Фосфат затем переносится на консервативный аспартат
получающего домена белка – регулятора ответа Rre. После фосфорилирования, Rre также меняет свою
конформацию, в результате чего приобретает способность связываться с ДНК. Связывается он обычно
с промоторами генов, локализованных далее по курсу всей цепочки пути адаптации, связанного с
генной экспрессией.
У цианобактерии Synechocystis имеется 47 генов, кодирующих гистидинкиназы, и 45 генов
регуляторов ответа. Соответствующие этим генам белки являются кандидатами на роль сенсоров и
передатчиков сигналов об изменении окружающей среды [2]. Как правило, инактивация генов,
кодирующих белки-сенсоры и/или передатчики, приводит к невозможности запуска ряда генов
стрессовых ответов, поэтому применение ДНК-микрочипов в данном случае способно дать
однозначный ответ на вопрос о том, какие гены контролируются той или иной сенсорной
гистидинкиназой. С использованием ДНК-микрочипов были идентифицированы сенсоры низкой
(Hik33) и высокой (Hik34) температуры, солевого и гиперосмотического стресса (Hik2, Hik10, Hik16,
Hik41), двухкомпонентная система, регулирующая транспорт ионов марганца при их недостатке
(Hik27-Rre16) и некоторые другие [3-6].
В отличие от сенсорных гистидинкиназ, серин-треониновые протеинкиназы эукариотического
типа у прокариот участвуют в регуляции основных физиологических процессов (подвижность клеток,
метаболизм при повышенных температурах и т.п. [2, 7]. Мутации по генам серин-треониновых
протеинкиназ редко приводят к видимым нарушениям в транскрипции генов и чаще выражаются в
неспособности фосфорилирования отдельных белков. Такие изменения невозможно определить на
уровне транскрипции даже с помощью микрочипов, и для их определения более подходят методы
фосфопротеомики – определение профилей фосфорилирования по серину и треонину с помощью
двумерного электрофореза с последующей идентификацией белков методами масс-спектрометрии.
Примером такого определения может служить фосфопротеомный анализ субстратов серинтреониновых протеинкиназ у Synechocystis при тепловом стрессе. В геноме Synechocystis имеется 12
генов, кодирующих серин-треониновые протеинкиназы. Мутантные штаммы, полученные по каждому
из этих генов, исследовались на предмет их способности фосфорилировать белки по остаткам серина и
треонина в нормальных условиях роста и при тепловом стрессе. Методом MALDI-TOF были
62
идентифицированы метионил-тРНК-синтетаза, большая субъединица RuBisCo, 6-фосфоглюконат
дегидрогеназа, фактор элонгации трансляции Tu (TufA), тРНК δ2-изопентенил-пирофосфаттрансфераза, белок теплового шока GrpE и малый ко-шаперонин GroES, являющийся компонентом
системы, участвующей в рефолдинге белков после их денатурации в условиях теплового или солевого
стресса. Все перечисленные белки являются субстратами для серин-треониновых протеинкиназ. Белок
GroES был экспрессирован в клетках Escherichia coli, очищен и использовался в экспериментах по
фосфорилированию in vitro с использованием белковых экстрактов, полученных из клеток
Synechocystis дикого типа и 12 мутантов, дефектных по генам серин-треониновых протеинкиназ. Эти
эксперименты показали, что белковые экстракты, в которых отсутствует одна из трех протеинкиназ –
SpkC, SpkF или SpkK, не способны фосфорилировать GroES. В то же время, реверсии
соответствующих мутаций приводили к восстановлению фосфорилирования этого белка. Таким
образом, было показано, что три протеинкиназы, SpkC/F/K, участвуют в фосфорилировании малого
шаперонина GroES. При этом работают они, видимо, последовательно друг за другом, формируя
каскад из трех этапов фосфорилирования, последним из которых является фосфорилирование GroES
[8].
В клетках дикого типа гистидинкиназа Hik34 и фактор транскрипции HrcA репрессируют
экспрессию оперона groESL при оптимальной температуре роста. Тем не менее, экспериментально
подтверждено присутствие и GroES, и GroEL в экстрактах белков из клеток, выращенных при
нормальной температуре. Это указывает на то, что Hik34 и/или HrcA репрессируют транскрипцию не
полностью. Мы предполагаем, что фосфорилирование по остаткам серина и треонина, по крайней
мере, в случае GroES и GroEL, осуществляется конститутивно и зависит только от количества
доступного субстрата. Тепловой стресс вызывает индукцию экспрессии оперона groESL, накопление в
клетке GroEL и GroES и обеспечивает достаточные количества субстрата для серин-треониновых
протеинкиназ, которые фосфорилируют эти шаперонины, что, согласно принятой в настоящее время
схеме, облегчает их олигомеризацию. Мутации в генах hik34 и hrcA выражаются в конститутивной
экспрессии groESL оперона. Указанные белки накапливаются в значительных количествах и
подвергаются модификации серин-треониновыми протеинкиназами. Полученные нами данные о
существовании фосфорилированной формы GroES дают основания предполагать, что серинтреониновое фосфорилирование этого ко-шаперонина может быть чрезвычайно важным для
формирования функционального олигомерного GroESL комплекса.
Таким образом, систематический анализ библиотек мутантов цианобактерий с помощью ДНКмикрочипов и с помощью методов фосфопротеомики позволяет идентифицировать гены, кодирующие
различные сенсорные системы клеток [9], а также другие системы фосфорилирования, участвующие в
регуляции клеточных процессов.
1.Зорина А.А., Миронов К.С., Степанченко Н.С., Синетова М.А., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Куприянова Е.В.,
Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий // Физиология растений. – 2011. Т.
58. № 5. С. 643-663.
2.Лось Д.А. Сенсорные системы цианобактерий. – Москва: Научный Мир. – 2010. 219 с.
3.Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. The pathway of perception and transduction of low-temperature
signals in Synechocystis // EMBO J. – 2000. V. 19. P. 1327-1334.
4.Yamaguchi K., Suzuki I., Yamamoto H., Lyukevich A., Bodrova I., Los D.A., Piven I., Zinchenko V., Kanehisa M., Murata
N. A two-component Mn2+-sensing system negatively regulates expression of the mntCAB operon in Synechocystis // Plant Cell – 2002.
V.14. P. 2901-2913.
5. Suzuki I., Kanesaki Y., Hayashi H., Hall J.J., Simon W.J., Slabas A.R., Murata N. The histidine kinase Hik34 is involved in
thermotolerance by regulating the expression of heat shock genes in Synechocystis // Plant Physiol. – 2005. V. 138. P. 1409-1421.
6.Shumskaya M.A., Paithoonrangsarid K., Kanesaki Y., Los D.A., Zinchenko V.V., Tanticharoen M., Suzuki I., Murata N.
Identical Hik-Rre systems are involved in perception and transduction of salt signals and hyperosmotic signals but regulate the
expression of individual genes to different extents in Synechocystis // J. Biol. Chem. – 2005. V. 280. P. 21531-21538.
7.Panichkin V.B., Arakawa-Kobayashi S., Kanaseki T., Suzuki I., Los D.A., Shestakov S.V., Murata N. Serine/threonine
protein kinase SpkA in Synechocystis sp. strain PCC 6803 is a regulator of expression of three putative pilA operons, formation of thick
pili, and cell motility // J. Bacteriol. – 2006. V. 188. P. 7696-7699.
63
8.Zorina A., Stepanchenko N., Novikova G.V., Sinetova M., Panichkin V.B., Moshkov I.E., Zinchenko V.V., Shestakov S.V.,
Suzuki I., Murata N., Los D.A. Eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases SpkC/F/K are involved in phosphorylation of GroES in the
cyanobacterium Synechocystis // DNA Research – 2011. V. 18. P. 137-151.
9. Los D.A., Zorina A., Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V. (2010) Stress sensors and signal transducers in
cyanobacteria. Sensors 10: 2386-2415.
Л.В. Игнатова, Е.В. Бражникова, Т.Д. Мукашева, В.Л. Цзю, Р.Ж. Бержанова,
Р.К. Сыдыкбекова, С.Е. Шукешева
СКРИНИНГ АКТИВНЫХ НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ СРЕДИ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ
РОДА AUREOBASIDIUM
(Казахский нациоанальный университет имени аль-Фараби)
Одной из серьезных проблем восстановления природной среды при добыче, транспортировке и
переработке нефти является ликвидация нефтяного загрязнения и утилизации отходов нефтяной
промышленности. Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных
объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биохимического
потенциала микроорганизмов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося
дополнительного ущерба нарушенной экосистеме [1,2].
Микробиологическая активность является важным фактором при утилизации нефтяных
загрязнений. Однако высокомолекулярные парафины, ароматические и полициклические соединения,
содержащиеся в сырой нефти, прочно связываются с почвенными частицами, образуя гидрофобные
пленки, и становятся практически недоступными для ферментных систем микроорганизмов. Одним из
важнейших механизмов окисления гидрофобных углеводородов нефти является продуцирование
микроорганизмами-нефтедеструкторами биосурфактантов, которые способствуют десорбции и
солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым, облегчая их ассимиляцию микробными
клетками [3].
Поскольку углеводородокисляющие микроорганизмы растут на границе раздела фаз
«углеводород/вода», синтез эмульгаторов при высокой клеточной плотности увеличивает площадь
поверхности углеводородных капель, создавая оптимальные условия питания для большего числа
бактерий. В то же время, при использовании такого сложного субстрата, как нефть, по окончании
процесса ферментативного окисления ее легкодеградируемых фракций наличие эмульгатора позволяет
микроорганизмам, отсоединяться от «использованной» нефтяной капли и переходить к «свежему»
субстрату [4].
Поверхностно-активные вещества, продуцируемые дрожжеподобными грибами Aureobasidium
pullulans, могут являться мощным регулятором активности микробной популяции [5,6]. Одним из
важных критериев оценки поверхностно-активных веществ при их практическом использовании
является способность к эмульгированию углеводородов.
Цель исследований – оценка эмульгирующей и нефтедеструктирующей активности штаммов
дрожжеподобных грибов Aureobasidium pullulans.
Материалы и методы
В качестве объектов были выбраны 30 штаммов Aureobasidium pullulans, способных к продукции
различных биологически активных соединений: экзополисахаридов и меланинов. Эмульгирующую
активность определяли спектрофотометрически при выращивании на минеральной среде Чапека-Докса
в течение 7 суток. Динамику численности изучали при росте в полупогруженных условиях на
минеральной среде 8Е.
При изучении деструкции нефти оценивали суммарный показатель ее убыли как в жидкой среде,
так и в стерильном песке, определяемый весовым методом (гравиметрия). Культуры выращивали на
минеральной среде 8Е, содержащей 1%, 2% и 3% сырой нефти от общего объема. Первоначальное
содержание нефти в песке составило 12 500 мг/кг, что соответствует умеренно-сильному уровню
загрязнения, поскольку превышает ориентировочно допустимое количество (ОДК) нефти в почве в 11
раз. Продолжительность опыта - 14 суток. Определение фитотоксичности проводили по стандартной
методике с использованием семян редиса.
Результаты и обсуждение
Эмульгирование углеводородов с помощью поверхностно-активных веществ улучшает
поступление гидрофобных органических загрязнителей из почвы и воды в микробные клетки и
соответственно их деградацию.
64
Показано, что в процессе роста микроорганизмов возрастает оптическая плотность фильтрата.
Степень эмульгирования у всех вариантов разная, но динамика эмульгирования одинаковая: с началом
роста идет увеличение эмульгирования и максимального значения оно достигает к 120 часам
культивирования (0,8-1,9) (рис. 1, а). В результате было отобрано 5 штаммов-нефтедеструкторов А2,
А3, А4, Н2 и П7 с максимальным значением эмульгирующей активности на 5-е сутки опыта (от 1,74 до
1,86 оп. ед.), из которых наибольшей эмульгирующей способностью обладает культура П7 (1,86).
На следующем этапе проведено изучение динамики численности наиболее активных штаммов
А2, А3, А4, Н2 и П7. В результате было показано, что в течение первых суток происходит активное
размножение клеток у всех культур (рис.1, б), что сопровождается резким повышением
эмульгирующей активности, особенно у штаммов П7, А1 и А3. Вероятно, это связано с началом
экскреции экзометаболитов, в частности биоэмульгаторов. Максимум значений эмульгирующей
активности, а также численности культур приходится на 5-е сутки, что связано с высоким уровнем
продукции внеклеточных полисахаридов.
А Ось абсцисс – время (часы); ось ординат – оптическая плотность (D); Ось абсцисс – время (часы);
ось ординат – общее микробное число (КОЕ/г)
Рисунок 1. Динамика эмульгирующей активности (А) и численности микроорганизмов (Б) на
минеральной среде 8Е
Исследованные штаммы различались по степени деструкции нефти. Как видно из результатов
таблицы 1, 2% концентрация нефти в среде является оптимальной для роста всех штаммов, о чем
свидетельствуют высокие показатели деструктивной активности. Низкие показатели на среде с 1% нефти,
скорее всего, связаны с недостатком субстрата как для ростовых процессов, так и для синтеза поверхностноактивных соединений. Увеличение концентрации нефти до 3%, чревато увеличением концентрации
токсичных компонентов нефти, обладающих биоцидным и мутагенным воздействием.
Наиболее активными оказались культуры А4, Н2 и П7, способные к утилизации нефти более чем
на 40% (таблица 1).
Таблица 1. Деструкция нефти дрожжеподобными грибами в жидкой среде
№
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Варианты
Исходное содержание
опыта
нефти в среде, мг/л
2
3
Контроль (1% 8 760,23 ± 350,41
нефти)
А2 1%
8 760,23 ± 350,41
А4 1%
8 760,23 ± 350,41
Н2 1%
8 760,23 ± 350,41
П7 1%
8 760,23 ± 350,41
А3 1%
8 760,23 ± 350,41
Контроль (2% 14 568,61 ± 582,74
нефти)
А2 2%
14 568,61 ± 582,74
А4 2%
14 568,61 ± 582,74
Н2 2%
14 568,61 ± 582,74
П7 2%
14 568,61 ± 582,74
А3 2%
14 568,61 ± 582,74
Контроль (3% 20 621,14 ± 824,84
нефти)
А2 3%
20 621,14 ± 824,84
65
Содержание остаточной
нефти, мг/л
4
8 667,72 ± 346,71
Разница
контролем, %
5
0,0 ± 0,00
4 859,02 ± 194,36
4 457,21 ± 178,29
4 960,33 ± 198,41
7 445,82 ± 297,83
5 069,71 ± 202,79
14 448,93 ± 577,96
43,94 ± 1,76
48,61 ± 1,94
42,82 ± 1,71
14,11 ± 0,56
41,53 ± 1,66
0,0 ± 0,00
3 287,32 ± 131,49
3 159,61 ± 126,38
2 632,43 ± 105,30
1 867,72 ± 74,71
3 737,21 ± 149,49
19 931,54 ± 797,26
77,25 ± 3,09
78,11 ± 3,13
81,82 ± 3,27
87,07 ± 3,48
74,12 ± 2,97
0,0 ± 0,00
14 502,31 ± 580,09
27,24 ± 1,09
с
15
А4 3%
20 621,14 ± 824,84
11 454,02 ± 458,16
42,54 ± 1,70
16
Н2 3%
20 621,14 ± 824,84
13 773,23 ± 550,93
30,93 ± 1,24
17
П7 3%
20 621,14 ± 824,84
8 872,04 ± 354,88
55,52 ± 2,22
18
А3 3%
20 621,14 ± 824,84
12 606,52 ± 504,26
36,83 ± 1,47
При изучении процесса биодеструкции нефти наиболее активными культурами Aureobasidium
pullulans в модельных экспериментах в задачу исследований входила очистка нефтезагрязненного
стерильного песка с использованием дрожжеподобных грибов в комплексе с древесными опилками.
Как видно из результатов таблицы 2, на 14-е сутки при интродуцировании клеток штаммов A. pullulans
П7 и А4 остаточное количество нефти в почве было самым низким и составило 1,73 г/кг у штамма А4 и
1,03 г/кг у штамма П7. Таким образом, было установлено, что исследуемые штаммы по способности
разлагать сырую нефть располагаются в следующей последовательности:
П7 (1,03 г/л) > А4 (1,73 г/л) >Н2 (2,35 г/л) > А2 (2,74 г/л) > А3 (4,12 г/л)
Параллельно было проведено определение фитотоксичности почв с использованием семян
редиса. Данный тест широко используется в различных экспериментах, благодаря тому, что является
весьма удобным и показательным. Фитотоксичность обработанного песка была различна и зависела от
интродуцируемых культур. Максимальная токсичность отмечена в контрольном варианте, о чем
свидетельствует процент проросших семян редиса (8,4%), минимальная – после внесения культур Н2
(82,2%) и П7 (85,8%); в остальных вариантах этот показатель варьировал от 38,2% до 78,4%.
Таблица 2. Деструкция нефти дрожжеподобными грибами в модельных экспериментах
№ Вариант
Содержание остаточной нефти, г/кг
На 7-е сутки
На 14-е сутки
1
Контроль
7,68 ± 0,30
7,24 ± 0,29
Кол-во
Разница
с
проросших
контролем, %
семян, %
0,0
8,43
2
А2
3,33 ± 0,13
2,74 ± 0,11
56,64 ± 2,26
38,21
3
А3
4,78 ± 0,19
4,12 ± 0,16
73,03 ± 2,92
66,32
4
А4
2,54 ± 0,12
1,73 ± 0,06
91,12 ± 3,64
78,43
5
Н2
3,21 ± 0,12
2,35 ± 0,09
96,31 ± 3,85
82,22
6
П7
1,32 ± 0,05
1,03 ± 0,04
86,58 ± 3,46
85,81
Заключение
В результате исследований были отобраны 5 штаммов-нефтедеструкторов с максимальным
значением эмульгирующей активности (А2, А3, А4, Н2 и П7), из которых наибольшей эмульгирующей
способностью обладала культура П7. Установлена зависимость между численностью исследуемых
штаммов и их эмульгирующей активностью. Показано, что максимальных значений эти величины
достигают на 5-е сутки культивирования. Было установлено, что исследуемые штаммы по способности
разлагать сырую нефть располагаются в следующей последовательности: П7 > А4 >Н2 > А2 > А3
1. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. - Уфа: БашГУ, 1994.-172 с.
2. Молотков И.В., Касьяненко В.А. Рекультивация нефтезагрязненных почв // НефтьГазПромышленность. - 2005. С.307-311.
3. Herbes S.E., Sсhwa1l L. R. Microbial transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristine and petroleum
contaminated sediments. - Appl. Envir. Microbiol. – 1978. - V. 3. - С. 306.
4. Коронелли Т. В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов //Усп. Микробиологии. - 1980. - Вып. 15. С. 99
5. Crescenzi V. Microbial Polysaccharides of Applied Interest: Ongoing Research Activities in Europe // Biotechnol. Prog. 1995. - №3. - P.251-259.
6. Reeslev М., Jorgensen В. Exopolysaccharide production and morphology of Aureobasidium pullulans grown in continuons
cultivation with warying cemmonium glucose ratio in the growth medium // J. Biotechnol.- 1996.- №2.-C.131-135.
***
Microbiological activity is an important factor at utilization of oil pollution. The surface-active substances produced by
Aureobasidium pullulans, can be a powerful regulator of activity of microbic population. As a result of researches emulsifying and oil
destruction activity of strains Aureobasidium pullulans was estimated
66
А.К. Калиева1., Р.К. Блиева2
PENICILLIUM CYCLOPIUM 2-11 ШТАМЫНАН АЛЫНҒАН ПЕКТИНЛИАЗА
ФЕРМЕНТТЕРІНІҢ ФИЗИКА-ХИМИЯЛЫҚ ҚАСИЕТТЕРІН ЗЕРТТЕУ ЖƏНЕ
СИНТЕТИКАЛЫҚ ЖУҒЫШ ЗАТТАРДА ІС ЖҮЗІНДЕ ҚОЛДАНУ
(Қ.Жұбанов атындағы Ақтөбе мемлекеттік университеті, Ақтөбе қ1 , ҚР БҒМ «БЗО» РМК
«Микробиология жəне вирусология институты» ЕМК, Алматы қ2)
Бұл жұмыста ПЛ ферменттерінің препараттары алынды, зерттелген ферменттерді СЖЗ құрамында қолдануға
мүмкіндік беретін олардың физикалық-химиялық қасиеттері зерттелді.
Пектолитикалық ферменттер сусын жəне шарап өндірістерінде жеміс-жидектерді, көкөніс
шырындарын ағартуда жəне шарап дайындауда кеңінен қолданылады. Бұл қазір осы ферменттердің
кең таралуын қамтамасыз ететін ескі үдерістердің бірі болып табылады. Пектин ыдыратушы
ферменттерді қолдану кезінде жеміс жəне көкөніс шырындары тұтқырлығының тез түсуі, лайлығының
төмендеуі жəне өсімдік материалдарының құрғақ заттарына қайта есептегенде олардың шығымының
артуы жүреді.
Қазақстандық оқымыстылар жеміс-жидек шырындарының шығымын арттыру үшін олардың
шығуын 7-12%-ға арттырып, сонымен бірге жүзім шараптарының тез пісіп жетілуі үшін A.niger-ді
өсіру кезінде алынған пектин ыдыратушы ферменттерді жемісті қолданды [1].
Л.И. Сапунова жəне басқалар [2] көкөніс жəне жеміс-жидек шикізатын қайта өңдеудің жаңа
технологиясын қалыптастыруда жəне бұрыннан белгілі технологияларды жетілдіруде P.adametzii,
P.citrinum жəне P.janthinellum препараттарын ұсынады. Сонымен қатар, пектолитикалық ферменттерді
зығыр талшығын алу үдерісін жетілдіру үшін зығырды ылғалдандыруда қолданды [3].
Өнеркəсіпте қолданылатын, мысалы пектолитикалық ферменттердің препараттарымен
норвегиялық жəне ситхиндиялық шыршаларды немесе осы ферменттерді түзетін ерекше
бактериялармен жұмсақ ағаш тұқымдарын өңдеу пектолитикалық ферменттердің потенциалды
мүмкіндіктерінің бірі болып табылады. Биологиялық өңдеудің тиімділігі ең күшті микробиологиялық
əсер етуді күшейтетін, ажырататын жəне өңдейтін шел қабықты алумен шектеледі [4].
Пектолитикалық ферменттерді мал шаруашылығында əртүрлі ауылшаруашылығы малдарының
қоректену рационына енгізу арқылы азықтың сіңімділігін арттырып, соның есебінен өнімділікті
көтеруге қолданылғаны жөнінде мəліметтер бар. Сондай-ақ ірі қара малдардың төлдері мен құстарды
жемдеу кезінде пектолитикалық ферменттерді қолдануда оң нəтижелер алынды [5,6].
Медицинада əртүрлі өсімдіктерден құнды дəрі қоспаларын алудың мəні зор. Dioscorsa caucasica
Lipsky тамыр сабағынан диосгенинді бөліп алу үдерісінде Г10X пектоклостридинді қолдану оның
шығымын 16%-ға арттыратыны белгілі болды [7].
Біз матадағы көміртекті дақтарға – жуғыш заттардың əсер ету тиімділігін көтеру үшін пектин
ыдыратушы ферменттерді белсенді қоспалар ретінде қосып, қолданудың жаңа жолын ұсынып
отырмыз. Олардың қолданылуы ПЛ ферменттерінің субстраттық өзгешеліктерінің əсеріне, рН-тың
сілтілі мəнінде құрамы жағынан күрделі пектинді көмірсуларды сумен тез кететін жай байланыстарға
ыдырату мүмкіншілігіне негізделген.
P.cyclopium 2-11 штамындағы пектинлиаза ферменттерін заттарды жуу үшін қолдану жəне
оларды тиімді пайдалану туралы ой-пікір біздің алдымызға пектинлиазалы əсері бар құрғақ ферментті
препараттарын алу мақсатын қойды.
Зертханалық жəне өндіріс жағдайында ферменттерді бөліп алу үшін көбінесе органикалық
ерітінділер мен бейтарап тұздарды қолданады. Тұндырма ретінде əдетте 96,5%-дық этанол, 98%-дық
изопропанол, химиялық таза ацетон жəне аммоний сульфатын пайдаланады; соңғысын пайдалану
кезінде бөлінген ақуызды диализ жолымен тұздардан еркінату үшін қосымша операциясын жүргізу
қажет. Ақуыздарды органикалық ерітінділермен тұндыру эффекті қарама-қарсы фермент топтарының
тұздануын азайту құбылысына негізделген. Ақуыз бетінің гидрофобты бөліктерінде орналасқан су
молекулалары органикалық ерітінді молекуласына ауыстырылуы мүмкін. Бұнда ақуыздардың
ерігіштігі төмендейді, ақуыз молекулаларының тұнуы мен агрегаттануы жүреді.
Иммобилизацияланған P.cyclopium 2-11 культурасының культуралдық сұйықтығынан
пектинлиаза ферменттерінің препараттарын бөліп алу үшін дəстүрлі тұндырма – этил спиртін
қолдандық. Культуралдық сұйықтықтың 1 литрінен 2 г ферментті препарат алынды.
рН 10 болғанда 1 литр культуралдық сұйықтықтан этил спиртімен тұндыру арқылы алынған 2 г
ферментті препарат құрамында көп таралған ферменттердің бар-жоқтығына биохимиялық талдау
жүргізіліп, Рухлядова А.П [8] əдістемесі бойынша анықталды. Биохимиялық талдау P.cyclopium 2-1167
ден алынған ферментті препарат бір текті емес екендігін көрсетті. Құрамына қатысатын ақуыздар
ретінде полигалактуроназа жəне протеиназа болды (кесте 1).
Кесте 1 – P.cyclopium
2-11-ден этил спиртімен тұндырып алынған ферментті препараттың
сипаттамасы
№
Препараттың ферментті құрамы
Көрсеткіштердің мəні, б/г
1 Пектинлиаза ферменті, ПЛ
143,3
2 Полигалактуроназа
3,3
3
Протеиназа
3,0
Ферментті препараттарды іс жүзінде қолдану мүмкіншіліктерін анықтайтын маңызды
сипаттамаларға қолайлы рН, температура жəне субстрат өзгешеліктері жатады. Су иондары
концентрациясының өзгеруі оны рН-тың сілтілі мəнінде арттырып, қышқыл жəне бейтарап ортаның рН
мəнінде төмендете отырып, пектинлиаза ферменттерінің белсенділігіне əсер ететіндігі белгілі болды
(сурет 1). P.cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің рН қолайлы əсері 10-11 аралығында
болатындығы дəлелденді.
40
35
30
г/ 25
20
б
, 15
Б
Л 10
П 5
0
Сурет 1 – P.cyclopium 2-11штамынан алынған зерттелетін
ферментті препараттың рН қолайлы əсерінің айқындалуы
3
4
5
6
7
рН
8
9
10
11
Сурет 1 – P.cyclopium 2-11 штамынан алынған зерттелетін ферментті препараттың рН қолайлы əсерінің
айқындалуы
Зерттелетін ферменттер рН-тың тек белгілі бір аралығында белсенді. Сондықтан да P.cyclopium
2-11 пектинлиазаның температураға тұрақтылық əсерін зерттеуді 1 сағат ішінде рН 10 болғанда
температураның əртүрлі көрсеткіштерінде жүргіздік. Температураның жоғары шегі 50-60ºС кезінде
ферментативтік белсенділіктің температураға тəуелділігін көрсететін энзиматикалық реакциялар
«қоңырау тəріздес» болуымен сипатталатыны белгілі болды (сурет 2). Температураны 70ºС-қа дейін
көтеру белсенділіктің күрт төмендеуіне əкеліп соқты. Пектинлиаза ферменттерін зерттеуде олардың
субстратты өзгешеліктерінің əсерін анықтаудың мəні зор. Ғылыми еңбектерде Penicillium туысына
жататын – пектинлиаза саңырауқұлақтарының өзгешелік əсеріне қатысты мəліметтер жоқ. Осыған
орай, пектинлиазаның əртүрлі пектинді заттардың гликозидті байланыстарын ыдыратуға қабілеттілігі
зерттелді. Өздерінің субстраттарына қарағанда пектинлиаза ферменттерінің өзгешелігі жоғары жəне
қанықпаған олигоуронидтерді қалыптастыра отырып, α-1-4 байланысын үзіп, жанама өнімдердің
қалыптасуынсыз белгілі химиялық реакцияларды жылдамдатады.
40
35
ПЛБ, б/г
30
25
20
15
10
5
0
30
40
50
60
70
t, C
Сурет 2 – P.cyclopium 2-11 штамынан алынған зерттелетін ферментті
препараттың термотұрақтылығы
68
Субстраттар ретінде əртүрлі этерлену деңгейіндегі рамногалактуронандарды жəне пектин
қышқылын қолдандық. Ферменттің бірдей концентрациясында полигалактуронатлиазамен аз
этерленген D-галактуронан (78%) белсенді ыдырады, одан кейін полиметилгалактуронатлиазамен
жоғары этерленген D-галактуронан (96%), бəрінен де пектин қышқылы аз гидролизге түсті.
Ферментті препараттарды іс жүзінде қолдану үшін СЖЗ жоғары сілтілі ортасының ұзақ уақыт
бойы əсер ету тұрақтылығын анықтадық. P.cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің белсенділігіне
СЖЗ жоғары сілтілі ортасының əсері (рН-12) жəне əсер етуінің ұзақтығының (1 сағат ішінде)
тұрақтылығы 20-60°С кезінде зерттелді (сурет 3). Тəжірибе нəтижелері СЖЗ сілтілі ортасының ұзақ
уақыт бойы əсер етуі P.cyclopium 2-11 штамындағы ПЛ ферменттерінің белсенділігіне 50-60ºС кезінде
де өзгеріс келтірмейтінін көрсетті.
25
20
г/
б
,
Б
Л
П
15
10
5
0
20
30
40
50
60
t, C
Сурет 3 – P.cyclopium 2-11 штамындағы ПЛ ферменттерінің тұрақтылығына температураның əртүрлі
көрсеткіштерінде жуғыш заттардың сілтілі ортасының ұзақ уақыт бойы əсер етуі
Сонымен, зерттелген ферменттердің рН, температураның қолайлы əсері жəне субстраттық
өзгешелігі анықталды. Препараттың қолайлы рН əсері 10-11 аралығында жəне температура 50-60ºС
кезінде тұрақты болатындығы дəлелденді. Препараттың субстраттық өзгешеліктері анықталды. Аз
этерленген жəне жоғары этерленген D-галактуронан қолайлы субстраттар болып табылды. СЖЗ-тың
жоғары сілтілі ортасы температура 50-60ºС кезінде де ПЛ ферменттерінің тұрақтылығына əсер етпейді.
ПЛ ферменттерін кір жуғыш заттарда қолдану туралы ой зерттелген ферменттердің қолайлы рН
əсері мен температурасын анықтағаннан кейін туды. P.cyclopium 2-11 штамындағы пектинлиаза
ферменттерінің көміртекті дақтарға тиімділік əсері жуғыш заттардың құрамында зертхана жəне өндіріс
жағдайында əл-Фараби атындағы ҚазҰУ-нің кір жуу орталығында сыналды.
СЖЗ құрамындағы зерттелетін ферменттердің жуу қабілетін зертханалық жағдайда сынау
кезінде көлемі 3,0-3,5 см болатын, мақтадан тоқылған қалың ақ матаға жидектің, жемістің, көкөністің
жəне шараптың дақтары жағылды. Дақтарды бір тəуліктен соң синтетикалық жуғыш ұнтақпен, 1-ші
нұсқасында – СЖЗ-пен (бақылау), 2-ші нұсқасында – фермент (10 мл) қосылған СЖЗ-пен, 3-ші
нұсқасында – кір сабынмен, 4-ші нұсқасында – фермент (10 мл) қосылған кір сабынмен жуылды.
Жүргізілген сынақтың нəтижесінде синтетикалық жуғыш заттар мен кір сабынның құр өзі дақтарды
кетіре алмайтындығы белгілі болды. Тек ферментті СЖЗ-қа қосу дақты кетіруде синергетикалық
тиімділік берді.
Өндіріс жағдайында зерттеудің нысаны ретінде əртүрлі дақтармен ластанған ас үй
жұмысшыларының халаттары мен асхана кірлері сыналды. Бақылау ретінде 50-60ºС кезінде 1 сағат
ішінде киімді құрамында энзимдер жоқ СЖЗ-пен жудық. Тəжірибенің 1-ші нұсқасында кірді фермент
қосып, дағдылы тəртіп бойынша жудық. Тəжірибенің 2-ші нұсқасында да кірді дағдылы тəртіп
бойынша жудық, бірақ бақылаумен салыстырғанда СЖЗ-ты 2 есе аз қостық (кесте 2).
Кесте 2 – Синтетикалық жуғыш заттардың тиімділік əсерін жоғарылату үшін ПЛ ферменттерін
қолдану
№
Тəжірибе нұсқалары
Қосылатын СЖЗтың мөлшері, г/1 кг
киім
1
СЖЗ (бақылау)
10
69
СЖЗ-қа ПЛ
ферментінің
қосылатын мөлшері
(%)
-
СЖЗ пен ПЛ
синергетикалық
тиімділік əсері, (%)
65
2
СЖЗ+ ферментті
препарат
10
0,5
90
3
½СЖЗ+ферментті
препарат
5
0,5
90
Жүргізілген тəжірибелер пектинлиаза ферменттерінің синтетикалық жуғыш заттардың тиімділік
əсерін арттыруда оң нəтижелер көрсетті. Егер синтетикалық жуғыш заттардың көміртекті дақтарды
кетіруіне шамасы жетпесе, жуғыш заттарға ферменттерді қосу синергетикалық тиімділік береді. Кір
жуу сапасы 90%-ға дейін жоғарылады, кір таза, əрі аппақ болды, бірақ аздаған сарғайған дақтар білінді.
Бұл препаратта α-амилаза болмағандықтан ыдырамай қалған, құрамында крахмалы бар көміртектер
болса керек. ПЛ ферменттерін 0,5%, 1 кг кірге 10 г СЖЗ-ты қосқанда жуу мүмкіншілігі 65%-дан 90%ға, яғни 25%-ға көтерілетіндігі белгілі болды. ПЛ ферменттерді кір жуғыш заттарға 0,5 % көлемінде
қосу СЖЗ шығынын 2 есе қысқартуға мүмкіндік берді.
1. Мартаков А.А., Молдабаева Р.К., Дианова О.П., Бекетаева Л.И. Применение пектолитического фермента,
продуцента гриба Asp.niger, для увеличения выхода виноградного сусла //Виноделие и виноградарства СССР. - 1962. - № 5.
2. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Изучение свойств пектинлиазных препаратов Penicillium adametzii,
P.citrinum и P.janthinellum // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - Т.31, - Вып. 3. - С. 267-271.
3. Капитонова Л.С. Применение микробных ферментов в первичной обработке льна. В кн.: Теоритеческие и
прикладные аспекты синтеза ферментов микроорганизмами. – Минск: Наука и техника. - 1982. - с. 155-167.
4. Dunleavy J.A., Fogarty W.M. Proceedings of the British Wood Preserving Association, 21st //Annual Conference,
Cambridge, - 1971. - p.1.
5. Блиева Р.К., Абиюров Б.Д., Беркінова К.А., Джиембаев Б.Ж. Способ получения пектиназы. - А.с. №696051.1979.
СССР.
6. Калунянц К.А., Ездаков Н.В., Привняк Н.Г. Применение ферментных препаратов в животноводстве //Применение
продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. М.: Колос, 1980. С.213-316.
7. Румянцева Г.И. Получение высокоочищенной β-глюкозидазы Geotrichum candidum, исследование ее свойств и
условий применения. - Автореф. дис… канд. техн. наук. – М.: 1978. - 24 с.
8. Уонг Д., Коней Ч., Демайн А и др. Ферментация и технология ферментов, М.: Легкая и пищевая промышленность. –
1983. - 335 с.
УДК 579.82
А.Т. Канаев, И.А. Мырзаханова
НОВЫЕ МЕТОДЫ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ И ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ВОДЫ ВОДОВОДА
«АСТРАХАНЬ – МАНГЫШЛАК»
(Казахский национальный педагогический университет имени Абая)
К новым конкурентоспособным методам обеззараживания относится ультрафильтрация через
поливолокнистые мембраны с размером пор порядка 0,01 мкм, обеспечивающие эффективность
обеззараживания 100% со сроком службы мембран не менее 10 лет. Ультрафильтрационные методы
нашли применение на многих десятках водопроводных станций, в том числе на нескольких
производительностью более 100 тыс.м3/сут.
Низко- и высоковольтные разряды токов высокой частоты, облучение ускоренными
электронами, гамма-облучение, лучи лазера и др., пока не нашли широкого применения на городских
водопроводах.
Дезинфицирующие средства нового поколения. В России в Институте эколого-технологических
проблем (ИЭТП) (г. Москва) разработаны и получены экологически безопасные полимерные
биоцидные препараты широкого спектра действия (без хлора) с длительным периодом последействия,
обладающие свойствами катионных флокулянтов. Их идентификация приведена в таблице 1.
Таблица 1 - Экологически безопасные дезинфектанты.
Название.
Класс опасности по
Действующее вещество
ГОСТ 12.1.007-76
БИОПАГ 1V
Относится
Ш
Полигексаметиленгуанидин
гидрохлорид
к Полигексаметиленгуанидин
70
Номера свидетельств, патентов
Свидетельство
о
государственной регистрации Р №0430048/4 от 13.06.2000 г.
Свидетельство
о
государ-
катионоактивным ПАВ
ФОСФОПАГ 1V Ш
фосфат
ственной регистрации №004499/5 от 23.09.1999 г.
Свидетельство
о
государПолидиоксадодекангуанидин
ЭКОПАГ 1V
Ш
ственной регистрации №0044хлорид
99/4 от 23.09.1999 г.
Гидрофобные
гуанидины Сополимеры
Патент №2144929
(ГЕМБИЦИД и др.)
Полигексаметиленгуанидина
Приоритет от 28.05.1998 г.
Действующим веществом дезинфицирующих средств является гексаметиленгуанидин (ПГМГ).
ПГМГ воздействует на клетки микроорганизмов, вызывая прекращение выработки ферментов, в
результате чего клетки гибнут в течение 30-60 мин при концентрации рабочего раствора 0,1 – 3,0 мг/л.
По внешнему виду биоциды представляют прозрачную бесцветную жидкость или с желтоватой
окраской. При концентрации рабочего раствора 1 % по действующему веществу рН = 7,0 – 9,5. В
твердом виде содержание активного вещества не менее 95%.
Дезинфектанты рекомендованы для обеззараживания воды плавательных бассейнов,
дезинфекции белья, предметов ухода за больными, поверхностей строительных конструкций в
лечебно-профилактических учреждениях, в пищевой промышленности для дезинфекции помещений и
при хранении продукции в складских помещениях.
Исследованы возможности и условия применения этих реагентов в качестве дезинфектантов и
катионных флокулянтов при очистке маломутных цветных вод. Биоциды, разработанные в ИЭТП,
получили известность и находят применение в Канаде, Польше, Германии, Белоруссии и на Украине.
Катионные биоциды семейства ПГМГ не содержат хлора, не образуют в воде токсичных
соединений, не придают воде запаха и привкуса, не вызывают аллергии, не накапливаются в
организме, обеспечивают пролонгированное биоцидное последействие. Не вызывая коррозии,
предотвращают биообрастание оборудования и трубопроводов систем охлаждения и оборотного
водоснабжения. Дезинфектант инактивирует как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы.
Обесцвечивает бактерицидное воздействие как на традиционные паразитарные фаги, вирусы, бактерии
и простейшие микроорганизмы, так и на возбудителей венерических болезней, ВИЧ-инфекции,
дерматофитов, грибов.
По данным, приведенным в таблице 2, возможно сделать вывод, что Фосфопаг имеет биоцидную
потенциальную способность примерно на уровне хлора по ОМЧ и колииндексу. Доза Фосфопага в 2,0
мг/л при продолжительности контакта 60 мин является достаточной для полного обеззараживания
воды до питьевого качества при исходных ОМЧ до 536 КОЕ/мл и колииндексе 536 КОЕ/л.
Таблица 2 - Очистка речной воды с обеззараживанием фосфопагом и хлором
Остат.
Хлоро
ОМЧ,
Коли-индекс,
Наименование
алюминий,
КОЕ/мл
КОЕ/л
форм, мкг/л
мг/л
1.Исходная
речная
480
230
0
14
вода
Фосфопаг, мг/л:
0.5
1.5
3.0
Хлор, мг/л:
0.5
1.5
3.0
СанПиН 2.1.4.1074-01
2.Исходная
речная
вода
Фосфопаг, мг/л:
1.0
1.5
2.0
Примечание:
Остаточный
фосфопаг,
мг/л
-
8
8
8
24
8
3
0.38
0.40
0.24
14
14
14
0.2
0.5
1.1
3
3
2
50
78
<3
<3
<3
0.4
0.4
0.4
0.5
36
46
70
60
-
1100
536
-
-
-
12
<3
<3
16
6
2
-
-
-
71
1)
Исходную воду обрабатывали коагулянтом (А12SО4)3 при добавке фосфопага и хлора при
продолжительности контакта 60 мин.
2) Исходную воду обрабатывали Фосфопагом без коагулянта.
3) Декантат пропускали через бумажный фильтр с белой лентой.
В условиях ВОС п.Кигач применение Фосфопага оправдано главным образом на стадии
обеззараживания с обеспечением длительного периода последействия.
Применительно к двухступенчатой схеме осветления и обесцвечивания Волжской воды на
стадии обеззараживания доза биоцида – 1,0 мг/л, продолжительность контакта – 60 мин, концентрация
рабочего раствора – 0,1-1 %, эффект обеззараживания 99,9 %, период последействия дезинфектанта
может быть в пределах 7 – 20 суток при наличии допустимого остаточного количества Фосфопага или
Биопага в воде.
Из рассмотрения традиционных и новых дезинфектантов возможно сделать следующие выводы:
а) Новые дезинфектанты ПГМГ имеют примерно одинаковую с хлором, УФ-обеззараживанием и
озонированием инактивирующую способность при дозах 1-1,5 мг/л и продолжительности контакта 1 ч.
б) Допустимые концентрации Биопага и Фосфопага в питьевой воде составляют соответственно 1,0 и 1,5
мг/л, ПДК для воды водоемов – 0,1 мг/л.
в) Рекомендовано дозирование препаратов в количестве до 0.3 мг/л перед осветлительным фильтром и
дополнительно 0,2 мг/л перед подачей в водовод и сеть для создания, пролонгированного эффекта.
г) Доза Биопага в 1 мг/л при контакте 1 ч обеспечивает полное обеззараживание воды по нормируемым
микроорганизмам, включая колифаг Т. Продолжительность последействия – от 7 и более суток.
д) Для приготовления рабочих растворов ПГМГ (0,1-4,0 %) и его дозирования в воду используют
стандартное оборудование.
Оценка влияния обеззараживания Биопагом на качества речной и транспортируемой воды. С
целью оценки влияния обеззараживания речной и транспортируемой воды биоцидным реагентом
«Биопаг» на их стабильность и коррозионную активность проведены эксперименты с определением
потенциала осаждения и коррозионной активности проб воды до и после обработки Биоцидом (τк = 3060 мин).
Карбонатные испытания осуществляли динамическим методом, коррозионную активность воды
определяли на коррозиметре «Ока» по методике, разработанной в АКХ им. Панфилова. Коррозионная
активность воды выражается скоростью коррозии стального вращающегося цилиндрического
электрода и измеряется в мг/см2. Шкала определения агрессивности воды имеет следующие
качественные характеристики: не более 0,1 мг/см2 – низкая; 0,1 – 0,2 – средняя; более 0,2 – высокая.
Было проведено обоснование возможности изучения процессов коррозии, протекающих на
внутренней поверхности водопроводных труб с помощью вращающихся цилиндрических электродов.
«Вращающийся цилиндрический электрод» представляет собой цилиндр, погруженный в
исследуемый раствор и крутящийся с постоянной частотой внутри другого цилиндра – неподвижного
сосуда.
Моделируются условия экстремально неблагоприятные для стальных водоводов – коррозия
обнаженной поверхности при максимальной подаче кислорода – окислителя. Устройство обеспечивает
частоту вращения электрода около 1500 об/мин, что для диаметра его – 10 мм (S=10 см2) соответствует
развитому турбулентному режиму (число Rе >5000) и скорости течения воды 0,65 м/с или
среднесуточному расходу воды в водоводе 60000 м3/сутки.
Качественная механическая подготовка образцов перед опытом необходима для получения
достоверных и воспроизводимых результатов по коррозионной активности воды и заключалась в
зачистке его боковой поверхности абразивными шкурками различной крупности. Во избежание
щелевой коррозии и устранения краевых эффектов образцы предварительно оксидируются. После
окончательной зачистки образцов до зеркального блеска их торцы покрываются химически стойким
лаком. Обезжиривание образцов проводится спиртом. Объем исследуемой воды – 0,5 л.
Коррозионная активность контролируется аналитически по содержанию железа в воде и
растворенных продуктах коррозии. Продукты коррозии на поверхности образца растворяются в
соляной кислоте (плотностью 1,12 г/см3), ингибированной уротропином. Исследованную воду с
нерастворимыми продуктами коррозии фильтровали, оставшиеся на фильтре продукты коррозии также
растворяют соляной кислотой (d=1.12 г/см3).
Таким образом, общее количество металла,
подвергшегося коррозии, переводят в раствор и анализируют по железу фотоколориметрическим
методом. Образец просушивают на фильтровальной бумаге и подвергают визуальному осмотру на
предмет локальной коррозии с подсчетом питтингов и язв, а также их замером. По разности
72
концентрации общего железа ΔFе в испытуемом растворе до и после эксперимента (τ = 3 ч)
определяют абсолютную коррозионную активность воды Н по формуле:
Н
Feобщ
S
, мг / см 2 ,
(1)
где: S – поверхность образца, см2.
Проведенные карбонатные испытания показали:
 дозирование в пробы речной и транспортируемой воды (449, 652, 973 км) реагента Биопаг в
количестве 1-2 мг/л повышает стабильность воды, приводя потенциал осаждения карбоната кальция в
область оптимальных значений 4-10 мг/л для транспортирования воды по стальным незащищенным
водоводам;
 учитывая обеззараживающий эффект и пролонгирующее действие Биопага, его
некоррозионный характер и неспособность к образованию токсичных компонентов при контакте с
водой, стойкость к окислению, наличие гигиенических сертификатов целесообразно провести
испытания его применения на водоводе по трассе Кульсары-Жана Узень;
 добавка Биопага к речной воде пр. Кигач понижает ее коррозионную активность, и скорость
коррозии образца из стали 17Г1С.
1. Исследование начальных этапов биокоррозии стали. Жиглецова С.К., Родин В.Б., Кобелев В.С., Александрова
Н.В., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Прикладная биохимия и микробиология, 2000, том 36. – С. 637-641.
2. Таубе П.Р., Баранова А.Г., Химия и микобиология воды. – М.: Высшая школа, 1983, 280 с.
3. Эванс Ю.Р. Коррозия и окисление металлов. – М.: Машгиз, 1962, 856 с.
4. Рачев Х., Стафанова С. Справочник по коррозии. – М.: Мир, 1982, 520 с.
5. Коррозия. Справочник // Под ред. Шраера Л.Л. - М.: Металлургия, 1981, 632 с.
6. Рейзин Б.Л., Стрижевский И.В., Шевелев Ф.А. Коррозия и зашита коммунальных водопроводов. - М.: Стройиздат, 1979, 398 с.
7. Шлугер М.А., Ажогин Ф.Ф., Ефимов Е.А. Коррозия и защита металлов. - М.: Металлургия, 1981, 215 с.
8. Герасимов В.В. Прогнозирование коррозии металлов. - М.: Металлургия, 1989, 152 с.
УДК: 579.26: 582.264
Д.К. Кирбаева, Б.К. Заядан, Г.Е. Уразбекова, С.А. Темирбаев
ƏРТҮРЛІ КОНЦЕНТРАЦИЯЛЫ ЦИНК СУЛЬФАТЫНЫҢ SPIRULINA PLATENSIS-ТІҢ
ӨНІМДІЛІГІНЕ ƏСЕРІ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, Алматы, Қазақстан)
Зерттеу жұмысында əртүрлі концентрациялы екі валентті цинк сульфатының цианобактерия Spirulina platensis
өнімділігіне (белок, хлорофилл а, каротиноидтар) əсері қарастырылады.
Соңғы жылдары иммунды жүйені көтеруде белсенділігі зор өсімдіктер жəне микробалдырлар
пигменттерін медицинада жаңа диагностикалық препараттарды алуға кең қолданылады. Жарық
фотосинтез арқылы клетка метаболизміне əсер ететін болса, цианобактериялардың хлорофилдері мен
фикоцианиндері ең негізгі жарықты жинаушы жəне энергияны фотожүйелік орталық реакцияларға
жеткізуші қызмет атқарады /1; 2/.
Тірі организмде төменгі мөлшерде болуына қарамастан микро- жəне ультрамикроэлементтер
əртүрлі ферменттер мен гормондардың, витаминдердің құрамына кіріп, клетканың қалыпты қызметі
мен барлық организмнің толық дамуын қамтамасыз етеді /3/.
Қазіргі кезде халық санағының тағам құрамында көптеген микронутриенттердiң төмендiгiнен
көптеген ауру түрлерінің көбеюіне, гипомикроэлементоздың дамуына əкелiп соғуда. Əсіресе
тіршілікке маңызды цинк микроэлементі организмнің барлық клеткаларының қалыптасуына өте
қажетті жəне адам организміне цинк тəулігіне 2-3 г шамасында түсіп тұру керек. Ал оның көптеген
мөлшері теріде, бауырда, бүйректе, көз қарашығында жəне сілекей бездерінде болады. Мұндай
маңызды антиоксиданттық қасиетке ие микроэлементтің микробалдыр құрамына жинақталуы мен
оның əсерін зерттеу өзекті /4-6/.
Көптеген жағдайда биологиялық активті қоспа өндіру үшін микроэлементтердің бейорганикалық
тұздарын қолданады жəне олардың төмен концентрацияда болуына қарамастан организмде сіңімділігі
төмен болады немесе шамадан тыс мөлшерде қолдану кезінде токсикалық əсер беру қаупі жоғарлайды.
Сондықтанда биотехнологиялық əдіспен алынып, эссенциялық микроэлементке байытылған жаңа
органикалық азықтық өнім ретінде спирулина клеткаларында өсірілген тəжірибелерді көптеп
кездестіруге болады /7/. Осыған байланысты бiздiң тəжiрибе жүргiзу мақсатымыз цинк сульфатының
73
əртүрлі концентрациясында цианобактерия Spirulina platensis штамының өнiмдiлiгiн зерттеу өзекті деп
қарастырылды.
Материалдам мен əдістер
Зерттеу жұмысына əл-Фараби атындағы ҚазҰу-нің микробиология кафедрасының
микробалдырлар коллекциясынан алынған цианобактерия Spirulina platensis штаммы қолданылды.
Тəжірибеге алынған спирулина клеткалары лабораториялық жағдайда стандардты Заррука ортасында
/8/, 4000 люкс жарықта, 28-300 С температурада өсірілді. Ал тəжірибелік нұсқалар екі валентті цинк
сульфатымен байытылды: 0 (бақылау); 1.0; 2.0; 3.0; 5.0 мг/л.
Клеткалардың оптикалық тығыздығы фотоэлектроколориметр əдісімен, балдырлардың
пигменттік құрамы 96% этанолда экстракциялау арқылы спектрофотометрде (662, 470 нм толқын
ұзындығында) анықталды /9/.
Зерттеу нəтижелері
Алдымен тəжірибе мақсатқа жету үшін цинктің əртүрлі концентрациясында өскен Spirulina
platensis клеткаларының өсу көрсеткіштері анықталды (Сурет 1).
Бастапқы екі тəулік бойы өскен бақылаудағы клеткалардың өсу тығыздығына қарағанда,
тəжірибедегі нұсқаларда өскен клеткалар бейімделгіштік кезеңде болғаны анықталды.
Сурет 1. Цинк сульфатының əртүрлі концентрациясындағы
Spirulina platensis клеткаларының өсу динамикасы
белок %
Ал тəжірибенің 8-ші тəулігінде бақылаудағы клеткалардың өсу көрсеткіштері 0,31 шамасында
болып, бұл кезде цинктің əртүрлі концентрациясында өскен клеткалардың да өсу қарқыны біршама
(1.0мг/л -0,26; 2.0мг/л-0,23; 3.0 мг/л-0,21; 5.0мг/л-0,15) теңескен нəтижелер алынды. Алайда, 10-шы
тəулікте бақылаумен (0,34) салыстырғанда, цинктің 1.0 мг/л концентрациясындағы спирулина
клеткаларының өсуі көрсеткіштері 1.0мг/л -де 0,25-ге, 2.0 мг/л-де 0,21-ге жетіп, ал цинктің 3.0 мг/л
концентрациясында 0,19, 5.0 мг/л-де 0,14 төмендегені белгіленді.
Бұл нəтижелерден бақылаудағы стандардты Заррука ортасына қарағанда, қоректік ортасы цинк
микроэлементімен байытылған орталардағы Spirulina platensis клеткаларының өсуі 8 тəулікке дейін
қарқынды дамып, кейінгі тəуліктерде өсуі біршама төмендейтіні анықталды.
Кейін бізбен осы тəуліктегі құрғақ биомассалардың белоктық құрамының жиналу көрсеткіштері
де қадағаланып, бұл көрсеткіштерді 2-ші суреттен көруге болады.
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Бакылау
1.0 мг/л
2.0 мг/л
3.0 мг/л
5.0 мг/л
Сурет 2. Цинк сульфатының əртүрлі концентрациясында өскен Spirulina platensis
биомассаларындығы белок көрсеткіштері, (%)
74
Спирулинаны Заррука ортасында (бақылауда) жəне цинктің 4 түрлі концентрацияларында 8
тəулік бойы өсірілген биомассаларындығы белок көрсеткіштері мынадай нəтижелер берді: бақылауда –
56,9%, цинктің 1.0 мг/л концентрациясында 57,8%, 2.0 г/л-де 59,5%, 3.0 мг/л-де 41,6% жетіп, 5.0 мг/л
концентрациясынан 27,4 % белок алынды. Бұл көрсеткіштерден цинктің 1,0-2.0 мг/л
концентрацияларының тиімділігін атап өтуге болады.
Сондай-ақ, тəжірибе барысында екі валентті цинк сульфатының əртүрлі концентрацияларында
өскен спирулина биомассасының пигменттерінің құрамы анықталды (кесте 1).
Кесте 1 – Цинк сульфатының əртүрлі концентрацияларында өскен Spіrulіna platensіs биомассасындағы
пигменттердің сандық көрсеткіші, (%)
Цинк сульфаты қосылған Заррука
ортасының əртүрлі
концентрациялары, мг/л
Бақылау (Заррука)
1,0 мг/л
2,0 мг/л
3,0 мг/л
5,0 мг/л
каротиноидтар
хлорофилл а,
0,23±0,009
0,28±0,01
0,32±0,01
0,15±0,006
0,11±0,003
0.94±0,03
1,2±0,06
1.5±0,05
0,51±0,02
0,37±0,01
Алынған зерттеу бойынша (бақылауда: каротиноидтары 0,23%, хлорофилл а 0.94%) цинктің 1,02.0 мг/л концентрацияларында өскен спирулина биомассасының каротиноидтары 0,28-0.32%,
хлорофилл а 1.2-1.5% шамасында болса, ал цинктің 3.0-5.0 мг/л концентрацияларындағы
каротиноидтар 0,15-0.11%, хлорофилл а 0.51-0.37% құрады.
Тəжірибе нəтижесінде, цинк сульфатының 1,0-2.0 мг/л концентрациялары спирулинаның
өнімділігін оптималды əсер берсе, бұл кезде керісінше, 5.0 мг/л концентрациялары спирулинаның
белок құрамын 29,5%-ға, хлорофилл мен каротиноидтар құрамын 0,57-0,12% төмендететіні анықталды.
Олай болса, бұл тəжірибе нəтижелеріндегі оптималды көрсеткіштерімен көзге түскен цинктың 1,0-2.0
мг/л концентрациялары келешекте спирулина ортасын бұл микроэлементпен байытуда тиімді
көрсеткіш болып табылды. Алайда спирулинаның өсуіне цинк сульфатының біршама тежеушілік əсер
берген 3,0-5.0 мг/л концентрацияларыда, спирулина құрамындағы бірқатар маңызды өнімділік
көрсеткіштеріне айтарлықтай өзгерістер енгізбеді.
1. Reed R. H., Warr S. R. C., Richardson D. L., Moore D. J. and Stewart W. D. P. Bluegreen algae (cyanobacteria): prospects
and perspectives // Plan. and Soil. – 1985. – V. 89. – P. 97 – 106.
2. Litchtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // In: Packer L., Glazer N,
editors. Methods in enzymology. – San Diego: Acad. Pres. – 1987. – V.148. – P. 350 – 381.
3. Скальный А.В. Микроэлементозы человека, диагностика и лечение. - М.: Изд-во КМК, 1999. - 96 с.
4. Hosetti B.B., Shivaraj R. V., Patil H. S. Effect of zink on the treatment of domestic sewage by Scenedesmus quadricauda //
Environ. Ecol. - 1999. - 8, №4. - P. 1220 - 1223.
5. Павлова О.Н., Грибанова Е.А., Желонкин Н.Н., Боронец Т.Ю., Первушкин С.В., Пурыгин П.П. Современные
подходы к классификации биологически активных добавок к пище // Вестник СамГУ. - 2007. - № 9. – С. 256-269.
6. Мazo G.N., Savvin S.N., Pronina N.A. Chemical speciation of Zn, Cu and Cr in Spіrulіna platensis microalgae // ICP
Information Newsletter. – 2002. - Vol. 27. - P. 138-139.
7. Changwal M.L. Earth food Spіrulіna: A new food to restore our health and planet. Spіrulіna Health Library. - Madras, India,
1994. - 28 р.
8. Zarrouk C. Contribution a l’etude d’une cyanophycee. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la crossance et
la photosynthese de Spirulina maxima // Ph. D. thesis. – Paris, 1966. – P. 138.
9. Tandeau de Marsac N. Complementary chromatic adaptation: physiological conditions and action spectra // In: Packer L.,
Glazer N, editors. Methods in enzymology. – San Diego: Acad. Press. – 1988. – V.167. – P.318 – 328.
***
Изучено влияние разных концентраций двухвалентного цинка на кривые роста и накоплению общего содержания
белка, каротиноидов, хлорофилл а цианобактерии Spirulina platensis. Установлено, что содержание цинка, значительно
превышающие его в среде Заррука не вызывают изменение биохимического состава и ингибирования роста клеток.
***
The influence of different concentration of bivalent zinc on growth curve and accumulation of total protein, carotenoids,
chlorophyll of cyanobacteria Spirulina platensis is studied. The content of zinc, considerable exceeding in the Zаrrouk medium does
not cause the change of biochemical composition and inhibition of cell growth.
75
Е.В. Куприянова, Н.А. Пронина
СО2-КОНЦЕНТРИРУЮЩИЙ МЕХАНИЗМ АЛКАЛОФИЛЬНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ИЗ
СОДОВЫХ ОЗЕР
(Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук)
В данном обзоре обсуждается история возникновения механизмов, дающих возможность осуществления
эффективного фотосинтеза в данную геологическую эпоху. Обсуждается необходимость СО2-концентрирующего
механизма для цианобактерий, обитающих в условиях содовых озер.
Цианобактерии являются одними из «старожилов» на нашей планете. Остатки первых
прокариот, в том числе напоминающих современные нитчатые цианобактерии, обнаруживаются в
древнейших из известных на Земле осадочных породах, возраст которых составляет 3.8 млрд. лет [1]. С
тех пор цианобактерии не претерпели существенных изменений с точки зрения морфологии и
ультраструктуры. И их древние остатки можно с успехом классифицировать по современным
альгологическим справочникам [2].
После своего возникновения прокариоты безраздельно господствовали на нашей планете в
течение 2 млрд. лет, что составляет больше половины от истории жизни на Земле в целом. При этом
они формировали сообщества, так называемые циано-бактериальные маты, состоящие соответственно
из цианобактерий и бактерий. Считается, что расцвет прокариот случился после «изобретения»
цианобактериями примерно 3.5 млрд. лет назад оксигенного фотосинтеза, использующего в качестве
источника электрона воду [3]. А поскольку вода – очень доступный субстрат, это и дало возможность
такой широкой экспансии.
Ранняя атмосфера Земли, образовавшаяся в Архее в результате дегазации магмы, была
восстановительной. В то время она состояла из паров воды, большого количества СО2 и других газов,
таких как метан, азот, окись углерода и др. По некоторым оценкам, содержание СО2 в то время
достигало примерно 80% [4]. Именно в период господства на Земле прокариот огромное количество
СО2, находящегося в ранней атмосфере, оказывается связанными в виде строматолитов – слоистых
отложений, состоящих в основном из карбоната кальция, и представляющих собой минерализованные
циано-бактериальные сообщества [2].
Одновременно со стоком СО2, фотосинтетический кислород, выделявшийся в результате
жизнедеятельности цианобактерий, постепенно насыщал атмосферу. Примерно 2 млрд. лет назад
уровень его содержания достиг 1% от современного, что считается началом атмосферы нового,
окислительного типа. К середине Протерозоя (1.7-1.8 млрд. лет назад) атмосфера Земли стала
полностью аэробной. Этот глобальный процесс затронул перестройку всей геосферно-биосферной
системы Земли [2, 5]. Таким образом, именно прокариоты дали возможность эволюции развиваться по
тому сценарию, который нам сегодня известен. С появлением кислорода в атмосфере стало возможно
использовать энергетически более выгодный процесс кислородного дыхания вместо анаэробного
брожения, и получать 38 молекул АТФ вместо двух из одной молекулы глюкозы. Одновременно
возник озоновый слой, преграждающий путь ультрафиолету. Все это дало возможность появления
высокоорганизованных эукариот, выхода жизни на сушу, и появления всех основных групп известных
ныне животных и растений [1].
Вместе с тем, широкое использование оксигенного фотосинтеза привело около 350 млн. лет
назад к критической ситуации для самих фотосинтетиков [6]. В результате неуклонного снижения
концентрации СО2 в атмосфере Земли с одновременным повышением содержания в ней кислорода,
СО2 стал лимитирующим ресурсом, а оксигеназная реакция РБФК/О приобрела статус серьезной
проблемы. Таким образом, формирование механизмов, позволяющих сохранять фотосинтетическую
активность, стало в этот период важным условием дальнейшего существования и развития
фотосинтетических организмов. Преодолеть возникшую ситуацию можно было двумя путями: 1)
увеличить количество ключевого фермента фиксации СО2 – РБФК/О и ее сродство к диоксиду
углерода: по этому пути пошло большинство растений С3-типа; 2) увеличить внутриклеточную
концентрацию СО2 – то есть, создать СО2-концентрирующий механизм. Эта стратегия привела к
появлению С4- и САМ-метаболизма. Перед цианобактериями, вклад которых в преобразование ранней
атмосферы был наиболее существенный, также встала задача сохранения эффективности фотосинтеза.
Наряду с другими водными С3-фотосинтетиками – микроводорослями, придерживаясь второй
адаптационной стратегии, цианобактерии «изобрели» СО2-концентрирующий механизм, отличный от
С4- и САМ-путей, известный сейчас под аббревиатурой ССМ (от англ. – «carbon concentration
mechanism») [6, 7]. Работу ССМ обеспечивает фермент карбоангидраза (КА, КФ 4.2.1.1) совместно с
76
переносчиками соединений неорганического углерода (Сi). В результате их слаженной работы в районе
активного сайта РБФК/О создается концентрация СО2, в 1000 раз превышающую таковую в среде,
окружающей клетку. КА участвует во всех этапах ССМ (поглощение Сi, предотвращение утечки Сi из
клетки, внутриклеточное преобразование форм Сi) [8].
Сформированная древними цианобактериями окислительная атмосфера дала толчок к развитию
и распространению эукариот. Со временем последние постепенно вытеснили прокариотические
сообщества в экологические ниши с экстремальными условиями обитания: соленые лагуны,
гидротермы или содовые озера с высоким содержанием карбонатов и показателем рН. Именно в этих
условиях они развиваются и в наши дни. Поскольку в таких местах обитания отсутствуют высшие
организмы, подобные микробные сообщества называются «реликтовыми» и считаются аналогами
экосистем прошлого [2].
С точки зрения изучения появления и эволюции ССМ особенный интерес представляют
алкалофильные цианобактерии содовых озер. На настоящее время не существует единого мнения по
поводу функционирования у них механизма концентрирования Ci. С одной стороны, эти организмы
развиваются в среде с высоким содержанием бикарбоната. Теоретически подобные условия не требуют
создания или поддержания ССМ. С другой стороны, наличие у алкалофильных цианобактерий всех
компонентов ССМ, а именно КА и переносчиков Ci, было показано экспериментально [9-12]. Кроме
того, нами было продемонстрировано накопление внутриклеточного пула Ci до величин, сравнимых с
пресноводными цианобактериями, у одного из представителей содовых озер - Rhabdoderma lineare [9].
Мы также наблюдали увеличение числа карбоксисом у этого организма при низкой концентрации
экзогенного Ci (неопубликованные данные). Именно в карбоксисомах цианобактерий происходит
преобразование внутриклеточного пула Ci, существующего в форме бикарбоната, в СО2, являющийся
субстратом для РБФК.
Таким образом, ССМ может существовать у цианобактерий содовых озер как артефакт,
сохранившийся у клеток с тех времен, когда они еще не были вытеснены эукариотами в экстремальные
условия обитания. В этом случае ССМ может активироваться при неблагоприятных условиях:
известно, что гидрохимические показатели воды содовых озер подвержены периодическим
изменениям вследствие сезонных циклов опреснения [11].
Второй причиной сохранения функционально активного ССМ у цианобактерий содовых озер
может служить недостаток подходящей формы экзогенного Ci: избыток карбоната или низкая
концентрация бикарбонат-ионов при высоких рН может служить спусковым механизмом для
индукции ССМ [9].
Еще одна гипотеза состоит в том, что бентосные цианобактерии, обитающие в условиях
плотного циано-бактериального мата, могут испытывать необходимость в ССМ из-за возможного
дефицита в экзогенном Ci как вследствие низкой скорости диффузии Ci в воде, так и из-за наличия
толстого экзополисахаридного слоя у самих клеток, препятствующего проникновению к ним субстрата
[6, 13]. Для кальцифицирующих цианобактерий, таких как Microcoleus, диффузия Ci может быть также
осложнена из-за отложения нерастворимого осадка карбоната кальция во внешних слоях клетки [10].
Однако, несмотря на то, что функционирование ССМ у алкалофильных цианобактерий из
содовых озер еще оставляет неразрешенные вопросы, уже на данном этапе исследования можно
заключить следующее. Поскольку в клетках «реликтовых» цианобактерий, предки которых имеют
возраст около 3.8 млрд. лет, были обнаружены все компоненты ССМ, это может указывать на более
древнее происхождение этого механизма, чем относящееся к 350 млн. лет назад, как это принято
считать в настоящее время.
1.
Еськов К.Ю. Удивительная палеонтология: история Земли и жизни на ней. - Москва: ЭНАС.- 2008.- 312 с.
2.
Заварзин Г.А. Становление Биосферы // Вестник РАН.- 2001.- T. 71. - C. 988-1001.
3.
Konhauser K. Biogeochemistry: deepening the early oxygen debate // Nature Geoscience.- 2009.- V. 2.- P. 241–242.
4.
Сорохтин О.Г., Ушаков С.А. Развитие Земли.- Москва: МГУ.- 2002.- 560 с.
5.
Заварзин Г.А. Эволюция геосферно-биосферной системы // Природа.- 2003.- T. 1.- C. 27-35.
6.
Price G.D., Badger M.R., Woodger F.J., Long B.M. Advances in Understanding the Cyanobacterial CO2-ConcentratingMechanism (CCM): Functional Components, Ci Transporters, Diversity, Genetic Regulation and Prospects for Engineering into Plants
// J. Exp. Bot.- 2008.- V. 59.- P. 1441-1461.
7.
Пронина Н.А. Организация и физиологическая роль СО2-концентрирующего механизма при фотосинтезе
микроводорослей // Физиология растений. - 2000. - Т. 47. - С. 801-810.
8.
Куприянова Е.В., Пронина Н.А. Карбоангидраза – фермент, преобразивший биосферу // Физиология растений. 2011. - Т. 58. - С. 163-176.
9.
Dudoladova M.V., Kupriyanova E.V., Markelova A.G., Sinetova M.P., Allakhverdiev S.I., Pronina N.A. The thylakoid
carbonic anhydrase associated with photosystem II is the component of inorganic carbon accumulating system in cells of halo- and
alkaliphilic cyanobacterium Rhabdoderma lineare // Biochim. Biophys. Acta.- 2007.- V. 1767.- P. 616-623.
77
10. Kupriyanova E., Villarejo A., Markelova A., Gerasimenko L., Zavarzin G., Samuelsson G., Los D.A., Pronina N.
Extracellular carbonic anhydrases of the stromatolite-forming cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes // Microbiology.- 2007.- V.
153.- P. 1149-1156.
11. Миходюк О.С., Заварзин Г.А., Ивановский Р.Н. Транспортные системы для карбоната у экстремально
натронофильной цианобактерии Euhalothece sp. // Микробиология. - 2008. - Т. 77. - С. 465-471.
12. Kupriyanova E.V., Sinetova M.A., Markelova A.G., Allakhverdiev S.I., Los D.A., Pronina N.A. Extracellular -class
carbonic anhydrase of the alkaliphilic cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes // J. Photochem. Photobiol. B: Biology.- 2011.- V.
103.- P. 78-86.
13. Raven J.A., Cockell C.S., De La Rocha C.L. The evolution of inorganic carbon concentrating mechanisms in
photosynthesis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2008.- V. 363.- P. 2641-2650.
Т.Д. Мукашева, Р.Ж. Бержанова, М.Х. Шигаева, Р.К. Сыдыкбекова,
Л.В. Игнатова, Д. Даутова, А.А. Сартаева
СТАБИЛИЗАЦИЯ ПОПУЛЯЦИИ И СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ
ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ
(Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г.Алматы)
Проведена сравнительная оценка методов отбора активных вариантов у штамма Rhodococcus equi 51КС.
Установлено, что для селекции вариантов с повышенной деструктивной активностью можно рекомендовать два метода
– метод продленного культивирования в жидкой среде с ПАУ и метод продленного культивирования с постепенным
возрастанием ПАУ в среде.
Подверженность микроорганизмов, применяемых в микробиологической промышленности,
популяционным изменениям приводит к снижению
их продуктивности и эффективности
технологического процесса. Это вызывает необходимостью проведения исследований по стабилизации
популяции и отбору культур с высокой стабильной активностью.
К числу ценных в практическом отношении культур относятся углеводородокисляющие
микроорганизмы, способные утилизировать углеводороды. Важность отбора вариантов, обладающих,
высокими способностями к деструкции, представляет большой интерес с точки зрения создания
полноценных и высококачественных препаратов для экобиотехнологических целей [1].
Использование новых селекционных подходов, направленных на повышение адаптивных
возможностей и получение преимущественно полезных мутаций получило развитие сравнительно
недавно. Традиционно для получения продуктивных штаммов микроорганизмов использовали
индицированный мутагенез с последующим отбором полезных мутантов, который применяется до сих
пор. В настоящее время применяют новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК
(генетическая инженерия). Однако использование рекомбинантных штаммов микроорганизмов для
экологических целей не целесообразно. Поэтому необходимо разрабатывать иные подходы для отбора
высокоактивных
вариантов у микроорганизмов - деструкторов. Одним из таких является
использование методов, основанных на повышение адаптивных возможностей микроорганизмовдеструкторов.
При хранении промышленных штаммов микроорганизмов, помимо потери жизнеспособности
клеток, наблюдается также процессы популяционной изменчивости. При этом доминантный фенотип
замещается другими измененными исходными свойствами и продуктивной активностью, происходит
потеря штаммами приоритетных свойств. Это обусловило необходимость проведения работ по
разработке подходов повышения деструктивной активности микроорганизмов, входящих в состав
препаратов для биоремедиации загрязненных экосистем после их хранения.
В этой связи были проведены исследования по раззрабоки методических рекомендации для
отбора
перспективных
микроорганизмов-деструкторов
полициклических
ароматических
углеводородов.
Материал и методы
В работе использовали штамм Rhodococcus equi 51КС [3-4]. Рост микроорганизмов на твердых
полициклических ароматических углеводородах изучали при выращивании микроорганизмов на
агаризованной минеральной среде с добавлением ПАУ на поверхность питательной среды.
Способность штаммов к трансформации полиароматических углеводородов изучали на агаризованной
минеральной среде 8Е по методике [5]. Микроорганизмы выращивали на агаризованной минеральной
среде на чашках Петри с нафталина (50 мг/л, 100 мг/л и 150 мг/л) и антрацена (25 мг/л, 50 мг/л и 100
мг/л). Углеводороды растворяли в хлороформе, равномерно распределяли по поверхности среды, затем
наливали второй тонкий слой среды. Колонии микроорганизмов, способные использовать
78
углеводороды образовывали зоны просветления, не флуоресцирующие в ультрафиолетовых лучах
поверхностного слоя углеводорода.
Определение стабильности признака роста на ПАУ. Стабильность признака биодеградации
штаммов-деструкторов определяли после хранения штаммов в течение года при температуре 4 - 5о С в
холодильнике. После хранения культур микроорганизмов, проводили активизацию способности к
росту на среде, содержащей 7% Тенгизской нефти. Затем проверяли стабильность признака роста на
нафталине и антрацене. Стабильность признака определяли следующим образом: бактериальную
культуру выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) при 28оС в течение 2 суток, после чего 0,1 мл
бактериальной культуры вносили в 10 мл свежего МПБ для повторного выращивания. Процедуру
повторяли 3-4 раза каждые 0, 3, 5 и 10 суток. На 3, 5, и 10 сутки роста из разведений делали высевы на
чашки Петри с агаризованной средой (МПА) для получения изолированных колоний. Методом реплик
сто отдельных колоний переносили на селективные чашки с нефтью. Стабильность признака
определяли как процентное соотношение количества вариантов, сохранивших способность к росту на
изучаемом субстрате, к общему числу проверенных вариантов.
Отбор вариантов, растущих при высоких концентрациях нафталина и антрацена. Культуру
выращивали на питательной среде МПБ или на синтетической среде с нафталином и антраценом.
Через 5-10 суток роста культуры высевали на твердые питательные среды. Культуру, выращенную в
МПБ, высевали на МПА с целью получения отдельных вариантов. Произвольно взятые варианты,
методом реплик пересевали на твердую питательную среду, содержащую различные концентрации
нафталина (150 -1000 мг /г) и антрацена (100 - 500 мг/л). Варианты, обладающие способностью к росту
на высоких концентрациях ПАУ, сохраняли в течение одного месяца, затем проверяли стабильность
признака роста на высоких концентрациях нафталина и антрацена.
Метод накопительно-адаптационный. Штамм выращивали на МПА в пробирках. Суспензию
клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300 мг/л) или антраценом (150 мг/л). Полученную
таким образом суспензию клеток переносили в жидкую среду с нафталином (500 мг/л) или
антраценом (300 мг/л) и культивировали на качалке в течении 10 суток. Через 10 суток
культивирования на качалке, производили высев суспензии на МПА с целью получения отдельных
колонии.
Метод продленного культивирования. Штамм выращивали на МПА в пробирках. Суспензию
клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300 мг/л) или антраценом (150 мг/л). Через 10 суток
выращивания на качалке суспензию объемом 10 мл переносили в колбы с жидкой средой, содержащие
нафталин (300 мг/л) или антрацен (150 мг/л) культивировали 10 суток. Через 10 суток еще раз
суспензию переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (300 мг/л) или антрацен (150
мг/л) культивировали 10 суток. Затем производили высев суспензии на МПА с целью получения
отдельных колонии.
Метод продленного культивирования постепенным возрастанием концентрации ПАУ. Штамм
выращивали на МПА в пробирках. Суспензию клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300
мг/л) или антраценом (150 мг/л). Через 10 суток выращивания на качалке суспензию объемом 10 мл
переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (400 мг/л) или антрацен (200 мг/л)
культивировали 10 суток. Через 10 суток еще раз суспензию переносили в колбы с жидкой средой,
содержащие нафталин (500 мг/л) или антрацен (300 мг/л) культивировали 10 суток. Затем
производили высев суспензии на МПА с целью получения отдельных колонии.
Произвольно взятые колонии, методом реплик пересевали на твердую питательную среду,
содержащую различные концентрации нафталина (300 -1000 мг /г) и антрацена (200 - 500 мг/л).
Колонии, обладающие способностью к росту на высоких концентрациях ПАУ, сохраняли в течение
одного месяца или более 3 месяцев, затем проверяли стабильность признака роста на высоких
концентрациях нафталина и антрацена.
Результаты и обсуждение
Разработка новых селекционных подходов, направленных на повышение адаптивных
возможностей микроорганизмов-деструкторов получило развитие сравнительно недавно. Отбор
вариантов с повышенной активностью у штаммов – деструкторов представляет собой задачу,
специфичную для каждого конкретного случая. Так, при изучении естественной изменчивости можно
провести стабилизирующий отбор активных вариантов у микроорганизмов - деструкторов. Однако в
селекции микроорганизмов – деструкторов важна их адаптация к потреблению загрязнителя. Для
отбора активных вариантов часто используют метод накопительных культур. Кроме т ого, еще в 1926
году для отбора деструкторов, усваивающих ароматические соединения, Доорен-де-Ийонгом был
применен метод продленного культивирования в присутствии в среде ксенобиотика [6]. Сейчас он
79
практически забыт, но в последние годы привлек внимание исследователей работающие с
микроорганизмами, окисляющие углеводороды. Все эти подходы были использованы для получения
вариантов с высокой деструктивной активностью у штамма Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ [78]. С целью рекомендации метода по отбору вариантов с высокой деструктивной активностью были
проведены такие же исследования со штаммом Rhodococcus equi 51КС, который также хорошо растет
на различных ПАУ (таблица 1). Так, отобрано 789 вариантов у штамма Rhodococcus equi 51КС,
полученных при использовании накопительно-адаптационного метода. Проверена их способность к
росту при концентрации ПАУ от 200 до 1000 мг/л. Из 789 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС
всего 25 вариантов росли на твердой среде с ПАУ, содержащие высокие концентрации.
Получены
908 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС при использовании метода
продленного культивирования. Все варианты были проверены на способность к росту при
концентрации ПАУ от 300 до 1000 мг/л.
Всего 13 вариантов росли на твердой среде с нафталином при концентрации 750 мг/л и 10
вариантов - 1000 мг/л, 15 вариантов росли на твердой среде с антраценом при концентрации 250 мг/л и
7 - 500 мг/л.
Отобрано 966 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС полученных при использовании метода
продленного культивирования с постепенным возрастанием концентрации нафталина. Из них 13
вариантов росли на твердой среде с нафталином при концентрации 500 мг/л и 6 вариантов при 1000
мг/л. и 16 вариантов росли на твердой среде, содержащие высокие концентрации антрацена.
В таблице 2 представлены сведение о стабильности вариантов, отобранных при использовании
трех методов штамма Rhodococcus equi 51КС, которые исследовались на протяжении трех пересевов.
Не все отобранные варианты штамма Rhodococcus equi 51КС сохранили признак роста на высоких
концентрациях ПАУ при последующих пересевах.
Наибольшее число вариантов, которые сохранили признак роста на средах с высоким
содержанием ПАУ, были отобраны методами продленного культивирования и продленного
культивирования с постепенным возрастанием ПАУ. Необходимо, отметить, что не все из отобранных
вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС сохранили признак роста на высоких концентрациях ПАУ
при пересевах.
Таблица 1 - Рост вариантов на различных концентрациях нафталина штамма Rhodococcus equi 51КС
ПАУ в Мор
КоличеКонцентрация ПАУ в среде, мг/л
среде фоти
ство
Количество вариантов (р<0,01)
мг/л
п
вариантов
нафталин
700
750
800
850
900
950
1000
накопительно-адаптационный метод
нафтал
1
787±7,3
25±1,3
23±0,3
12±0,2
7±0,2
5±0,2
5±0,2
2±0,2
ин
2
2±0,2
2±0,2метод продленного культивирования
нафтал
1
906±7,3
13±1,3
13±0,3
12±0,2
12±0,2
11±0,2
11±0,2
10±0,2
ин
2
2±0,2
2±0,2метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ
нафтал
1
966±9,3
19±1,3
12±1,7
10±1,1
10±1,1
7±1,2
7±1,2
6±1,3
ин
2
12±7,3
6±1,5
антрацен
300
350
400
450
500
накопительно-адаптационный метод
антрац
1
883±9,4
25±2,8
9±1,9
6±0,3
5±1,2
5±0,3
ен
2
10±1,3
7±1,3
метод продленного культивирования
антрац
1
784±6,3
15±1,3
13±1,6
11±1,3
11±1,5
7±0,9
ен
2
5±1,1
3±0,3метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ
антрац
1
874±7,3
13±2,8
11±1,8
10±0,8
8±0,9
6±0,8
ен
2
4±0,3
3±0,5
-
80
Наиболее количество вариантов, сохранивших способность к росту на высоких концентрациях
ПАУ, были получены с использованием этих же методов. Эти данные совпадают с результатами,
полученными на штамме Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ.
Таблица 2 - Стабильность признака роста вариантов
вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС.
Условия отбора
Количество
вариантов
проверенных
2
вариантов
на нафталине и антрацене у отобранных
Пассажи
3
абс
%
абс
%
абс
накопительно-адаптационный метод
нафталин
25
23
100
18
72,1
12
антрацен
15
100
100
12
71,0
5
метод продленного культивирования
нафталин
23
23
100
20
86,3
12
антрацен
21
100
100
15
71,5
10
метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ
нафталин
19
19
100
17
82,6
12
антрацен
16
12
88,8
10
62,5
8
4
%
48,1
33,3
56,1
47,6
53,1
41,1
Экспериментальный анализ методов селекции микроорганизмов-деструкторов токсических
поллютантов исследователями до сих пор не проводился. Отсутствуют также исследования по
совершенствованию способов отбора вариантов с повышенной активностью у микроорганизмовдеструкторов полициклических ароматических углеводородов. Отбор устойчивых микроорганизмов к
токсичному субстрату и способных к росту при высоких его концентрациях, возможно, облегчается
при наличии в среде ксенобиотика. На основании полученных данных можно предположить, что
отбор вариантов, способных к росту при более высоких концентрациях ксенобиотика можно
проводить при выращивании их на селективных средах, где в качестве селективного фактора является
загрязнитель. Таким образом, сравнительная оценка разных методов отбора вариантов, способных к
росту на высоких концентрациях ПАУ показала, что наиболее перспективными являются два метода:
продленного культивирования в жидкой среде с ПАУ и продленного культивирования в жидкой среде
с постепенным возрастанием в ней ПАУ.
1 Margesin R., Labbe D., Schinner F., Greer C.W., Wryte L.G. Characterizition of hydrocarbjn-degrading microbial population
in contaminated and pristine alpine soils // Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - Vol.69, .№6. - P. 3085-3092
3 Предпатент РК № 16968, МПК7 С 12 N 1/20. Штамм бактерии Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ используемый
для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов / Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Сыдыкбекова Р.К., Атемова Г.Т. - Опубл.
23.12.2004; Бюл. №1.
4 Мукашева Т.Д. Оценка деструктивной активности различных форм биопрепаратов из нефтеокисляющих
микроорганизмов //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - № 1 (31). –С. 75-81
5 Кiyohara Н., Nagao К., Уanа К. Rapid screen for bacteria degradatrion of water - insoluble solid hydrocarbons оn agar plates
// Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - Vol. 43, № 1. - Р. 454-457.
6 Скрябин Г.К., Головлева Л.А.Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М. «Наука», - 1976. 323 с.
7 Мукашева Т.Д. Изучение популяционной изменчивости углеводородкисляющего штамма Mycobacterium
thermoresistible 119- 3ГМ //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2010. - № 3 . – С. 73-75.
***
Бейімденудің үш тəсілін Rhodococcus equi 51КС субстрат штамына пайдалану кезінде орта құрамында жоғарғы
денгейде нафталин жəне антрацен болғанда өсу қабілеті жақсы байқалады.
***
When you use three methods to adapt to the strain of Rhodococcus equi 51KS substrate selection options, as well as the ability
to increase in environments with a high content of naphthalene and anthracene.
81
Р.Ж. Бержанова, Т.Д. Мукашева, М.Х. Шигаева, Р.К. Сыдыкбекова, Л.В. Игнатова, Ж.К. Искакова,
Д. Дуйсембинова, А. Алашбаева, А.А. Сартаева
СООБЩЕСТВА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА STREPTOMYCES В ПОДЗОНАЛЬНЫХ
ПОДТИПАХ ПОЧВ РАВНИННОЙ ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА
(Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г. Алматы)
Известно, что представители рода Streptomyces являются наиболее распространенным родом
актиномицетов в почвенном комплексе. Актиномицеты живут в различных почвах, особенно часто их
обнаруживают в подзолистых и красноземах [1]. Ряд исследователей из различных типов почв впервые
выделили штамм 19/97М Streptomyces lateritius Sveschnikova и проведены исследования по
твердофазному культивированию биологически активного штамма на коре пихты и лиственницы и
древесной зелени пихты [2, 3].
Ряд авторов проводили исследования динамики изменений в структуре сообщества
актиномицетов чернозема обыкновенного и показали, что в сообществе стрептомицетов верхнего слоя
почвы во все сезоны высокую долю участия имеют St.sporoherbeus секция Azureus серии Coerulescens
и St.grisinus из секции Cinereus серии Achromogenes (21-24 и 11-17% соответственно). Тогда как в слое
10-20 см весной и осенью доминирующее положение занимал St.sporoherbeus, а летом – St. grisinus и
St. dayalbaghensis из секции Albus серии Albocoloratus. В нижележащем слое (20-30 см) в весенний и
летний периоды наибольшая доля участия характерна для St.violaceomaculatus из секции Roseus серии
Roseovilaceus,а осенью- St.enduracidicus из секции Cinereus серии Chromogenes, St.grisinus и
St.sporoherbeus [4].
Материалы и методы исследований
Для определения видов актиномицетов были изучены следующие диагностические признаки [5,
6]. Морфологические – форма цепочек спор и характер поверхности оболочки спор. Для изучения
морфологического строения репродуктивных структур культуры актиномицетов выращивали на среде
овсяной агар в чашках Петри. Тип образования цепочек и характер поверхности спор определяли у
зрелых культур обычно на 7-14-й день роста, иногда более поздние сроки. Кусочек агара с мицелием
помещали на предметное стекло, срезав бритвой предварительно весь лишний агар, и просматривали
под микроскопом MOTIC BA 300. Для обнаружения изомеров ДАПК биомассу актиномицетов в
количестве одной микробиологической петли помещали в маленькую пробирку и заливали 0,1 мл 6 н.
HCl. Проводили разделение аминокислот с использованием растворителей: метанол:
дистиллированная вода: 6 н. HCl:пиримидин [7]. Культуральные свойства - цвет воздушного и
субстратного мицелия, цвет растворимых пигментов окрашивающих среду, производили на 7-, 14- и
21-й день роста культуры. Субстратный мицелий со спорами наблюдали, используя метод можно
желобка. Актиномицеты выращивали на агаризованной овсяной среде, используя метод желобка. В
агаровой пластинке в чашке Петри вырезали стерильным скальпелем желобок шириной в 1 см на всю
глубину агара. Края желоба засевают культурой актиномицета. На засеянные участки желобка
помещали предметное стерильное стекло. Чашки инкубировали в термостате при температуре роста
актиномицета. Стекла снимали с агара, фиксировали жидкостью Карнуа, окрашивали метиленовым
синим (водный 1 %-й раствор) и рассматривали под микроскопом.
Результаты и обсуждения
Актиномицеты широко распространены в природе и основным местом их обитания является
почва. При изучении распространения актиномицетов в почвах немалую роль играет видовой их
видовой состав. При изучении различных типов почв Казахстана была установлена смена
доминирующих форм.
Результаты исследований показали, что отдельные типы почв имеют характерные спектры
доминирующих форм микроорганизмов. Некоторые виды могут встречаться в разнообразных почвах.
Доминирующее положение в черноземе обыкновенном занимали актиномицеты рода Streptomyces. На
питательных средах доминировали кожистые обособленные колонии, на поверхности которых
воздушный мицелий образовывал хлопьевидные переплетения. Актиномицеты рода Streptomyces были
обнаружены во всех типах почв Казахстана на глубине 0-10 и 10-20 см. Каждый тип почвы
характеризовался специфическим спектром наиболее распространенных видов стрептомицетов. Все
выделенные стрептомицеты распределяли согласно принципу классификации, предложенной Г.Ф.
Гаузе. При этом было установлено, что большинство актиномицетов по цвету воздушного мицелия
принадлежали к следующей секции Albus, Imperfectus, Helvoloflavus и Cinereus. А по цвету
субстратного мицелия на минеральной среде стрептомицеты каждой секции подразделяются на серии
Aureus, Albus, Roseus и Cinereus. Если образуется темно- зеленый, бурый или черный растворимый
82
пигмент, то считается, что культура образует меланоидные пигменты. Такие культуры встречались
только в бурой пустынной почве.
Идентичные штаммы стрептомицетов группировали на основании морфологических (строение
репродуктивных структур) и культуральных признаков (окраска воздушного и субстратного мицелия,
образование растворимых пигментов и характер роста культур) при росте на крахмало-казеиновой
среде. Для определения видовой принадлежности исследовали морфологические и культуральные
признаки, строение органов спороношения на среде овсяной агар. При определении видов у
актиномицетов также учитывали их способность образовывать красящее вещество (пигменты),
диффундирующие в среду. У представителей рода Streptomyces – колонии часто кожистые и
обособленные, поверхность вначале гладкая, а на 14 сутки формируются переплетения воздушного
мицелия. Воздушный мицелий состоит из различных спор, образуя цепочки спор на ветвях воздушного
мицелия, спиральные цепочки спор с хорошо развитыми правильными, растянутыми спиралями, число
спиралей от 2 до 5. Воздушный мицелий белый. Цвет субстратного мицелия определяли по цвету
обратной стороны колонии. Если цвет субстратного мицелия изменяется в процессе роста культур, то
последний цвет будет основным. Цвет субстратного мицелия описывали на овсяном агаре на 7-, 14- и
21-й день роста культуры. Диагностическую ценность имеет только хорошо выраженная окраска.
Грамположительные, растут при температуре 25 – 300С. У этих культур в клеточной стенке
пептидогликана содержится LL-ДАПК. Все изученные культуры этого рода выделяют пигменты,
диффундирующие в культуральную среду (рисунок 1). Все культуры каталазоположительные.
Различаются между собой по разложению крахмала, желатины и казеина. Из культуральных
показателей для разделения актиномицетов на группы наиболее значима окраска культур пигментация. По этому признаку представители рода Streptomyces поделили на две группы бесцветные и пигментированные.
Анализируя таблицу 1 можно сказать, что в каждом типе почвы имеется специфический спектр
распространенных видов актиномицетов рода Streptomyces.
Для большинства видов стрептомицетов отмечена явная приуроченность к определенному типу
почв. Род Streptomyces встречается во всех типах почв Казахстана. Из них наиболее распространенный
вид это S.albus, который встречался почти во всех исследованных образцах почвы.
Представители вида S.coelicolor выделены из серобурой пустынной, бурой пустынной, светлокаштановой щебнистой и среднекаштановой почве.
Культуры S.griseoflavus и S. сyaneus главным образом выделялись только из бурой пустынной
почвы Карагандинской области. Вид S. сyaneus можно считать основным представителем типичного
чернозема.
Таблица 1 - Распределение доминантных видов представителей рода Streptomyces в почвах
различных типов (тыс. КОЕ/г почвы)
Тип почв
S.
S.
S.albu
S.
S.capu
coelicol griseofl
s
cyaneus ensis
or
avus
Серобурая, пустынная, Алматинская обл.
1,5
2,8
Серобурая, пустынная, Карагандинская обл.
11,2
11,8
Серобурая, пустынная, Жамбылская обл.
Бурая пустынная, Карагандинская обл.
0,5
21,5
3,1
Светло-каштановая, щебнистая, Карагандинская
0,1
обл.
Среднекаштановая, Карагандинская обл.
1,1
10,2
50,3
Темно-каштановая, карбонатная, Акмолинская
область, Жаркаинский район
Темно-каштановая, карбонатная, Акмолинская
1,2
область, Ерейментауский район
Чернозем обыкновенный, Северо-казахстанская
область
Чернозем южный, Акмолинская область,
12,3
Зерендинский район
Чернозем южный, Костанайская область
8,9
83
Следует отметить, что культура Streptomyces capuensis выявлена только в среднекаштановой
почве Карагандинской области, а в других исследованных почвенных образцах практически
отсутствовала (рисунок 1).
Streptomyces coelicolor
Streptomyces griseoflavus
Рисунок 1 – Макроморфология и микроморфология актиномицетов рода Streptomyces
Стрептомицеты делятся на две группы. Первые при росте на питательных средах есть культуры,
которые не образуют красящие вещества. К ней отнесена только одна культура Streptomyces cyaneus.
Воздушный мицелий таких актиномицетов может быть белым, светло-серым, кремовым, нижняя
сторона колонии бесцветная. Актиномицеты второй группы образуют красящие вещества - пигменты.
Колонии этих культур при росте на питательных средах приобретали различную окраску: синюю,
фиолетовую, желтую, оранжевую, черную, коричневую. По этому признаку культуры Streptomyces
griseoflavus, Streptomyces albus, Streptomyces coelicolor и Streptomyces capuensis отнесены к
актиномицетам второй группы.
Внешний вид колоний актиномицетов также различен: колонии бывают с гладкой, бугристой,
складчатой и зернистой поверхностью. Воздушный мицелий у всех изученных актиномицетов
формировался на поверхности колонии. Нити его отходят от мицелия колонии, разрастаются в густую
пушистую, бархатистую или мучнистую массу. У культуры Streptomyces griseoflavus – колонии
округлой формы, поверхность морщинистая, характерен белый воздушный мицелий, субстратный
мицелий темно-коричневого цвета, при росте на глюкозо-дрожжевой среде образуют черный
растворимый пигмент, выделяющийся пигмент окрашивает среду, это связано с образованием
меланоидных пигментов. При изучении морфологических признаков было установлено, цепочки спор
спиральные. Данная культура отнесена серии Albus и представлена видом Streptomyces griseoflavus
(рисунок 2).
Рисунок 2 – Мицелий со спиралями у актиномицетов вида Streptomyces coelicolor
Streptomyces albus цепочки спор в виде крючков, спирали с одним завитком, споры гладкие, на
среде глицерин – нитратный агар колонии округлой формы, поверхность морщинистая, субстратный
мицелий темно-бурого цвета, а воздушный мицелий серый с различными оттенками, меланоидные
пигменты не образует.
К серии Helvoloflavus отнесен вид Streptomyces cyaneus на среде глицерин – нитратный агар
колонии оранжевого цвета округлой формы, поверхность выпуклая морщинистая, не выделяет пигмент
в среду, воздушный мицелий желтоватый, субстратный оранжевый.
Представители секции Cinereus отнесены к виду Streptomyces coelicolor на среде глицерин –
нитратный агар колонии округлой формы, поверхность морщинистая, выделяют растворимые
84
пигменты, окрашивающие среду, субстратный мицелий буроватого цвета, воздушный мицелий серый с
различными оттенками. У этой культуры цепочки спор прямые, волнистые.
Культура, отнесенная к серии Imperfectus, идентифицирована как Streptomyces capuensis –
колонии черного цвета, поверхность гладкая, но со временем поверхность становится морщинистой,
выделяет темно бурый пигмент в среду, характерен специфический запах; субстратный мицелий темно
коричневого цвета, а воздушный мицелий плохо развит.
Исследования целинного состояния подзональных подтипов почв равнинной территории
Казахстана показали, что во всех типах почв выявлены стрептомицеты, и представлены следующими
видами: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus и Streptomyces coelicolor.
1 Гришко В.Н., Сыщикова О.В. Сообщества актиномицетов рода Streptomyces в почвах, загрязненных тяжелыми
металлами // Почвоведение. - 2009. - № 2. - С. 235-243.
2 Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Оборотов Г. В. Мицелиальные бактерии засоленных почв // Почвоведение. - 2008. - №
10. - С. 1250-1257.
3 Зенова Г.М., Грядунова А.А., Поздняков А.И., Звягинцев Д.Г. Аэробные и микрофильные актиномицеты
агротрофяной и трофяной типичных почв // Почвоведение. - 2008. - №2. - С. 235-240.
4 Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Полянская Л.М. Разнообразие грибов и актиномицетов и их
экологические функции // Почвоведение. - 1996. - №6. – С. 705-713.
5 Гаузе Г.Ф., Т.П. Преображенская, Свешникова М.А, Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель
актиномицетов.- М.: Наука, 1983. - 258 c.
6 West M. J., Williams S.T., Embley T.M., Munro J.C. Using bacteriofages for skrining of soil and soil isolates on presence
of specific Аctinomycetes // The 9-th Intern. Sym. on the Biol. of Actinomycetes. - Moscow, 1994.
7 Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - Изд-во МГУ, 1991. - С. 131 – 132.
***
Қазақстан топырағынан бөлініп алынған актиномицеттердің түрлік құрамы алуантүрлі. Барлық топырақ
үлгілерінен стрептомицеттер бөлініп алынды жəне келесі түрлермен белгіленді: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus,
Streptomyces cyaneus жəне Streptomyces coelicolor.
***
Species composition of actinomycetes from soil of Kazakhstan is very diverse. In all types of soil found stpretomicety and are
represented by the following species: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus and Streptomyces
coelicolor.
Т.Д. Мукашева, М.Х. Шигаева, Р.Ж. Бержанова, Р.К. Сыдыкбекова,
Л.В. Игнатова, Д. Даутова, А. Алашбаева, А.А. Сартаева
РАЗРАБОТКА РЕГЛАМЕНТА ПОЛУЧЕНИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ
КОМПОЗИЦИЙ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ И ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ
ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ
(Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г. Алматы)
Использование препаратов на основе микроорганизмов, состоящих из различных штаммов,
способных окислять углеводороды нефти, приводит к ускорению процесса очистки почвы. В условиях
повышенного уровня загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами необходимо
применять препараты из композиции из разных видов нефтеокисляющих микроорганизмов. Так, в
России наиболее известными из них являются «Путидойл», «Деворойл», «Биодеструктор», «Экойл»,
«Олеворин», «Родотрин», «Микрозим тм Петро тит», «Эконадин». В Казахстане разработана
композиция на основе природных штаммов Pseudomonas putida ГНПО ПЭ-Р-6, Pseudomonas
fluorescens ГНПО ПЭ-Р-5, Bacillus subtilis ГНПО ПЭ-Р-7 и комплекса минерального удобрения дигидрофосфата аммония и гирофлорида калия [1].
Препараты, разработанные в России не применимы в условиях Казахстана. Для использования
таких препаратов для очистки почвогрунтов и нефтешламов необходимо создания особых условий с
учетом климатических параметров. Использование зарубежных препаратов нерационально. Эти
препараты отличаются дороговизной для казахстанских потребителей. В связи с этим при разработке
биопрепаратов для очистки почвогрунтов и нефтешламов актуальной задачей является создание
многокомпонентных композиции из нефтеокисляющих микроорганизмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Углеводородокисляющие
микроорганизмы:
Mycobacterium
thermoresistible
119-3ГМ,
Rhodococcus equi 51КС, Mycobacterium sp. 222АТ, Mycobacterium sp. 229СЗ; Rhodococcus sp. 1СЗ,
Rhodococcus sp. 115КК; Bacillus sp. 26АТ, Bacillus sp. 114КС; Pseudomonas sp. 122АС и культуры
дрожжей Candida nitratiovorans В1, Candida chilensis В2, Trichosporon cutaneum Р20СО2 и Trichosporon
terrestre СМ7 [2].
85
Для определения оценки деструктивной активности углеводродкисляющих микроорганизмов
использовали минеральную среду следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,2; KH2PO4 - 1,0;
NH4NO3 - 1,0; CaCl2 - 0,02; FeSO4 – 0,002; дистиллированная вода – 1л; нефть и нефтепродукты
добавляли от 30 мл/л до 200 мл/л.
Питательные среды для получения высокого выхода биомассы: Среда 8Е – (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л,
КН2РО4 – 0,7 г/л, MgSO4 × 7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л [3]. Среда Раймонда - NH4NO3- 1г/л, К2НРО4 – 1
г/л, КН2РО4 – 1 г/л, МgSО4 - 0,2 г/л, СаСl2 - 0,02 г/л, FeSO4-0,002 г/л, дрожжевой экстракт 1 г/л, 1 литр
дистиллированной воды [4].Среда Макланга - NaNO3 – 2 г/л, MnSO4 × 7H2O - 0,3 г/л, Fe(SO4)3 – 0,001
г/л, K2HPO4 - 1 г/л, ZnSO4 - 0,002 г/л [5].
Минеральная среда - K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,2; KH2PO4 - 1,0; NH4NO3 - 1,0; CaCl2 - 0,02; FeSO4 –
0,002 [6].
Питательная среда для получения посевного материала: – (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,7 г/л,
MgSO4 × 7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л [7].
Активация культур после хранения.
Для активации культур использовали клетки
микроорганизмов в экспоненциальной фазе их роста. После хранения двухсуточные культуры
бактерий и трехсуточные культуры дрожжей смывали с косяков и переносили в минеральную среду,
содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии 3% ксенобиотика.
Культивирование осуществляли на качалке в условиях интенсивной аэрации при температуре 28 0С.
Бактерии выращивали 48 часов, а дрожжевые культуры 72 часа. На 2, 3 сутки роста из
соответствующих разведений делали высевы на чашки Петри с агаризованной средой (МПА или СА)
для получения изолированных колоний, затем адаптированные колонии микроорганизмов высевали на
косяки.
Получение биомассы клеток.
Для получения биомассы композиции, состоящей из
углеводородокисляющих штаммов, культуры по отдельности выращивали минеральной среде с
титром клеток 109. В качестве посевной среды использовали минеральную среду. Культуры в посевной
среде выращивали на качалке 2 суток. Инокулят из посевной среды переносили в минеральную среду.
Для этого в колбы на 500 мл вносили по 100 мл минеральной среды. Культуры выращивали при
температуре 280С на качалке 220 об/мин в течение 2 суток для бактерий и 3 суток для дрожжей до
титра клеток 1010-11. Из полученного посевного материала брали по 1 мл клеточной суспензии и все
шесть штаммов выращивали в ферментационной среде. Колбы засевали подготовленными
суспензиями клеток предлагаемых штаммов в таком количестве, чтобы в 1 мл минеральной среды
содержалось около 109 клеток. Биомассу микроорганизмов культивировали на качалке при 220 об/мин
в течение 48 часов. Через 48 часов определяли общую численность. Аналогичные эксперименты
проводили с использованием среды Раймонда и Макланга.
Получение посевного материала. Клетки каждого штамма после хранения со скошенного агара
переносили в колбы со средой следующего состава: (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,7 г/л, MgSO4 ×
7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л. В качестве органических веществ использовали дрожжевой автолизат в
количестве 0,5% и 1% и в качестве единственного источника углерода и энергии 3% дизельного
топлива. Культивировали на качалке при аэрации и температуре 28°С в течение 2 -3 суток.
Результаты и обсуждение
Подбор и отработка основных параметров для получения многокомпонентной композиции,
состоящей из комплекса разных родов микроорганизмов
В мировой практике широко используется технология биоремедиации - внесения в загрязненные
нефтепродуктами участки почвы и воды концентрированных биопрепаратов на основе
углеводородокисляющих
микроорганизмов,
которые
интенсифицируют
метаболизм
нефтезагрязненных почв.
Для получения посевного материала бактериальные штаммы выращивали 20 - 24 часов, a
дрожжевые штаммы 72 часа. Затем, на стадии получения биомассы инокуляты соединяли в одну колбу
со средой того же состава, внося в качестве посевного материала штаммы в соотношении (1:1), При
этом сокращается срок их совместного культивирования до 26-28 часов, с конечным нейтральным
значением pH культуральной жидкости. В течение эксперимента определяли вес сухой биомассы и pH
среды.
Препараты, используемые в очистки экосистем, представляют собой биомассу жизнеспособных
клеток или лиофилизированные клетки штаммов деструкторов. Для получения максимального выхода
клеточной биомассы большое значение имеет получение посевного материала в предферментационной
стадии из многокомпонентных композиций.
86
Как видно из полученных данных, при культивировании предферментационной стадии
углеводородокисляющих штаммов на среде, содержащей 1% автолизата, вес сухой биомассы примерно
увеличивался в 4 раза (рисунок 1, а). На первые сутки вес сухой биомассы в среднем составил 0,9 г на
100 мл среды, а на вторые сутки сухой вес биомассы равнялся 3,8 г на 100 мл среды. При внесении в
среду 0,5 % дрожжевого автолизата сухой вес и плотность полученной биомассы поднялся на 2
порядка по сравнению с исходным весом. Так исходный вес составил – 0,9 г на 100 мл среды, а на 2
сутки 2,1 – 2,5 г на 100 мл среды (рисунок 1, б).
Таким образом, оптимальные концентрации компонентов среды как 1% автолизата увеличивает
выход получения посевного материала.
Совместное культивирование штаммов – деструкторов на последнем этапе позволяет упростить
и удешевить процесс промышленной наработки препарата, получить конечный продукт с более
высоким титром углеводородокисляющих клеток и с нейтральным значением pH культуральной
жидкости, полнее утилизировать основные компоненты питательной среды.
а) среда с 1% автолизата
б) среда с 0,5 % автолизата
Рисунок 1 – Получение посевного материала для наработки биомассы нефтеокисляющих
микроорганизмов
Состав компонентов питательной среды и их концентрации были специально подобраны.
Выращивают каждый штамм индивидуально в соответствии с их физиологическими особенностями.
Инокулят из предферментационной стадии переносили в ферментационную среду. Выращивание
проводили в колбах с рабочим объемом 500 мл, инокулят вносили в количестве 10 % от объема среды.
При культивировании композиций в среде с рН 7,3 сухой вес биомассы на 2 сутки выращивания
достигал максимальных значений 7,8 г/мл. Тогда как исходный вес сухой биомассы на первые часы
культивирования составил 1,3 г/мл. Кратность увеличения составляла примерно 6,1 раза (рисунок 2, а).
Из полученных результатов следует, что при совместном культивировании штаммов, значения
pH культуральной жидкости в течение процесса ферментации находилась в пределах 7,3-7,5, что
является несомненным достоинством процесса.
Также были определен температурный режим культивирования. Температура среды является
наиболее значимым лимитирующим фактором всех метаболических процессов. Штаммы новых
композиций выращивали при температуре 200С, 28° С, 300С и 350С. Было показано, что оптимальный
температурный интервал для роста и развития углеводородокисляющих микроорганизмов является 280 С. При температуре 280С наблюдается максимальный прирост биомассы композиции, оптическая
плотность клеточной суспензии увеличивается в 4 раза по сравнению с исходными значениями. В
начальные сутки оптическая плотность равнялась – 0,15, а на сутки значения достигли до 0,55 оп.
единиц (рисунок 2, б). Отклонения от этой температуры, как в сторону уменьшения 200С, так и в
сторону увеличения 350С замедляется процесс роста и развития углеводородокисляющих
микроорганизмов. Падает титр клеточной биомассы многокомпонентной композиции. Это связано с
тем, что исследуемая группа УОМ является мезофильной и указанные температурные условия для них
наиболее оптимальны. Следует также учесть, что при повышении температуры наблюдается
уменьшение растворимости кислорода в воде, что отрицательно сказывается на росте и развитии
новых композиций.
87
а) рН среды
б) температура среды
Рисунок 2 – Прирост клеточной биомассы новых композиции нефтеокисляющих
микроорганизмов при рН и температуре
Таким образом, оптимальной температурой для роста и развития
многокомпонентной
композиции надо считать 280 С.
При разработке новых композиции исходили из общего положения о том, что эффективность
биопрепарата определяется высоким титром клеток в этом препарате. Использование нативной
биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов или их суспензий ограничено сроками хранения, как
правило, один месяц. Известно, что для хранения используют различные сорбенты: минеральные
(вермикулит, цеолит, керамзит), органические (торф, солома, опилки), синтетические (ткани, волокна).
Для концентрирования клеточной биомассы многокомпонентной композиции в качестве
стабилизаторов использовали опилки и бентонит. При выращивании клеточной биомассы композиции
нефтеокисляющих микроорганизмов получили препарат с высоким титром клеток 10,8х1012 КОЕ/мл.
По данным литературы известно, что добавка стабилизатора позволяет сохранить высокую
углеводородокисляющую активность препарата во время хранения. Густая клеточная биомасса,
представляющая собой концентрат живых клеток штаммов и остатков питательной среды, добавляли
опилки для сгущения (в количестве 5 г на 300 мл среды). Затем ставили на хранение при температуре
+40С на 3 месяца. На каждом этапе контролировали численность жизнеспособных клеток в препарате.
До хранения количество жизнеспособных клеток в биопрепарате было в пределах 10,1 х 1012 КОЕ/мл,
а после 90 дней хранения количество жизнеспособных клеток оставалось на высоком и составило 9,8 х
1012 КОЕ/мл.
Клетки культур, выращенные в течение 48-72 часов, помещали в стерильные флаконы, затем
вносили стерильный бентонит из расчета 1:1, проверяли количество жизнеспособных клеток до
хранения и после хранения. Проверяли численность жизнеспособных клеток в 1 мл биомассы. При
проверке было установлено, что титр жизнеспособных клеток снижается только на два порядка.
Численность на первые сутки составила 11,8 х 1012 КОЕ/мл, после хранения было в пределах 7,3 х 109
КОЕ/мл.
Таким образом, после 3 месяцев хранения образцы биомассы композиций состоящих из
нефтеокисляющих микроорганизмов, приготовленные с использованием в качестве носителя
бентонита, выживаемость клеток в биопрепаратах снижалась на два порядка.
Изучение деструктивной активности биопрепарата в модельных условиях. Для создания
биопрепаратов нами использовались бактериальные культуры и дрожжевые организмы. Проведена
серия модельных опытов по изучению активности биомассы композиции при внесении их в
естественно загрязненные почвы. Композиции из штаммов – деструкторов из нефтеокисляющих
микроорганизмов вносили из расчета 500 мг на 100 г загрязненной почвы. Продолжительность
эксперимента составила 20 дней. Определяли приживаемость микроорганизмов и количество
остаточной нефти в нефтезагрязненной почве. Для сгущения биомассы использовали опилки.
Модельные исследования по очистки почвогрунта и нефтешлама. В почвогрунте исходная
степень загрязнения нефтяными углеводородами составила 230,9 г/кг почвы. Через 20 суток
количество нефти в контроле без внесения микроорганизмов снизилось лишь до 219,1 г/кг почвы. В
опытных вариантах содержание нефти на 20 сутки снизилось до 38,37 г/кг при внесении биопрепарата,
состоящей 8 нефтеокисляющих культур. Степень утилизации нефтяных углеводородов составила
83,1%.
88
Таблица 1 - Остаточное количество нефти в нефтезагрязненной почве с внесением композиции
из штаммов – деструкторов (почвогрунт)
Степень потребления
Контроль без внесения
Конечная
Начальная
нефти в почве, %
биопрепарата
концентрация
концентрация
углеводородов, г/кг
углеводородов, г/кг
сухой почвы
сухой почвы
почвогрунт
230,9±1,6
212,1±0,3
38,37±2,9
83,4
нефтешлам
119,5±0,9
105,1±1,3
23,02±1,9
80,8
Аналогичные модельные эксперименты проведены по очистке замазученных грунтов, жидких
отходов бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов на нефтешламе. Исходное содержание
углеводородных компонентов в нефтешламе составило 119,5 г/кг почвы. В результате
экспериментально лабораторных исследований установлено, что на 20 сутки окислению подверглось
до 80,7% нефти. Кроме того, более высокая эффективность применения 8 культур объясняется и
сложностью субстрата, каковым является нефтешлам, представляющей собой тяжелые нефтяные
остатки, содержащие в среднем (по массе) 10 – 56% нефтепродуктов, 30 – 85% воды, 1,3 – 46%
твердых примесей.
В почвогунте и нефтешламе с внесением биомассы композиции на двадцатые сутки были
выявлены морфологические колонии, идентичные внесенным штаммам. Установлено, что при
интродуцировании в почву нефтеокисляющих бактерий и дрожжей клетки сохраняли свою
жизнеспособность (рисунок 3).
Рисунок 3 – Колонии микроорганизмов на МПА, выделенные из почвогрунта и нефтешлама на 20
сутки после внесения препарата
Таким образом, результаты проведенных предварительных научных исследований позволяют
разработать дальнейшую технологию по обезвреживанию замазученных грунтов, жидких отходов
бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов полигона г. Уральска. Полученные результаты
имеют практическое значение для очистки нефтесодержащих объектов. На основе полученных
результатов исследований будет разработана технология по обезвреживанию замазученных грунтов,
жидких отходов бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов именно касающегося полигона
г.Уральска.
Изучение деструктивной активности биомассы композиции в полевых условиях.
Технология биологической очистки загрязненных нефтью грунтов и нефтешламов. Процесс
очистки начинается на площадке накопления нефтешламов. Визуально оценивалапсь степень
замазучивания грунта. Наблюдения за процессом очистки опытного полигона в условиях
экспериментального нефтяного загрязнения начались в 21 июне 2010 года. Полигон находится в 9 км
от западной части г. Уральска, по трассе Саратов-Уральск. Полигон предназначен для хранения и
утилизации нефтяных отходов и буровых шламов, привезенных из нефтяных месторождений и
организации, занимающихся добычей и переработкой нефти. Занимаемая площадь полигона примерно
3000 м2. Растительность скудная, представлена полынью и житняком. Климат умеренно-засушливый,
ветер северо-западный, скорость ветра 0,5 м/с, температура воздуха на период проведения очистных
мероприятий был в пределах от 480С до 54 0С.
В начале экспериментов были приготовлены 2 делянки площадью 200 м2, затем производили
боронование почвы, следующим этапом работы было внесение биопрепарата.
89
Визуально почвогрунт темного цвета, маслянистый, резкий запах мазута и нефтепродуктов. Надо
учесть тот факт, что почвогрунт и нефтешлам хранится в шламонакопителе в течение 1 года.
В почвогрунте исходное содержание нефти составило 750,7 г/кг почвы. Через 10 суток
содержание нефти понизилось до 364,3 г/кг почвы, утилизации подверглось до 51,4% нефти. Через 2,5
месяца после внесения биомассы композиции из нефтекисляющих микроорганизмов остаточное
количество нефти в почвогрунте составило 121,0 г/кг почвы, а процент утилизированной нефти
составил 86,3 %.
Первоначально в нефтешламе содержалось до 137,2 г/кг почвы нефтяных углеводородов. Темпы
разложения нефтяного загрязнения приходятся на начало
эксперимента. Максимум
углеводородокисляющей активности биомассы из нефтеокисляющих микроорганизмов пришелся на 10
сутки после начала эксперимента, вследствие чего и деструкции подверглось свыше 58,1% и
остаточное количество нефтяных углеводородов составило до 57,4 г/кг почвы. На 63 сутки количество
неподвергшейся деструкции нефти составило 16,8 г/кг почвы. А степень потребления нефти составила
87,5%. В контроле без внесения биомассы из нефтеокисляющих микроорганизмов понизилось на 3,9 %
от начального содержания. В течение всего времени проведения работ проводились аэрация и
орошение.
Таким образом, разработан регламент получения многокомпоненных композиции
нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки почвогрунтов и нефтешламов, а также и технология
очистки нефтезагрязненных почвогрунтов шламов. Предложенную технологию можно считать
крупномасштабной и достаточно эффективной. В микрополевых условиях на полигоне после внесение
биомассы новых композициий степень утилизации углеводородов на 20 сутки в почвогрунте и
нефтешламе составила до 83,1% и 80,7% соответственно.
1. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации // Биотехнология. –
2001. – № 2. – С.70 –76.
2. Карасёва Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алешина Н.Ю., Карасёв С.Г. Биоремедиация черноземной почвы,
загрязненной нефтью // Биотехнология. – 2005. - № 2. – С. 67-72.
3. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции
аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - №1. - С.42 – 50.
4. Патент 2805 Россия. Консорциум микроорганизмов «Devoroil», используемый для очистки почвенных и
солонцеватых экосистем от загрязнения нефтепродуктами /Борзенков И.А., Милехина Е.И. и др. - Опубл. 15.12.95; Бюл. №16.
5. Kilbone J., Daram A., Abbasian J., Kayser K.J. Isоlation and characterisation of Sphingomonas sp. GTIN11 capable of
carbosole metobolism in petroleum // Biochem. And Biophys. Res. Commun. - 2002. - Vol.297, № 2. - P.242-248.
6. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгеров А.Н., Иванов В.Н. Применение биопрепарата «Лестан» для очистки
почвы от углеводородов нефти // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т.32, №2. - С. 219-223.
7. Патент СССР 1805097. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н., Зиновьев А.П. Ягафаров И.Р. Штамм бактерий Rhodococcus
erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. 30.03.93.
8. Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж. Подбор питательной среды для приготовления
препаратов из нефтеокисляющих микроорганизмов //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - № 1 (31). – С.90-95.
9. Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж. Изучение новых штаммов
углеводородокисляющих микроорганизмов для биоремедиации почв // Международная научно-практическая конференция
«Современные проблемы экологии и устойчивое развития общества», Алматы, Казакстан, 30 сентября – 1 октября 2010 года.
Материалы. С. 223-226.
10. Бержанова Р.Ж., Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К. Оптимизация условий культивирования новых
композиций из углеводороокисляющих микроорганизмов //Вестник КазНУ серия биологическая №2 (48) часть 2, 2011. - С.
77-81.
***
В лабораторных исследованиях были установлены и подобраны основные параметры и условия культивирования
многокомпонентной композиции и разработан регламент получения многокомпонентных композиций нефтеокисляющих
микроорганизмов для очистки почвогрунтов и нефтешламов, а также технология очистки нефтезагрязненных
почвогрунтов шламов.
***
In laboratory studies were identified and selected key parameters and conditions of cultivation of multi-component
compositions and formulated rules for mnogokomponennyh compositing microorganisms to clean soil and oil sludge and oilcontaminated soil and sludge decontamination technology.
90
ƏОЖ 502/504.064.3:582.259
Г. Өнерхан1, Б.К. Заядан2, С. Билал
ЗЕРЕНДІ КӨЛІНЕН АЛЫНҒАН СУ ҮЛГІЛЕРІНЕ CHLORELLA SP-3K ШТАМЫН ӨСІРУ
АРҚЫЛЫ БИОТЕСТ ЖҮРГІЗГЕН НƏТИЖЕЛЕР
(1 Ш.Ш.Уəлиханов атындағы Көкшетау мемлекеттік университеті,
2
Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті)
Көкшетау өңірі көлдерінің су экожүйелерінен бөлініп алынған микробалдырлардың штамдарынан, табиғи суларда
тез өсетін жəне ластанған суларды тазалау қабілеті жоғары Chlorella sp-3K штамы сұрыптап алынып, осы штамм
көмегімен Зеренді көл суына биотестілеу жүргізілді. Биотестілеу нəтижесінде Зеренді көл суында Chlorella sp-3K
штамы клеткалар саны 16,8х106±0,5-ке дейiн өсіп, орташа улылықты көрсетті.
Табиғи суларды тазалаудың бірнеше əдістері бар, олар – механикалық, физикалық жəне
биологиялық əдістер. Соның ішінде ең тиімдісі биологиялық əдіс болып есептеледі. Бірақ та
биологиялық əдіс қазіргі уақытқа дейін бактериялар негізінде жүріп келеді. Сондай-ақ тазалау
негізінде балдырлар мен жоғары сатыдағы өсімдіктердің рөлі зор. Соның ішінде балдырлармен тиімді
тазалау қолға алынып жатыр. Олар автотрофты организмдер ретінде фотосинтез кезінде су
ортасындағы қоспалардың минералдануын жылдамдатады [1].
Көптеген балдырлар мен су макрофиттері тек минералдық заттармен ғана емес, сонымен қатар
жай органикалық қосылыстармен де қоректенеді. Олар белсенді түрде азот ионын, фосфор мен басқа
да биогенді заттарды сіңіреді. Құрамында 40-50мг/л азоты бар қоректік ерітіндідегі хлорелла мен
сценедесмус 5-7 тəулік ішінде басқа бактерияларды толығымен жояды екен. Протококты балдырлар
мен көптеген жоғары сатыдағы өсімдіктердің бактериоциттік қасиеті бар. Оларды ағын суға қосқанда
жұқпалы микроорганизмдер жойылады. Ал хлорелла мен сценедесмустың антибактериялық қасиеті
жоғары, олар тырысқақ, оба, туберкулез, ішек жəне т.б. ауру туғызатын микробтарға кері əсері бар
[2,3].
Балдырлардың биомассасымен байытылған ағын суларды жер суғаруға пайдаланады. Хлорелла,
сценедесмус, анкистродесмус жəне т.б. протококты балдырлар ауыл шаруашылық өсімдіктеріне
бағалы биостимулятор болып табылады. Олар жерді витаминдермен, амин қышқылдарымен байытады
жəне ондағы органикалық заттардың құрамын жоғарылатады. Хлорелла мен сценедесмус жəне т.б.
балдырлардың суспензиясын ретімен пайдаланып, жерді суарып отырса, күріш, жуа жəне мақта
өсімдігі (20-25 пайызға) жəне т.б. ауыл шаруашылық дақылдарының өнімділігі жоғарылайды [4,5,6].
Табиғи жəне жасанды суайдындарына улы заттардың түсуінен экожүйе бұзылу процестерге
ұшырайды. Экотоксиканттар немесе улы заттарға ауыр металл қосылыстары (сынап, қалайы, мыс,
мырыш, қорғасын жəне хром металдары), хлорорганикалық, күкіртті органикалық заттар, пестицидтер,
мұнай жəне мұнай өнімдері, синтездік белсенді заттар, қышқылдар, фенолдар жəне т.б. қосылыстар
жатады [3].
Қазіргі кезде суайдындарының улылығын жедел анықтайтын тəсіл ретінде биотестілеу
əдістемесі, яғни улы заттардың зияндылық дəрежесін көрсететін биологиялық тест-организмдер
қолданылады. Зертханалық тəжірибе жағдайындағы судың сапасын анықтауда тест–организмдердің
тіршілігі, көбею жылдамдығы, тіршілік процестерінің қарқындылығы (тыныс алу, асқорыту,
фотосинтез) қимыл əрекеттік реакциялары сияқты көрсеткіштер есепке алынады. Бұл тəжірибелер
улылығы жоғары, тез əсер ететін химиялық заттарды анықтауға бағытталған [7].
Тест-организмдерді таңдауда бірнеше шарттар орындалуы тиіс. Олардың көлемі өте ірі емес,
өсуі күрделі емес, тіршілік циклі қысқа жəне улы заттарға сезімталдығы жоғары жəне орташа деңгейде
болуы қажет [8].
ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ МЕН ƏДІСТЕРІ
Биологиялық модельдi нысандарды пайдалану нəтижесiнде гидросфераға биотест жүргiзу
биология ғылымында кеңiнен таралған тəсiлдердiң бiрi. Əр түрлi химиялық қосылыстардың
уыттылығын бағалауда, су ортасын биотестiлеу процесiнде осы уытты заттардың əсерiн сезiне алатын
тiрi организмдер қолданылады. Соңғы жылдары су экожүйелерiндегi антропогендiк факторларды
зерттеуге Chlorella, Chlamydomonas, Scenedesmus туыстарын пайдалануда [4,7,8].
Жұмыста тестілеу жүргiзiлген судағы улы заттардың əсерiнен балдырлардың көбею
қарқындылығының өзгеруiн бақылау суымен салыстыра отырып анықтауға негiзделген биотестілеу
əдістемесі қолданылды. Қарқынды көбеюдiң көрсеткiшi – балдырлар клеткаларының өсiм санының
коэффициентi болып табылады.
Улылықтың белгiсi бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлетін судағы клеткалардың өсiм
91
санының коэффициенттерiнiң төмендеуi болып келедi. Қысқа мерзiмдi биотестілеу – 96 сағат
iшiнде балдырларға тест жүргiзілетін судағы өте улы əсердiң барын, ал ұзақ – 14 тəулiк ішінде
созылмалы улы əсерді анықтауға мүмкiндiк бередi.
Тест нысаны ретінде арнайы бөлініп алынған микробалдыр Chlorella sp-3K
штамы
пайдаланылды. Балдырлардың дақылын қоректiк ортасы бар залалсыздандырылған
колбаға ашық
жасыл түс беретiн мөлшерде енгiздік. Балдырлар дақыл бетiнен 30-40 см қашықтықта орналасқан
күндiзгi жарық шамдарында тəулiк бойы жарық түсiру кезiнде өсiріледi, жарықтану 2000-3000 л/к.
Егу үшiн экспоненциалды өсу сатысында 5-7 тəулiктiк балдырлардың дақылы пайдаланылды.
Биобақылау жүргiзу алдында оны төртiншi нөмірлі мембрандық сүзгiш немесе сүзгiштiк қағаз
арқылы Зейтц аппаратының көмегiмен қоюлатады. Клеткаларды дақылды тұндырудан кейiн
колбадан ортаны сорып алумен шоғырландыруға болады.
Балдырлар сүзгiштен 30-50 мл бақылау суы бар колбаларға көшiрiледi. Егу үшiн
қолданылатын клеткалардың сұйықтық санын тексередi. Сұйықтықта клетка саны 5-10 млн.кл/мл
болу керек [8].
Колбаларды мақта-дəкелi тығындармен тығындайды, оларды жақсылап араластырады жəне
əр колбадағы клеткалар санын анықтайды. Клеткалар санын санау үшiн Горяевтің есеп камерасы
пайдаланылды. Олардың саны 25-50 000 кл/мл болу керек. Колбаларды люминостатқа немесе тiк
түсетiн күн сəулелерiнен қорғаланатын, жақсы жарықтанған жерге қояды. Биотестілеу жарықта жəне
қолайлы температурада жүргiзiледi. Биотестілеу 96 сағаттан кейiн аяқталады. Суда өте улы əсердiң
бар -жоғын анықтау үшiн, əр колбадан клеткалардың санын санайды. Өте улы əсер болмаған
жағдайда биотестілеу жалғастырылады. Жетiншi тəулiкте бақылау жəне тест жүргiзiлген суды жаңа
алынған суға ауыстыру жасалады [9].
Алғашқы 7 тəулiк бойы биотестілеу жүргiзiлген колбалардың құрамын жақсылап
араластырады. Резинкалы грушасы бар пипеткамен əр колбадан 25 мл-ден алып, жаңадан
дайындалған ерiтiндiлерге құйып араластырады. Əрi қарай əр колбадағы клеткалар санын
анықтайды. Кейiн тағы 7 тəулiк бойы биотестілеу жалғастырылады. 14-тəулiктен кейiн тест
жүргiзiлген су балдырларға созылмалы улылық əсерді көрсете ме, жоқ па дегенді анықтайды.
Бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлген судағы клеткалар өсiм саны коэффициентінің
төмендеуі тест жүргiзiлген суда балдырларға өте немесе созылмалы улылық əсердiң бар екендігін
көрсетедi [10].
НƏТИЖЕЛЕР МЕН ТАЛҚЫЛАУЛАР
Зеренді көлі Көкшетау қыратының тау аралық ойысында, Ақмола облысы Зеренді ауданының
солтүстік шығысында, «Көкшетау» мемлекеттік ұлттық табиғи саябағы аумағында орналасқан.
Көл Көкшетау қаласынан 50 шақырым жерде орналасқан. Көл теңіз деңгейінен 370,4 метр
абсолютті биіктікте жатыр. Су жинау бассейні – 97,7 км2. Көлдің батыс жағы төбешікті, ал оңтүстікшығыс жəне солтүстік жағалаулары жадағай тегіс болып келеді. Суайдынының оңтүстік-батыс бөлігі
қайың, қарағайлы орманмен көмкерілген. Қалған бөліктері далалы, егістікті жерлерге ұласады. Көлдің
ұзындығы – 6 км, ені – 2,5 км, ауданы орташа есеппен – 1070 га, максималды тереңдігі 6,5 м-ге тең.
Көл жағалауының ұзындығы 21,3 км. Көл беті негізінен ашық, жағаға жақын жерлерін қамыс басқан.
Көл түбі тегіс, лайлы, жағалаулары құмды, қиыршық тас пен қойтасты. Көл - ағынсыз. Көлге оңтүстік
жағалау тұсынан ұзындықтары 0,3-1,5 км болатын мезгілдік сипаттағы суағарлар келіп құйылады. Бұл
тек көктем айларында бірнеше күнде немесе қатты сел, жаңбыр жауған күндері болады. Көл суы
тұрмыстық-шаруашылық мақсаттарда қолданылады. Зеренді көлінің жағалауында демалыс базалары,
демалыс лагерьлері, сауықтыру-шипажайлары жəне қысқа мерзімді демалыс орындары бар[11] .
Табиғи суларға бейімделген микробалдырларды зертхана жағдайында өсіріп, оларды келешекте
су тазалау жүйесіне қолдану мақсатында Көкшетау өңірі көлдерінен су сапасын анықтауда маңызды
нысан болатын Chlamydomonas reinhardtii var reinhardtii Dang., Chlorella vulgaris var vulgaris
Beijerinck., Chlorella sp., Scenedesmus obliquus, Euglena viridis Ehr, Spirulina major, Phormidium
foveolarum, Osсillatoria tenuis жəне Ankistrodesmus falcatus var radiatus микробалдырлар түрлері
бөлініп алынып, сипаттама берілді. Көкшетау өңірі көлдерінің су экожүйелерінен бөлініп алынған осы
микробалдырлардың штамдарынан, табиғи суларда тез өсетін жəне ластанған суларды тазалау қабілеті
жоғары түрлері сұрыпталды. Нəтижесінде зерттеуге алынған микробалдырлар арасынан Chlorella sp3K штамы белсенділік көрсетті [12].
Chlorella sp-3K штамының əр түрлі су үлгілерінде жақсы өсіп, жоғары нəтиже беретіндігі басқа
да зерттеулер мен əдебиеттерде келтірілген [13].
Біздің Chlorella sp-3K штамының өнімділігін тексеріп, сұрыптаудағы мақсатымыз Зеренді
көлінен алынған су үлгілеріне осы штамм көмегімен биотестілеу жүргізу болып табылады. Зерттеу
92
əдісінде тест жүргізілетін судағы улы заттардың əсерінен микробалдырлардың көбею
қарқындылығының өзгерісін бақылауымен салыстыра отырып есепке алатын биотестілеу əдісі
қолданылды. Бұл бiр клеткалы микробалдырды биотестілеуге қолданудың негiзгi артықшылығы оның
зертханалық жағдайда көптеген ұрпақтар бойы клетка популяциясын бақылауға мүмкiндiк беретiн
жоғарғы көбею жылдамдығы болып саналады.
Chlorella sp-3K микробалдыры жүйелiк қатынасы бойынша Chlorophyta бөлiмiнiң
Protococcophyceae класының Chlorococcales қатарының Chlorellaceae тұқымдасының Chlorella
туысының өкiлi.
Клеткалары пиреноидты, бірақ байқалмайды. Chlorella vulgaris-ке қарағанда клеткалары кішірек,
диаметрi 2-3,5 мк. Клеткалары көбейер алдында 7,5-8мк дейiн үлкейедi. Негiзгi қоректiк ортасы
стандартты 04 қоректiк ортасы (сурет 1).
Сурет 1 – Chlorella sp-3K.
Зеренді көліне биотестілеу жүргізу үшін бақылау жəне тəжірибеге арналған қоректік орталары
жəне Chlorella sp-3K штамы пайдаланылды.
Одан кейін оған тест-организм Chlorella sp-3K штамы енгізілді. Клеткалардың өсу динамикасы 8
күн бойы зерттелініп, алынған мəліметтерге салыстырмалы анализ жасалынды. Таза бақылау суы мен
көл суларының дақылдық ортасын дайындау үшін клеткалардың қоректенуіне қажетті минералды
тұздар 04 стандартты қоректік ортасына сəйкес келетін мөлшерде қосылды.
Таза су жəне көл суларына 04 стандартты жасанды қоректiк ортаға сəйкес келетін минералды
тұздарды қосу арқылы Chlorella sp-3K
штамын 8 күн өсiрiп, олардың клеткаларының өсу
динамикасына зерттеу жүргiздiк. Зерттеу жұмысына көл суларының 2 түрлi нұсқасы алынды. 1нұсқаға 2 есе сұйылтылған көл сулары, ал 2-нұсқаға алғашқы алынған көл суы сынамасы өзгертiлмей
алынды. Енгізілген хлорелла клеткасының санын барлық нұсқаларда бірдей 5х106±0,6 мл болғыздық.
Клеткалардың өсу динамикасы 8 күн бойы бақыланғанда таза бақылау суындағы Chlorella sp-3K
штамының клеткалар саны 4 тəулiкте 23 х106±0,65 өскенi анықталды. 2 есе сұйылтылған 1 нұсқадағы
көл суында Chlorella sp-3K штамы клеткалар саны алғашқы 4-тəулiкте 1 мл-де 19,5х106±0,45 дейiн өсті
де, келесi тəулiктерде өсуi байқалмады. Ал алғашқы алынған көл суы сынамасы өзгертiлмей алынған
2 нұсқада клеткалар саны алғашқы 4-тəулiкте 1 мл-де 16,8х106±0,5 дейiн өсті де, келесi тəулiктерде
өсуi байқалмады (кесте 1).
Кесте 1 – Зеренді көлінің суына биотестілеу жүргізгендегі Chlorella sp-3K клеткасының өсуі
Тəулік бойынша 1 мл-дегі клетка саны
Сынамалар
0
2
4
6
8
Бақылау
5х106±0,25
19,2 х106±0,6
23 х106±0,65
22,5 х106±0,55
22 х106±0,54
1-нұсқа
5 х106±0,3
13,8 х106±0,36
19,5 х106±0,45
18,4 х106±0,5
16,3 х106±0,48
2-нұсқа
5 х106±0,3
10,4 х106±0,35
16,8 х106±0,5
15,1 х106±0,49
13,2 х106±0,46
Зеренді көлінің суын Chlorella sp-3K штамының көмегімен биотестілегендегі клеткалардың өсу
динамикасы 2- суретте көрсетiлдi.
Бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлген суда хлорелла клеткаларының өсiм саны төмендеу
болды. Себебі Зеренді көлінде Chlorella sp-3K
штамының өсуіне кедергі келтіретін фторид,
сульфаттардың ШРМ-нен артық мөлшерлері бар.
93
30
Клетка
саны, млн/мл
20
10
Бақылау
1 нұсқа
0
0
4
Тəулік 8
Сурет 2 – Зеренді көлі су сынамасы жəне бақылаудағы Chlorella sp-3K штамының өсу динамикасы
Биотестілеу жүргізген зерттеу нəтижесінде Chlorella sp-3K штамы Зеренді көліндегі улы заттар
концентрациясына орташа сезімтал екені анықталды.
Зерттеулерден байқағанымыздай табиғи суларға микробалдырлар көмегімен биотест жүргізу
жылдам, əрі тез жəне химиялық зерттеулер нəтижесін толықтыратындығы анықталды.
1. Унифицированные методы исследования качества вод // Методы биологического анализа воды. Приложение І.
Индикаторы сапробности. – М.: СЭВ, 1977. – С. 11-42.
2. Унифицированные методы исследования качества воды // Методы биологического анализа воды. Приложение
3. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. – Черноголовка,
1988. – С. 4-14.
4. Музафаров А.М., Таубаев Т.Т., Методы массового культивирования и применения хлореллы. – Ташкент: Фан, 1974.
– 120 с.
5. Шаланки Я. Биомониторинг природной среды. // Журн.общ. биол. –1985. – Т.46, №6. – С. 743-752
6. Таубаев Т.Т. Хлорелла. – Ташкент: Фан, 1980. – 150 с.
7. Биоиндикация и биотестирование природных вод. // Тез. Докл. Всесс. конф. – Ростов, 1986. – С. 198.
8. Заядан Б.К., Су экожүйелерiне биологиялық тест жүргiзуге жасыл балдыр Chlorella sp-1 табиғи түрiн пайдаланудың
маңызы // Вестник КазГУ, Серия экологии. – 2001. – №2. – Б. 25-29.
9. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Под ред. Р. Шуберт. – М.: Мир, 1988. – С. 324.
10. Шорабаев Е.Ж., Болатхан Б.К. Өндірістік қалдық суларды жасыл балдырлар көмегімен биобақылау жəне тазарту.
// ҚазМАУ нəтижелер, ізденістер. – 1999. – №4. – Б. 183-186.
11. Ақмола облысының су қоры: Ақмола облыстық қоршаған ортаны қорғау туралы материалдар. – Көкшетау, 2008.
– 105 б.
12. Өнерхан Г. Көкшетау өңірі көлдерінің экологиялық жағдайын
альгофлора көмегімен бағалау: биол. ғылым. канд. ... дисс. –Алматы, 2010. – 112 б.
13. Заядан Б.К. Роль фототрофных микроорганизмов в мониторинге, функционировании и ремедиации водных
экосистем: автореф. … д-ра биол. наук. – Алматы, 2006. – 38 с.
***
В работе проведено биотестирование озер по штамму Chlorella sp-3K выделенного с водных экосистем озер
Кокшетауского региона, который отличается быстрой размножаемостью и очищающей способностью загрязнений
природных вод. В результате биотестирования, выявлено, что воды озера Зеренда средний уровень токсичности: рост клеток
средний 16,8±0,5 млн/мл.
***
Respective was biotesting lakes on cultures of microseaweed allocated with water ecosystem of lakes Кокshetau region is
carried out is especial on strain Chlorella sp-3K, distinguished fast duplicate and clearing ability of pollution of natural waters. As a
result of biotesting, is revealed, that waters of lake Zerenda an average level toxicity: growth of crates average 16,8±0,5 mln/ml.
УДК: 579:576.6
Ратникова И.А., Н.Н. Гаврилова Н.Н., Л.П. Треножникова, К. Баякышова, А.Х. Хасенова
УСТОЙЧИВОСТЬ К ЖЕЛЧИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ, ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И
ИХ АССОЦИАЦИЙ, АДАПТИРОВАННЫХ К НИЗКОМУ ЗНАЧЕНИЮ РН
(РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК, e-mail: [email protected])
Исследованные штаммы молочнокислых бактерий являются более чувствительными к желчи, чем к низкому
значению рН. Наиболее чувствительными к желчи оказались культуры L. plantarum 22, L. brevis Б-3 , L. plantarum 2в и 14д.
Адаптированные к низкому значению рН культуры L. brevis Б-3 и L. plantarum 22 стали более устойчивыми к желчи по
сравнению с исходными. Наиболее устойчивыми к желчи являются культуры L. fermentum 27 и P. shermanii.
Непременным условием для получения эффективных пробиотиков является использование
штаммов с высокой антимикробной активностью к наиболее часто встречающимся возбудителям
заболеваний, доминирующим в данном регионе. Кроме того, в необходимых случаях для усиления
лечебного действия в отношении определенных возбудителей заболеваний должна проводиться
коррекция микробного состава препарата. Для этого надо иметь в резерве штаммы с высокой
94
S. gallinarum
S. aureus № 9
S. aureus № 3316
K. pneumoniae 444
C. albicans
Mycobacterim B5
2
4,1
3
12,0
4
13,0
5
14,0
6
13,5
7
12,0
8
1,0
9
23,0
10
27,0
11
5,3х108
6,3
4,2
0
10,5
0
13,0
0
15,5
0
12,5
0
13,0
0
9,0
0
23,0
12,0
2,0
9,0х10 3
1,2х10 9
5,6
0
0
0
0
0
0
13,0
15,0
5,2х10 6
6,5
0
0
0
0
0
0
12,0
0
3,0х10 3
4,1
12,5
12,5
15,0
12,0
17,0
10,0
20,0
27,5
6,3х10 8
6,1
0
0
0
0
0
0
0
11,0
9,0х10 3
4,1
11,0
11,5
15,0
11,0
16,0
0
23,0
24,0
6,6х10 8
4,12
20
10,0
0
17,0
0
22,0
10,0
29,0
1,5х10 9
Варианты опыта
рН
1
Б3, исходная
контроль
Б3 исходная опыт
Б3 адаптированная
контроль
Б3 адаптированная
опыт
14д исходная
опыт
14д исходная
контроль
14д
адаптированная
опыт
14д
адаптированная
контроль
2в адаптированная
контроль
95
P. multocida
E. coli
антимикробной активностью к различным возбудителям заболеваний. Штаммы микроорганизмов,
входящие в состав пробиотиков, должны обладать также адгезивными и ростовыми свойствами,
которые позволят им быстро колонизировать слизистую поверхность желудочно-кишечного тракта.
Резистентность бактериальных клеток к реактогенной среде желудка и верхних отделов
кишечника также является необходимым условием выживания пробиотических микроорганизмов. При
этом основными факторами, губительно действующими на пробиотические микроорганизмы,
являются низкое значение рН и желчные кислоты [1,2].
Материалы и методы
Культуры молочнокислых бактерий L. plantarum 2в, 22, 14д, L. fermentum 127 и 27, L. brevis Б-3 и
пропионовокислых бактерий P. shermanii , исходные и адаптированные к низким значениям рН,
выращивали в течение 18 ч при температуре 370С в жидкой питательной среде MRS [3], содержащей
3% бычьей желчи. Затем в них определяли количество жизнеспособных бактерий путем высева из
соответствующих разведений в чашки Петри на твердую питательную среду MRS а также
антагонистическую активность методом диффузии в агар в отношении тест-культур: Escherichia coli,
Salmonella, gallinarum, Staphylococcus aureus № 9, Staphylococcus aureus № 3316, Klebsiella pneumoniae
444, Cadida albicans, Mycobacterim B5 [4]. Каталазную активность пропионовокислых бактерий
устанавливали по интенсивности разложения культурой перекиси водорода. В таблице представлены
средние результаты не менее чем из трех повторностей. Контролем служили те же культуры
молочнокислых и пропионовокислых бактерий, выращенные в исходной среде MRS без желчи.
Результаты и их обсуждение
В предыдущих исследованиях нами проведена адаптация молочнокислых и пропионовокислых
бактерий к рН 3. Целью настоящих исследований было изучение устойчивости к желчи у исходных и
адаптированных к низкому значению рН молочнокислых и пропионовокислых бактерий, входящих в
состав разработанных нами пробиотиков.
Результаты опыта представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Содержание бактериальных клеток и антагонистическая активность молочнокислых
бактерий при росте в питательной среде с 3% желчи
Тест-культуры, мм
Титр,
КОЕ/мл
2в адаптированная 5,59 10,0
0
0
0
0
0
0
11,0
3,2х10 5
опыт
2в исходная
4,22 15,5
0
0
12,0
0
16,0
0
19,0
2,0х10 9
контроль
2в исходная опыт 5,80
9,5
0
0
0
0
0
0
0
1,0х10 5
22 исходная
4,26 19,0
0
0
11,0
0
16,5
0
19,0
2,0х10 9
контроль
22 исходная опыт 6,20
0
0
0
0
0
0
0
0
2х10 3
22
4,10 23,0 11,0
0
10,0
0
22,0
0
28,0
3,4х10 8
адаптированная
контроль
22
5,88
0
0
0
0
0
0
0
11,0
2,0х10 7
адаптированная
опыт
27 исходная
4,66 20,0 10,0 10,0 14,0 10,0 18,5 10,0 20,0
3,8х10 9
контроль
27 исходная опыт 5,37
0
0
0
0
0
11,5
0
12,0
2,7х10 8
27
4,36 10,0 10,0 10,0 14,0 10,0 17,0 13,0 23,0
2,0х109
адаптированная
контроль
27
5,76
0
0
0
0
0
11,0
0
0
1,6х108
адаптированная
опыт
127 исходная
4,14 12,0
9,0
10,0 11,0
10
20,0 13,0 27,0
2,0х109
контроль
127 исходная
5,42
0
0
0
0
0
0
0
12,0
9,6х10 6
опыт
127
4,21 10,0 10,0 10,0 12,0 10,0 10,0 12,0 23,0
3,4х10 9
адаптированная
контроль
127
6,13
0
0
0
0
0
0
0
16,0
8,9х10 6
адаптированная
опыт
Установлено, что под воздействием желчи существенных изменений в морфологии колоний
молочнокислых и пропионовокислых бактерий исследованных штаммов не происходит. Как видно из
представленной таблицы, адаптированная к низким значениям рН культура L. brevis Б-3 имеет более
высокий титр бактериальных клеток по сравнению с исходной (1,2х109 против 5,3х108). При росте в
питательной среде с желчью снижение титра бактерий у исходной культуры произошло на 5 порядков
(9,0х103 против 5,3х108 в контроле), а у адаптированной – на 3 (5,2х106 против 1,2х109 в контроле). В
контроле исходная и адаптированная культуры L. brevis Б-3 обладали антагонистической активностью
ко всем испытанным тест-культурам. При выращивании культур молочнокислых бактерий в
питательной среде с желчью антагонистическая активность выявлена лишь в отношении Mycobacterim
B5 и С. аlbicans.
В контроле исходная культура L. plantarum 2в имела титр молочнокислых бактерий 2х109
КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН – 1,5х109 КОЕ/мл. После выращивания в питательной
среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 4 порядка и составило у исходной
культуры 1,0х105 КОЕ/мл, у адаптированной – 3,2х105 КОЕ/мл. В контроле адаптированная к низким
значениям рН культура L. plantarum 2в превосходила исходную по антагонистической активности. В
отличие от исходной культуры, она обладала активностью в отношении клинического штамма
стафилококка MRSA №3316 и S. gallinarum, а в отношении остальных тест-культур (E. сoli,
P.multocida, Mycobacterim B5) зоны подавления роста были больше на 5-10 мм. При выращивании
культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность
выявлена только к E. coli и Mycobacterim B5.
Исходная культура L. plantarum 22 в контроле содержала жизнеспособных клеток 2,0х109
КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН - 3,4х108 КОЕ/мл. После выращивания в питательной
среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 6 порядков и составило у исходной
96
культуры 2х103 КОЕ/мл. У адаптированной культуры снижение титра бактерий произошло на 1
порядок (2,0х107 КОЕ/мл). В контроле адаптированная к низким значениям рН культура L. plantarum
22 также превосходила исходную по антагонистической активности. При выращивании культур
молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность сохранилась
только к Mycobacterim B5.
Исходная культура L. fermentum 27 в контроле имела титр молочнокислых бактерий 3,8х109
КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН – 2,0х109 КОЕ/мл. При выращивании в питательной
среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 1 порядок и составило у исходной
культуры 2,7х108 КОЕ/мл, у адаптированной – 1,6х108 КОЕ/мл. В контроле исходная и адаптированная
культуры L. fermentum 27 обладали антагонистической активностью ко всем испытанным тесткультурам. При выращивании культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью
антагонистическая активность выявлена в отношении P. multocida и Mycobacterim B5.
При выращивании в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток L.
fermentum 127 было ниже на 3 порядка и составило у исходной культуры 9,6х10 6 КОЕ/мл, у
адаптированной - 8,9х106 КОЕ/мл по сравнению с 2,0х109 с 3,4х109 в контроле, соответственно. В
контроле исходная и адаптированная культуры L. fermentum 127
обладали антагонистической
активностью ко всем испытанным тест-культурам. При выращивании культур в питательной среде с
желчью антагонистическая активность выявлена только к Mycobacterim B5.
Исходная культура P. shermanii в контроле содержала жизнеспособных клеток 2,5х1010 КОЕ/мл,
адаптированная – 6,5 х1010 КОЕ/мл. При выращивании в питательной среде с 3% желчи содержание
бактериальных клеток было ниже на 2 порядка и составило у исходной культуры 1,0х108 КОЕ/мл, у
адаптированной – 8,0х108 КОЕ/мл. Данная культура восстанавливает титр клеток и антагонистическую
активность после пассажа в питательную среду без желчи.
Таким образом, исследованные штаммы молочнокислых бактерий являются более
чувствительными к желчи, чем к низкому значению рН. Наиболее чувствительными к желчи оказались
культуры L. plantarum 22 (снижение титра произошло на 6 порядков), культур L. brevis Б-3 (на 5
порядков), L. plantarum 2в и 14д (на 4 порядка). Адаптированные к низкому значению рН культуры L.
brevis Б-3 и L. plantarum 22 оказались более устойчивыми к желчи по сравнению с исходными на 2 и 5
порядков, соответственно. Наиболее устойчивыми к желчи (снижение титра бактерий на 1 порядок)
являются культуры L. fermentum 27 и P. shermanii.
1 Ху Yю-gang, et.al. Изучение характеристик жизнеспособности рекомбинантного Lactobacillus casei 393 в
искусственных желудочно-кишечных средах // J. Microecol. - 2006.- N 6. - С.423-426.
2 Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л. и др. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста
условиям // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - T. 42. - № 2. - С. 317-335.
3 Ратникова И.А. Исследование микроорганизмов на способность к антиинтерфероновой активности // Известия АН
РК, сер. мед. и биол. – 2000. – № 1. – С. 78-80.
4 Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Наука, 1986. – 273 с.
***
Сүт қышқылды бактерияларының зерттеліп отырған штамдары рН төменгі мəніне қарағанда, өт қышқылына сезімтал
келеді. L. plantarum 22, L. brevis Б-3 , L. plantarum 2в жəне 14д культуралары өт қышқылына едəуір сезімтал болса,
бейімделген культуралар рН-тың төменгі мəніне сезімтал. L. brevis Б-3 жəне L. plantarum 22 культуралары бастапқы
штамдармен салыстырғанда, өт қышқылына төзімдірек келеді. L. fermentum 27 жəне P. shermani культуралары өт қышқылына
жоғары төзімді болып келеді.
***
The investigated strains of lactic acid bacteria are more sensitive to bile than in a low pH value. Most sensitive
to bile cultures were L. plantarum 22, L. brevis B-3, L. plantarum 2b, and 14d. Adapted to the low pH value of culture L. brevis B3 and L. plantarum 22 were more resistant to bile compared with baseline. The most resistant to bile cultures are L. fermentum 27 and
P. shermanii.
У.З. Сагындыков1, Ж. Мамырбекова2, Х.Х. Макажанова1, С.С. Губарева 3
ТҮЙЕ СҮТІ НЕГІЗІНДЕГІ ҚҰРҒАҚ БИОЛОГИЯЛЫҚ БЕЛСЕНДІ ҚОСПАНЫҢ
САПАЛЫҚ МІНЕЗДЕМЕСІ
(Алматы технологиялық университеті1, əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті2; Қазақ
өңдеу жəне тамақ өнеркəсібі ғылыми-зерттеу институты3)
Бұл жұмыста түйе сүтінің негізінде құрғақ биологиялық белсенді қоспаны кептіру тəсілдері мен олардың сапалық
көрсеткіштері зерттелген.
Қазақ халқын түрлі тағамдармен қамтамасыз етуде бие жəне түйе сүттерінің негізінде жасалған
ұлттық қышқыл сүт өнімдерінің алатын орны ерекше. Жылқы жəне түйе шаруашылығы дамыған,
97
Титрлік
қышқылдылығы, Т°
Аминді азот, %
Сүт
қышқылы, %
Сқб саны
Лактоза, мг/00мл
ұлттық дəстүрге айналған Қазақстандық ферменттелген өнімдерді өндіру жақсы дамыған. Қазақ
ғалымдары М.Х. Шығаева, Т.Ш. Шарманов, М.Г. Саубенова, С.З. Сағындықова қымыз бен шұбаттың
тағамдық жəне биологиялық бағалылығын анықтап, өнімнің негізін құрайтын сүт қышқылы
бактерияларының қауымдастықтарынан жəне ашытқы саңырауқұлақтардан жасалған құрама
ашытқылар мен қышқыл сүт тағамдарының сапасы жəне аурудың алдын алу қасиеттері бар, ұлттық
қышқыл сүт тағамдарын алуды зерттеген.
Қазіргі кезде қышқылсүт өнімдерін өндіруде қолданылатын ашытқылар, жақын жəне алыста
орналасқан елдерден алынады. Бірақ бұлардың қауіпсіздік көрсеткіштері жөнінен сипаттамалары мен
толық құжаттар көбінесе жоқ болып шығатын кездері жиі кездеседі. Осыған орай Қазақстандағы шикі
сүтті өңдейтін əртүрлі аймақтарда, табиғи көздерден бөлініп алынған микроорганизмдердің жаңа
штамдары негізінде, қышқыл сүт тағамдарын өндіру үшін микроорганизмдердің белсенді
штамдарынан композициялар жəне консорциумдардан отандық ашытқылар жасау қажеттілігі туындап
отыр.
Республиканың əртүрлі аймақтарында өндірілетін сүт тағамдарының микробиологиялық
құрамын зерттеу, сүттің кенеттен ашуына жауапты микроорганимздердің басымдылық көрсететін
топтарын анықтау, сүт қышқылы бактерияларының таралуы жөнінен мəліметтерді көбейтудің жəне
ашытқы жасауда биологиялық жаңа дақылдарды сұрыптап алудың маңызы зор [1-4].
Бізбен лиофилды жəне шашыратпа əдістерімен 3 жəне 6 айдан кейін сақтау барысында құрғақ
биологиялық белсенді қоспаның салыстырмалы бағалауын (кесте) (сүтқышқылы мен
бифидобактериялардың сандық құрамы, сүт қышқылы, нəруыз, амин азоты, лактоза жəне С дəруменнің
құрамы) жалпыға мəлім əдістермен жүргіздік [5-7].
Барлық препараттар құрғақ, қараңғы жерде +8-10ºС температурада сақталды. Тəжірибе
жағдайында лиофилды жолмен кептірілген препараттың рН-ы жəне титрлік қышқылы шашыратпа
кептіргеннен аз ғана айырмашылық болды, жасуша титрі кептіру əдісінен айырмашылығы болмады.
Кесте 1 – Құрғақ биологиялық белсенді қоспаның сапалық көрсеткіштерін салыстырмалы бағалау
Bif
Шашыратпа
1010
1010
0,223
8,7±0,2
3,0±0,1
12,2±0,2
7,65±1,2
Сублимациялық
1012
1012
0,263
8,0±0,1
2,8±0,2
8,8±0,2
12,15±0,9 35±4
С дəрумені,
мг/100мл
MRS
нəруыз, %
Кептіру
əдістері
29±2
Зерттеу барысында шашыратпа жəне сублимациялық кептіру барысында сүтқышқыл
бактерияларының, сүт қышқылының, нəруыздың құрамы бірдей болды, дегенмен сублимациялық
жолмен кептіргенде С дəрумені қоспада көбірек болды деген тұжырымға келдік.
1 Шарманов Т.Ш. Новые направления в создании здоровой пищи //Пищевая и перерабатывающая
промышленность. - 2000. - №2. - С.20-21.
2 Шығаева М.Х., Қасымбекова С.К. жəне басқалар. Қазақстанның əр түрлі облыстарының шұбат
үлгілерінен бөлініп алынған лактобацилдер // Жаршы. – 2002. - №9.- С.25-28.
3 Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Никитина Е.Т., Байжомартова М.М. Перспективы повышения
качества и лечебно-профилактических свойств шубата // Вестник КазНУ. Сер.Биол. – 2002. - №1. - С.23-28.
4 Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Нурумбетова Б.К. Ассоциация молочнокислых бактерий и дрожжей
для сбраживания кобыльего молока // Вестник КазНУ. Сер.биол. - 2001. - №1(13). - С.75-78.
98
5 Нармуратова М.Х., Конуспаева Г.С., Иващенко А.Т., Луазо Ж., Файе Б. Изучение физико – химического
состава верблюжьего молока ЮКО// Вестник серия биологическая. - Алматы. - №1 (36), 2008. - С.176-181.
6 Филиппович Ю.Б. «Практикум по общей биохомии». – М. - 1975г. - С.75-76
7 Г.Н.Грусь, А.М. Шалыгина, З.В.Волокитина. Методы исследования молока и молочных продуктов. – М. 2000. – 250 с.
У.З. Сагындыков1, З.А. Кожахметова2, М.Ж. Мустафаева1
ВЛИЯНИЕ ФИТОНЦИДОВ БОРЩЕВИКА СОСНОВСКОГО НА МИКРОФЛОРУ
СМЕШАННЫХ СИЛОСОВ
(Алматинский технологический университет1, Казахский аграрный университет2)
В настоящей работе изучено влияние фитонцидов борщевика Сосновского на микрофлору смешанных силосов. В
смешанном силосе применялись как выделенные, так и известные штаммы молочнокислых бактерий.
Молочнокислое брожение издавна находит применение в ряде отраслей пищевой
промышленности и сельского хозяйства, преимущественно в целях сохранения некоторых видов
пищевых продуктов, в том числе и силоса. Обеспечивается это благодаря молочнокислым бактериям, в
процессе жизнедеятельности которых образуются органические кислоты (молочная и уксусная),
оказывающие угнетающее действие на микроорганизмы, вызывающие порчу продуктов. Наиболее
благоприятным местом обитанием
молочнокислых бактерий является почва и культурные растения.
По данным Е.И. Квасникова, О.А. Нестеренко, численность этих бактерий определяется содержанием
в почве органических веществ. Так, в 1г почвы среднеазиатских пустынь и полупустынь
насчитываются единичные клетки, целинных сероземов – десятки и редко сотни, а луговых и лугоболотных до 1 тыс. клеток. При опустынивании луговой почвы численность молочнокислых бактерий
возрастает в тысячи раз [1, 2].
С целью изучения влияния фитонцидов борщевика Сосновского на микрофлору смешанных
силосов нами были проведены опыты. В качестве вариантов
опыта взяты силосуемые культуры в
соотношениях 70:30 (т.е. 70% борщевика Сосновского и 30% - бобовые растения). В качестве
биоконсервантов использовали три отобранных штамма молочнокислых бактерий L. plantarum (3, 10 и
13), отличающихся высокой кислотообразующей и антагонистической активностью. Типовые
культуры L. plantarum 34 и АМС взяты в качестве контрольных вариантов. Опыты поставлены в
лабораторных условиях. Срок хранения опытных образцов один месяц. При вскрытии опыта
определяли общую численность бактериальных организмов и количество молочнокислых бактерий.
Данные анализа отражены в таблице.
Таблица 1 – Влияние фитонцидов борщевика Сосновского на численность бактерий
Вариан
Молочнокислые бактерий, млн/г
ты
силос + L.
силос + АМС
силос + L.
силос +L.
силос + L.
опыта
plantarum 3
plantarum
plantarum 10
plantarum 13
34
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Б. С. –
люцерна
(70:30)
100,7
±
10,0
98,7±
1,9
99,5±
1,9
96,1±
1,9
98,8±
1,9
79,8±
1,8
114,6±
10,3
98,7±1,9
130,3±
11,1
118,2±
11,2
Б. С. –
соя
(70:30)
100,8
±
10,1
99,4
±1,9
104,5±
10,2
91,1±
1,9
102,0±
10,1
73,4±
1,7
107,6±
10,2
92,1±
1,9
122,3±
12,3
101,0±
10,0
Б. С. –
донник
(70:30)
119,5
±
10,1
119,5
±
10,1
118,1±
10,1
118,1±
10,1
116,1±
10,1
79,4±
1,7
119,8±
10,2
99,3±
1,9
125,0±
10,1
131,4±
10,1
Примечание: 1- общее количество бактерий, 2 – численность молочнокислых бактерий
99
Во всех вариантах опытов со смешанным силосом, где соотношение борщевика Сосновского к
бобовым составляло 70:30, численность молочнокислых бактерий значительно превышала таковую у
силосов, приготовленных с типовыми культурами L. plantarum 34 и АМС. Так, в варианте опыта со
смешанным силосом из борщевика Сосновского и люцерны количество молочнокислые бактерий
составляет 118,2, в то время как, в этом же силосе, но с использованием L. plantarum 34 численность
молочнокислых бактерий составляет всего 98,7 млн/г силоса. Аналогичная закономерность
проявляется и в других вариантах опыта. Все это свидетельствует об устойчивости новых штаммов L.
plantarum 3, 10 и 13 к фитонцидам борщевика Сосновского.
1. Дегтярева И.А., Алимова Ф.К., Шакирова Ш.К., Гибадуллина Ф.С. Влияние типа растительной формации на
микрофлору силоса //Кормопроизводство. – 2000. - №12. – С.26-28.
2. Квасников Е.И., Нестеренко О.И. Молочнокислые бактерий и пути их использования.-. М.: Наука, 1975.- 384с.
С.Сагындыкова1, Б. Мухамбетов1, А. Нурлыбеков1, С.А. Надирова2 ,У.З. Сагындыков2,
Р.Ж. Бержанова
БИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕКУЛЬТИВАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ
(Филиал «Экологическая биотехнология» «НЦБ РК» КН МОН РК1, Алматинский
технологоический университет2, e-mail: [email protected])
В данной работе приведены материалы по рекультивации нефтезагрязненных почв Атырауской области.
Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата «Бакойл» адаптированы к природно-климатическим условиям
западного Казахстана и к средам с высокой соленостью, безопасны для почвенного микробиоценоза.
В настоящее время среди различных техногенных нарушений природы одним из наиболее
серьезных и трудно устраняемых является нефтезагрязнение. Нефть и ее компоненты (ароматические,
нафтеновые и парафиновые углеводороды) являются одними из самых опасных загрязнителей,
попадающих в почву в процессах добычи, транспортировки, переработки и хранения. Хронические
разливы нефти приводят к быстрой и полной деградации ландшафтов (Израэль, Ровинский 1986;
Amadi et al., 1993).
Для ускорения процесса самоочищения почв от нефти используются все природные резервы
экосистемы, в том числе и биологические. Микробиологические методы очистки почв способны
дополнять различные технологии, а в определенных ситуациях не имеют аналогов (Walker, 1985;
Пиковский, 1993; Н.А. Киреева и др., 2001).
В настоящее время интенсивно разрабатываются и применяются методы микробиологической
очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании чистых или
смешанных культур углеводородокисляющих микроорганизмов в сочетании с различными
веществами, стимулирующими их активность. Эффективность этих методов может быть значительно
повышена путем изменения соответствующих физико-химических условий среды и внесением
ассоциации специально подобранных штаммов микроорганизмов, обладающих выраженными
углеводородокисляющими свойствами. (Славина, Середина, 1992; Сидоров и др., 1997). Одним из
важных условий микробиологической очистки нефтезагрязнений является способность различных
групп микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, дрожжевых грибов и миксомицетов) совместно
«бороться» с загрязнением, а также обладать высокой иннокулятивной жизнеспособностью (Звягинцев
и др., 2001) [1-4].
Так как углеводородокисляющие микроорганизмы являются постоянными компонентами
почвенных биоценозов, появилось стремление использовать их катаболическую активность для
восстановления загрязненных нефтью почв. Ускорить очистку почв от нефтяных загрязнений с
помощью микроорганизмов возможно в основном двумя способами:
- активизируя метаболическую активность естественной микрофлоры почв путем изменения
соответствующих физико-химических условий среды;
- внесением специально выделенных из естественной микрофлоры активных нефтеокисляющих
микроорганизмов в загрязненную почву.
«Национальный центр Биотехнологии РК» КН МОН РК создал "технологию рекультивации
загрязненных нефтью и нефтепродуктами земель, с помощи выделенных из аборигенной микрофлоры
культур микроорганизмов-деструкторов", прошедшей государственную экологическую экспертизу. По
количеству и токсичности данная деятельность относится к IV категории опасности.
Технология рекультивации загрязненных нефтью и нефтепродуктами почвы с помощью
выделенных из аборигенной микрофлоры культуры микроорганизмов-деструкторов применяется при
рекультивации замазученных территорий с 2006 г. Работы по микробиологической очистке почвы
проводились на загрязненных территориях месторождения «Жанаталап» (Атырауская область),
месторождения «Косчагыл» (Атырауская область), биоремедиационная площадка ТОО «Эко-техникс»
(г.Кульсары, Атырауская область), на месторождениях «Узень», «Жетибай», «Каламкас»
100
(Мангистауская область) Работы осуществлялись под контролем комитетов по охране природы этих
регионов.
С помощью агротехнических приемов можно ускорить процесс самоочищения загрязненных
нефтью почв путем создания оптимальных условий для проявления потенциальной катоболитической
активности углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в состав естественного
микробиоценоза.
Рыхление загрязненных почв увеличивает диффузию кислорода, снижает концентрацию
углеводородов в почве, обеспечивает разрыв поверхностных пор, насыщенных нефтью, но в то же
время способствует равномерному распределению компонентов нефти и нефтепродуктов в почве и
увеличению активной поверхности взаимодействия. При этом создается оптимальный водный,
газовоздушный и тепловой режим растет численность микроорганизмов, их активность, усиливается
активность почвенных ферментов, увеличивается энергия биохимических процессов. Оптимальная
температура почвы для внесения препарата 20 — 38 0С.
В марте 2011года в филиале «Экологическая биотехнология» «НЦБ РК» КН МОН РК поставлен
модельный эксперимент по очистке нефтезагрязненных почв. Почва с месторождения «Косчагыл».
Для проведения эксперимента использовали 30 пластмассовых латков размером 15х13 см и
высотой 10 см. Схема модельного эксперимента (рисунок 1):
Рисунок 1 - Схема модельного эксперимента
М1
М2
М3
М4
М5
М6
М7
М8
М9
М10
М1
М2
М3
М4
М5
М6
М7
М8
М9
М10
М1
М2
М3
М4
М5
М6
М7
М8
М9
М10
М1- контроль;
М2- контроль+увлаж.;
М3- Рыхл. + увлаж.;
М4- Рыхл. + увлаж.+Мин.Удоб.+Орг. Удоб.;
М5- Рыхл. + увлаж.+известь;
М6- Рыхл. + увлаж.+Биопрепарат «Бакойл»;
М7- Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.;
М8 -Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Орг.Удоб.;
М9- Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.;
М10-Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.+Известь (комплексный);
Проведен химический анализ гравиметрическим методом для определения исходного
содержания нефти в почве. Содержания нефти в почве составило 147 000 мг/кг.
Биопрепарат «Бакойл» введен в почву модельного эксперимента (на участках с биопрепаратом)
один раз, согласно иструкции биопрепарата, препарат наносится путем распыления на загрязненную
поверхность. Агротехническте мероприятия (рыхление, увлажнение) проводилось 2 раза в неделю.
Через 30 дней после внесения консорциумов микроорганизмов отобраны образцы почв с лотков.
Проведен химический анализ образцов, гравиметрическим методом, определено содержание
нефти в почве после введения биопрепарата. Результаты в таблице.
По результатам исследования наиболее эфективным для очистки нефтезагрязненных почв
показал 10 вариант опыта (Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.+Известь),
деструкция нефти-52,38%.
Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата «Бакойл» адаптированы к природноклиматическим условиям западного Казахстана и к средам с высокой соленостью, безопасны для
почвенного микробиоценоза, так выделены из нефтезагрязненных почв Атырауской области.
Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата используют нефть и нефтепродукты в качестве
единственного источника питания.
Таблица 1 – Определение количества нефти
Название
Исходное
Содержание нефти
пробы
содержание нефти, мг/кг через месяц после внесения
биопрепарата, мг/кг
М1
147 000
143 600
М2
147 000
142 000
М3
147 000
141 000
М4
147 000
128 000
М5
147 000
127 300
М6
147 000
94 000
М7
147 000
83 000
101
Деструкция нефти,
%
2,31
3,40
4,08
12,92
13,40
36,05
43,53
М8
М9
М10
147 000
147 000
147 000
80 000
78 600
70 000
45,57
46,53
52,38
Биопрепарат «Бакойл» подходит для очистки нефтезагрязненой поверхности почвы, процесс
деструкции протекает в период от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от
степени загрязнения объекта, химического состава загрязнителя , климатических и физико-химических
параметров среды.
1. Кахаткина, М. И. Состав гумуса пойменных почв, загрязненных нефтью / М.И. Кахаткина // Рациональное
использование почв и почвенного покрова Западной Сибири. Томск, 1986. - с.42 - 49.
2. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв / Н. А. Киреева и др..- М. : ОАО «ВНИИОЭНГ», 2001.
40 с.
3. Пиковский, Ю. И., Солнцева, Н. П. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв под влиянием потока
нефти / Ю. И. Пиковский, Н. П. Солнцева // Техногенный поток веществ в ландшафтах и состояние экосистем.-М:Наука,
1981.-С.13-21
4. Глазовская, М. А. Способность окружающей среды к самоочищению / М. А. Глазовская, // Природа. 1979. - №3. - С.
12 - 14.
УДК596
И.С. Савицкая
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ УРОВЕНЬ КИШЕЧНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И
ФЕКАЛЬНЫЕ МУТАГЕНЫ
(Казахский национальный университет им. аль-Фараби)
В организме человека в результате химического взаимодействия между определенными
соединениями, входящими в состав пищи, или их метаболической активации в некоторых случаях
могут синтезироваться мутагены [1, 7, 15]. Образование мутагенных продуктов из исходных веществ
возможно и в процессе их микробной трансформации [3, 12]. Такой процесс может происходить при
нарушении микробной экологии кишечника, поскольку участие дисбиотической микробиоты в
канцерогенезе подтверждено многими экспериментальными данными. Усиленный синтез таких
бактериальных ферментов как α- и β-глюкозидаза, β-глюкуронидаза, 7-α дегидроксилаза, 7-αстероиддегидрогеназа, нитроредуктаза, азоредуктаза активизирует реакции преобразования многих
проканцерогенов в канцерогены. Эти ферменты эффективно продуцируют клостридии, бактероиды,
вейллонеллы, эшерихии, актиномицеты, гемофильные бактерии [1,6]. На самом деле, спектр
метаболической активности этих микроорганизмов значительно шире, что позволяет им
воздействовать на многие субстраты, попадающие в организм человека из окружающей среды, а также
эндогенного происхождения, с образованием разнообразных мутагенов и канцерогенов.
В то же время нормальная микрофлора кишечника принимает участие в обезвреживании
мутагенов за счет ферментативного воздействия и продукции антимутагенов. Установлена
антимутагенная и противоопухолевая активность клеток или фрагментов клеточных компонентов
лактобацилл, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, энтерококков и их метаболитов,
присутствующих в культуральной жидкости или в ферментированных продуктах [2,9,18].
Противоопухолевые свойства пробиотической флоры основаны как на стимуляции ими
противоопухолевого иммунитета, так и на прямом токсическом воздействии их клеток и метаболитов
на новообразования [4,14,17]. При этом не стоит игнорировать имеющиеся единичные сведения о том,
что избыточное количество бифидобактерий в кишечнике может быть сопряжено с риском развития
колоноректального рака, ассоциированного с повышенной -глюкозидазной, -глюкуронидазной и
азоредуктазной активностью при щелочной реакции среды, что может происходить при переходе от
растительной к мясной диете [1,6]. Если это так, то изменение популяционного уровня представителей
облигатной кишечной флоры может приводить к снижению или увеличению мутагенности фекальных
масс. Ранее генотоксичность фекалий определяли либо по наличию в них мутагенов после введения
таковых экспериментальным животным, либо оценивали мутагенный фон фекальных экстрактов,
полученных от контингента лиц, предпочитающих мясную или вегетарианскую диету [8-13].
Содержание же фекальных мутагенов при микроэкологических нарушениях кишечника до сих пор не
исследовано. Дисбиозы кишечника, как правило, характеризуются снижением популяционного уровня
бифидобактерий и лактобацилл [1].
Цель исследования - определение мутагенного фона экстрактов фекалий при стандартном и
сниженном популяционном уровне бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек.
Материалы и методы
В работе были использованы фекальные экстракты, полученные от 52 человек, у которых
предварительно проводили бактериологический анализ микробного пейзажа фекалий по стандартной
102
методике [1]. Для приготовления экстрактов из кишечного содержимого в качестве экстрагента
использовали дистиллированную воду, добавляемую к свежему образцу, содержащемуся в стерильном
пенициллиновом флаконе, в соотношении 2:1. Содержимое флакона растирали стеклянной палочкой,
измельчали в блендере, отстаивали 10-15 мин, полученную суспензию центрифугировали 20 мин при
50 000 g. Надосадочную жидкость отбирали в отдельный флакон, осадок снова подвергали экстракции
по указанной схеме. Смесь стерилизовали мембранным фильтрованием через фильтры диаметром 0,45
мкм, затем 0,22 мкм.
Для приготовления фекалазы (ферментативных экстрактов фекалий) образцы, собранные от 5
здоровых и 6 доноров с дефицитом лактофлоры обрабатывали в лаборатории не позднее, чем через
полчаса после акта дефекации [16]. Фекалии суспендировали в 10 mM Na-фосфатном буфере в
соотношении 1:1 или 1:3 (вес:объем) в зависимости от консистенции. Для получения бесклеточного
ферментативного экстракта и лизиса бактериальных клеток, присутствующих в полученной суспензии,
их разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 40 сек при охлаждении (в ледяной бане) на
дезинтеграторе УЗДН-1. Фрагменты клеток удаляли центрифугированием при 30 000 g 20 мин при 40С
на ультрацентрифуге UP-65 (Германия). Сохранение нативной ферментативной активности в
экстрактах определяли с помощью общепринятого теста на β-галактозидазу. Поскольку количество
этого фермента в индивидуальных образцах значительно варьировало, экстракты смешивали, чтобы
получить
объединенный
ферментативный
экстракт
фекалий,
которые
стерилизовали
ультрафильтрацией и хранили при - 700 С.
Тестирование на мутагенность проводили в модифицированом тесте Эймса с индикаторными
штаммами Salmonella typhimurium ТА-98 и ТА-100 [5]. Штаммы несут мутацию ауксотрофности по
гистидину и ревертируют под действием мутагенов, вызывающих мутации типа сдвига рамки
считывания (штамм ТА 98) или замены пар оснований в молекуле ДНК (штамм ТА 100). Принцип
метода состоит в том, что под действием мутагена на селективной среде вырастают ревертанты по
гистидину, по числу которых определяют мутагенный эффект. Принято считать, что таковой имеет
место в случае, если уровень индуцированных тестируемым агентом реверсий более чем в 2 раза
превосходит спонтанный фон мутирования используемого штамма [7]. Суспензию клеток тест-штамма
предварительно инкубировали с опытным вариантом в течение 2 час при 370, затем клетки отмывали
от него и высевали на чашки с селективной средой. В качестве потенциальных промутагенных
субстратов или мутагенов для позитивных контролей использовали: N-нитрозо-N´-нитронитрозогуанидин (НГ) - 1 мкг/мл; N-нитрозо-N-метилмочевину (НММ) – 100 мкг/мл (фирмы Sigma,
США); 3-амино-1,4-диметил-[5Н]-пиридин-[4,3] индол (Trp-P), приготовленный из пиролизатов
триптофана.
Статистическая обработка. Для решения вопроса о наличии связи между снижением
количества защитной микрофлоры и мутагенной активностью фекалий применяли корреляционный
анализ. Рассматриваемые в данном случае признаки являются качественными так как они не
распределяются в вариационный ряд и имеют только два противоположных нечисловых значения,
которые удобно обозначить их «+» и «-». Тогда учитываемые признаки группируются в 4-х клеточную
корреляционную решетку, а степень их сопряженности измеряется с помощью коэффициента
ассоциации Дж. Юла rа, вычисляемого на основе данных опыта. Коэффициент ассоциации может
принимать значения от –1 до 1. Если rа<0-корреляция отрицательная, если rа>0-корреляция
положительная. Чем ближе абсолютное значение rа к 1, тем сильнее корреляция. Для оценки
достоверности эмпирического коэффициента ассоциации вычисляют его отношение к средней ошибке
m, которое должно быть больше стандартного значения критерия t Стьюдента для данного числа
степеней свободы k = n-2 и уровня значимости Р.
Результаты
Полученные вышеописанным способом водные экстракты фекалий добавляли в количестве 0,5
мл на чашку; для определения спонтанного уровня мутирования к суспензии клеток тест-штаммов,
высеваемых на селективную среду, добавляли аликвоты дистиллированной воды. Этим способом была
исследована мутагенная активность фекальных экстрактов, полученных от 52 человек, у которых
предварительно был проанализирован качественный и количественный состав кишечного
микробиоценоза. Анализ их микробных карт позволил разделить обследуемый контингент на две
группы. В первой группе, состоящей из 12 человек, не было зарегистрировано отклонений от
принятого стандарта содержания основных представителей резидентной микрофлоры. Во второй
группе, состоящей из 40 человек, были выявлены микроэкологические нарушения, проявляющиеся в
снижении на 1-3 порядка логарифма популяционного уровня бифидобактерий и/или лактобацилл,
уменьшении общего количества кишечных палочек и появлении их измененных форм.
При исследовании на мутагенность экстрактов фекалий, взятых от 12 человек, включенных в 1
группу, мутагенная активность выявлена только в 1 экстракте при использовании штамма ТА 100 и 2-х
для штамма ТА 98 (таблица 1). Причем, даже обнаруженная слабая мутагенная активность, когда
103
максимальное число ревертантов в образцах экстрактов превосходило их уровень в чистом контроле,
находилась почти на нижней границе статистической значимости различий.
Таблица 1. Мутагенность фекальных экстрактов для индикаторных штаммов Salmonella
typhimurium
Состояние
кишечной микрофлоры
Мутагенная активность экстрактов, выявленная
на штамме S.typhimurium
ТА100*
ТА98*
1/12
2/12
28/40
36/40
Нормобиоценоз
Дисбактериоз
Примечание* в числителе указано количество проб, содержащих мутагены;
в знаменателе – общее количество протестированных экстрактов
Иная картина наблюдается во второй группе. При исследовании мутагенности фекалий от 40
пациентов с дисбактериозом, генотоксиканты, индуцирующие повышенный уровень реверсий у
штамма ТА 100 обнаружены в 28 из них, и только в четырех отсутствовали мутагенные агенты,
действующие по механизму сдвига рамки считывания, которые удается зарегистрировать при помощи
штамма ТА 98.
Далее с использованием штамма ТА 100 отдельно исследована мутагенность экстрактов фекалий
в случае дефицита трех доминирующих групп кишечных бактерий – бифидобактерий, лактобацилл и
кишечных палочек (рис.).
В состоянии нормобиоценоза мутагенность обнаружена только в 1 из 12 (8,3% случаев)
исследованных экстрактов. При дефиците бифидобактерий и лактобацилл (снижении популяционного
уровня на 2 и более порядков) мутагенная активность обнаружена в 15 случаев из 23 (65%). Среднее
количество ревертантов, обнаруживаемое у бактерий индикаторного штамма сальмонелл ТА-100 в
присутствии фекальных экстрактов, взятых от людей с дефицитом бифидобактерий, составляло 480
ревертантов/чашку, лактобацилл – 360 ревертантов/чашку, а при совместном снижении их количества
– 580 ревертантов /чашку, что соответственно в 5,6; 4,2 и 6,4 раза превышало естественный фон
мутабильности индикаторного штамма. Содержание мутагенов в этих фекальных экстрактах было в
4,8; 3,6 и 5,2 раз больше, чем в экстрактах из фекалий людей со стандартным популяционным уровнем
бифидобактерий и лактобацилл.
Среднее число гистидиновых
ревертантов / чашку
600
500
400
300
200
100
Дефицит КП
Дефицит ББ и
ЛБ
Дефицит ББ
Дефицит ЛБ
Норма
Спонтанный
фон
0
Рисунок 1. Содержание мутагенов в кишечнике при стандартном и сниженном популяционном
уровне бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий
Обозначения: ЛБ-лактобациллы; ББ-бифидобактерии; КП-кишечные палочки.
При дисбалансе эшерихиозной микрофлоры мутагенность выявлена в 5 из 17 (30%)
исследованных экстрактах. Однако уровень мутаций у индикаторного штамма лишь в 2,5 раза больше
спонтанного фона мутирования при снижении на 1-2 порядка общего количества полноценных
кишечных палочек и в 2,2 раза превосходит его при повышенном содержании в популяции
измененных форм эшерихий (слабоферментирующих и лактозонегативных). Количество ревертантов в
104
этих вариантах статистически не отличалось от данных, полученных при определении мутагенности
экстрактов фекалий с нормальным уровнем эшерихиозной микрофлоры.
Для установления причинно-следственной связи между состоянием кишечной микрофлоры и
содержанием мутагенных соединений в фекалиях человека, полученные данные были подвергнуты
корреляционному анализу. Корреляции между качественным и количественным составом
эшерихиозной микрофлоры и мутагенной активностью экстрактов фекалий не обнаружено,
коэффициент ассоциации во всех случаев мал и его отличие от нуля можно отнести к случайным.
Однако существует достаточно тесная корреляция между популяционным уровнем лактобацилл и
бифидобактерий и уровнем фекальных мутагенов. Коэффициент ассоциации для этих двух признаков
оказался равным –0,41. Знак «минус» указывает на то, что корреляция отрицательная, т.е. в случае,
когда количество бифидобактерий и лактобацилл у данного обследуемого соответствует норме, то
мутагенная активность фекалий скорее всего не будет выявлена. Напротив, при снижении количества
бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике будет иметь место повышение содержания мутагенов в
фекалиях. Отношение коэффициента ассоциации, вычисленного на основании полученных нами
данных, к его средней ошибке mr больше стандартного значения критерия t Стьюдента для k = 38 и Р =
0,01,что говорит о его достоверности. Ни у одного из обследованных не наблюдался избыточный
бактериальный рост каких-либо представителей условно патогенной микрофлоры, что могло бы
обусловить продукцию мутагенных соединений в толстом кишечнике. Поэтому увеличение
содержания генетически активных соединений в данном случае определяется дефицитом
бифидобактерий и лактобацилл непосредственно, а не косвенно, через увеличение численности
эшерихиозной микрофлоры.
Чтобы проверить это, из фекалий 6 человек с дисбактериозом, у которых был выявлен дефицит
бифидобактерий и лактобацилл специальным образом был приготовлен ферментативный
бесклеточный экстракт – фекалаза дефицит (Фд). Такой же экстракт получен и из фекалий людей с
нормальной микрофлорой - фекалаза норма (Фн). Эти экстракты инкубировали в течение 2 часов с
растворами модельных мутагенов, далее добавляли к индикаторным штаммам, у которых определяли
уровень индуцированных ими мутаций. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2.
Таблица 2. Мутагенная активность N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ) и N-нитрозо-N-нитронитрозогуанидина (НГ) и пиролизата триптофана (Тrp-P) после преинкубации с фекалазой.
Штамм
модельный
мутаген
ТА100 - НММ
ТА 98 - НГ
ТА 98 - Trp-P
и Число гистидиновых ревертантов / чашку
Без
мутагена С
мутагеном Мутаген + Фн
(спонтанный
(позитивный
фон)
контроль)
125±9
1400±53
436±25
42±5
432±12
215±16
37±4
608±32
580±38
Мутаген + Фд
1230±36
354±22
600±44
Оказалось, что ферментативные экстракты, полученные из фекалий со сниженным количеством
бифидобактерий и лактобацилл - Фд, практически не оказывают антимутагенного действия в
отношении НММ и НГ, в то время как в присутствии препарата фекалазы, приготовленной из
кишечного содержимого со стандартным популяционным уровнем этих бактерий - Фн, мутагенная
активность НММ снижалась в 3,2 раза и вдвое для НГ. Уровень мутагенного эффекта пиролизата
аминокислоты триптофана (Тrp-P) не изменялся в присутствии обеих вариантов фекалазы и
практически не зависел от того, какое количество бифидобактерий и лактобацилл находилось в
кишечных пробах.
Обсуждение
Бактериям, постоянно обитающим в кишечнике человека, достаточно часто приходиться
контактировать с мутагенами, которые либо уже содержатся в пище, либо образуются в результате
ферментативной метаболической активации промутагенов, причем осуществляемой не только самим
хозяином, но и его микрофлорой. Поэтому в процессе длительного существования в таком биотопе они
приобрели эффективные системы антимутагенной защиты. Поскольку доминирующим звеном
кишечной микроэкологии являются бифидобактерии и лактобациллы, именно эти микроорганизмы
должны обладать такими функциями, ведь именно антимутагенные способности позволяют им
поддерживать постоянный и эволюционно выработанный уровень мутабильности. Тогда становится
понятным, почему уменьшение популяци этих бактерий может привести к повышению мутагенного
105
фона в кишечнике, что продемонстрировано приведенными в данной работе экспериментальными
данными.
К настоящему времени известно, что бидобактерии и лактобациллы, вегетирующие в
кишечнике, обладают системой многоуровневой защиты от самых различных мутагенов [2].
Микроорганизмы могут продуцировать ферменты, оказывающие антиоксидантное действие или
инактивирующие мутагены, блокировать метаболическую активацию их, активизировать работу
репарационных систем клетки и многое другое. Наблюдаемое в эксперименте снижение мутагенной
активности N-нитрозо-N-метилмочевины и N-нитрозо-N-нитро-нитрозогуанидина после преинкубации
их с фекалазой свидетельствует о том, что бифидобактерии и лактобациллы имеют ферменты,
действие которых приводит к снижению индуцированного этими мутагенами уровня индуцированных
реверсий у индикаторных штаммов. Это может быть связано с действием бактериальных редуктаз,
восстанавливающих мутагены до гидроксиламинов [9]. Есть данные, что процессы, происходящие при
гидролизе микроорганизмами соответствующих субстратов масляной кислоты влияют на инактивацию
пищевых проканцерогенов, таких как нитрозамины, которые обычно образуются в результате
метаболической активности бактерий-комменсалов у людей, употребляющих богатую белком пищу
[13]. Впрочем, необязательно в качестве бактериальных антимутагенов могут выступать белкиферменты. Дезактивация нитрозогуанидина, например, может быть связана с тиоловыми
соединениями [2].
Не только бактериальные метаболиты, но и клетки симбиотических бактерий, проявляют
высокую дисмутагенную активность в отношении мутагенов широкого спектра действия. К ним
относятся так называемые пиролизатные мутагены, выделенные первоначально из жаренных, богатых
белками продуктов. Бактерии резидентной кишечной микрофлоры, такие как лактобациллы, обладают
способностью связывать мутагенные продукты пиролиза триптофана, образующиеся при термической
обработке пищи [18]. Причем, связывают этот мутагенный продукт даже нежизнеспособные клетки.
Это объясняет, почему при обработке пиролизата триптофана фекалазой, представляющей собой
бесклеточный фекальный ферментативный экстракт, не происходило снижения его мутагенной
активности. В связи с этим перспективным представляются не только скрининговые исследования по
поиску активных штаммов, но и работы, направленные на выяснение механизмов действия и
идентификацию бактериальных метаболитов, обуславливающих антимутагенный эффект. Это
позволит провести обоснованный отбор пробиотических бактерий, способных оздоравливать
микрофлору кишечника и наделять ее широким спектром протекторных свойств, включая
антимутагенную и антикацерогенную активности.
1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное
состояние проблемы. М.:Гэотар-Медиа.2007.- 304с.
2. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагенные свойства бактерий (обзор). Прикладная биохимия и микробиология.
2002, 38(2):115-127.
3. Дурнев А.Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания. Генетика, 1997, 2 (33): 65-176.
4. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М. Иммуномодулирующая и антиканцерогенная активность нормальной
микрофлоры кишечника. Эксперим. клин. гастроэнтерол. 2004, 4:54-59.
5. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности среды с
помощью бактериальных тест – систем. Методические указания. М., Наука.1985.
6. Шендеров Б.А. Микроэкологические аспекты канцерогенеза. Антибиотики и химиотерапия. 1990, 35 ( 3):165-170.
7. Ames B.N. Mutagenesis and carcinogenesis: exogenous and endogenous factors. Environ. Mol. Mutagen.1989, 14(16): 6677.
8. Gerniglia C.E., Howard P.C., Fu P. et al. Metabolism of nitropolycyclic aromatic hydrocarbons by human intestinal
microflora. Bochem.Biophys.Res.Com. 1984, 123 (1):262-270.
9. Hosono A., Sagae S., Tokita E. Desmutagenic effect of cultured milk on chemically induced mutagenesis in Escherichia celli
B/r WP2 trp- hcr. Milchwissnscahaft. 1986, 41(3): 142-145.
10. Kingston D.G., Van Tassel R.L., Wilkins T.D. The fecapentaenes, potent mutagens from human feces. Chem. Res.
Toxicol.1990, 3: 391-400.
11. Kuhnlein U., Bergstrom D., Kuhnlein H. Mutagens in feces from vegetarians and non vegetarians. Mut. Res. 1981, 85(1):112.
12.Moore W.E., Moore L.H. Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Appl. Environ. Microb.1995,
9(61):3202-3207.
13. Mower R.F., Ichinotsubo D., Wang L.W. et al. Fecal mutagens in two Japanese population with different colon cancer risk.
Cancer Res.1982, 42(3): 1164-1169.
14. Reddy B.S. Possible mechanisms by which pro- and prebiotics influence colon carcinogenesis and tumors. J. Nutr. (Suppl.).
1999, 129: 1478- 1482.
15. Sigimura T. Food ad source of complex mixtures and carcinogens. WHO. Int. Agency Res. Cancer. (Lyon). 1990, P.399407.
106
16.Tamura G., Gold C., Ferro-Luzzi A., Ames B.N. Fecalase: A model for activation of dietary glycosides to mutagens by
intestinal flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, 77(8): 4961-4965.
17. Wollowski I., Rechkemmer G., Pool-Zobel B.L. Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer. Am. J. Clin.
Nutr. 2001, 73: 451-455.
18. Zhang X.B., Ohta Y. Antimutagenicity and binding of lactic acid bacteria from a Chinese cheese to mutagenic pyrolizates. J. Dairy
Scince, 1990, 73 (10):2702-2710.
***
С помощью бактериальной тест-системы Эймса на штаммах Salmonella typhimurim TA 100 и ТA 98 исследована
мутагенная активность фекальных экстрактов, полученных от 52 человек, у которых предварительно бактериологическим
методом был проанализирован качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза. Анализ микробных карт
позволил разделить обследуемый контингент на две группы, первую, состоящую из 12 человек, без выраженных отклонений
от принятого стандарта содержания основных представителей резидентной микрофлоры, и вторую из 40 человек с
выявленным снижением на 1-3 порядка популяционного уровня бифидобактерий, лактобацилл и кишечной палочки.
Показано, что снижение на 2-3 раза логарифма стандартного количества бифидобактерий и лактобацилл в
кишечнике приводит к повышению мутагенного фона экстрактов фекалий. Связи между качественным и количественным
составом эшерихиозной микрофлоры и мутагенной активностью экстрактов фекалий не установлено. Ферментативные
экстракты фекалазы, полученные из фекалий с высоким содержанием бифидобактерий и лактобациллп значительно снижали
выраженный мутагенный эффект нитрозометилмочевины и нитрозогуанидина.
И.С. Савицкая, В.А. Тарасов, А.С. Кистаубаева, Н.В. Воронова
БАТАРЕЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ
(Казахский национальный университет им. аль-Фараби)
Одним из перспективных направлений экологических исследований является генетическая
токсикология и ее новый раздел – экотоксикогенетика, который изучает воздействие факторов среды
на генетический аппарат различных организмов в составе биоценоза. Основной задачей этого
направления является создание методологии для классификации факторов окружающей среды по
степени их генетической опасности и осуществление мероприятий, направленных на уменьшение
возможных неблагоприятных генетических последствий [1]. Химические соединения, повсеместно
распространенные в природе, способные мигрировать по пищевым цепям и представляющие
наибольшую опасность, носят название суперэкотоксиканты [2]. Для контроля за их содержанием в
окружающей среде, необходимо разработать тест-системы для выявления как отдельных
генотоксикантов, так и оценки суммарной активности этих факторов в сложных смесях и природных
средах, прежде всего в почве.
Поскольку основное количество загрязнителей попадает именно в этот биосферный объект, при
проведении эколого-генетического мониторинга почв имеет смысл осуществлять не только выявление
и оценку мутагенного потенциала химических соединений, традиционно поступающих в почву, но и
определять уровень загрязнения мутагенами почвенного покрова – среды обитания почвенных
микроорганизмов. В связи с этим традиционно применяемые в генетической токсикологии
бактериальные тесты с успехом могут применяться для данных целей не только из-за своей
краткосрочности, но и ввиду возможности определения мутагенного воздействия загрязнителей на
обитающие в почве прокариоты.
Для этого на практике основное тестирование или просеивающую программу можно начинать с
применением первичной батареи, состоящей из трех разновидностей тестов [3]. В первую включены
репарационные тесты, в которых оценивается ДНК - повреждающая активность тестируемых агентов.
Они основаны на регистрации большего ингибирующего действия этих агентов у дефектных по
репарации штаммов по сравнению с диким типом. Экспресс - методы регистрации агентов,
взаимодействующих с ДНК, разработаны для различных микроорганизмов: B.subtilis, P.mirabilis, E.
coli. В целом эта группа методов носит название RecА-тест, который в настоящее время существует в
разных модификациях. Это, прежде всего, диффузионный тест - «spot»-тест и получивший
наибольшее развитие чашечный метод - «plate incorpоration test» [4]. Принципиально они
регистрируют один и тот же эффект – различие в токсичности испытуемых соединений в зависимости
от наличия или отсутствия recА функции, одного из ключевых ферментов, участвующих в
репарационных процессах. Однако результаты, полученные в
«spot»-тесте трудно оценить
количественно, в этом методе в большей степени регистрируется качественный эффект. Чашечный
тест более трудоемкий, по сравнению с другими модификациями и хуже поддается автоматизации.
Измерение же оптической плотности бактериальной культуры может быть легко
автоматизировано путем использования фотоколориметрических методов, и в этом отношении
суспензионный тест является наиболее перспективным в плане создания автоматизированных систем
107
массового скрининга. Разработанная на кафедре биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби и в лаборатории
молекулярной организации генома Иогена АН России модификация этого теста связана не просто с
определением количества клеток в суспензионной культуре, а с учетом -галактозидазной активности
в lac+ штаммах E.coli RR1 (recА+) и E.coli HB101(recА-) после контакта с мутагеном. Уровень
продукции этого фермента также измеряется фотометрически, отдельно для recА+ и recА- мутантов.
Это связано с наличием специфических красителей для –галактозидазы и, в связи с этим, высокой
точностью измерения ее активности в клетках, т.е. с повышением разрешающей способности метода
спектрофотометрии.
Предлагаемая тест-система была апробирована на ряде классических мутагенов, индуцирующих
в ДНК различные типы первичных повреждений. Для этого у recA+ и recA- штаммов E.coli после 2-х
часовой обработки мутагеном определялась оптическая плотность суспензии и активность –
галактозидазы. В качестве модельных мутагенов использовали классическимй алкилирующий агент
метилметансульфонат (ММС), основным типом первичных повреждений которого являются
модифицированные основания в ДНК. Параллельно с ним исследовали ДНК-тропное действие
бифункционального алкилирующего агента – Митомицина С (МтС), в результате действия которого,
наряду с индукцией моноаддуктов, образуются еще и межнитевые сшивки.
Таблица - Сравнительная чувствительность суспензионного Rec -теста и Rec -хромотеста
Мутаген
Митомицин С
Метилметансульфонат
Нитрозометилмочевина
Нитрозогуанидин
2-Нитрофлуорен
Этидиумбромид
2-Аминопурин
Доза, (мкг/мл), при которой наблюдается % снижение
регистрируемых параметров
Активность βОптическая плотность
галактозидазы
РД50
КРД50
ЛД50
КЛД50
recАrecА+
recАrecА+
1,5
120,0
0,0013
17,0
120,0 0,14
2,0
131,0
0,013
177,0
327,0 0,5
4,2
213
0,02
97
176
0,5
0,2
6,2
0,03
1,7
5,8
0,3
11,0
545,0
0,08
163,0
270,0 0,6
36,0
43,0
0,8
70,0
92,0
0,8
227,0
212,0
1,1
205,0
210,0 1,0
Кч recхромотеста
56,0
33,3
25,0
10,0
30,0
1,0
1,0
Параметры дозовой кривой рассчитывали в полулогарифмическом масштабе, а эффективность
работы тест-системы учитывали по величине коэффифиента К ЛД50, который вычисляли по
отношению дозы мутагена, вызывающего 50% гибель клеток (ЛД50) у штамма recA- по сравнению со
штаммом recA+. Для варианта Rec-теста К ЛД50= ЛД50 recA-/ ЛД50 recA+.
В случае Rec-хромотеста коэфффициент рассчитывали подобным образом, но при этом
определяли дозу мутагена, которая вызывает 50% снижение ферментативной активности –
галактозидазы – редукционную дозу (РД50). Для Rec-хромотеста КРД50= РД50 recA-/ РД50 recA+. По
этим данным определяется коэффициент чувствительности (Кч), по которому можно сравнить эти два
теста. Коэффициент чувствительности Rec-хромотеста Кч = К ЛД50/ КРД50.
Эффективность работы системы оценивалась по величине коэффициента R50, регистрирующего
кратность показателей 50% снижения активности фермента или плотности культуры у recA+ и recAштаммов после воздействия мутагена. Видно, что Кч предлагаемой тест-системы значительно
различается в зависимости от того, какого типа повреждения ДНК вызывает тот или иной мутаген. Так,
при воздействии таких агентов как 2-Аминопурин и этидиумбромид, коэффициент Кч =1, т.е. значения
К ЛД50 (концентрация клеток) и КРД50 (редукция активности –галактозидазы у recA+ и recAштаммов) не различаются. Этого и следовало ожидать, поскольку данные мутагены индуцируют
повреждения, которые реализуются как ошибки репликации.
Однако, для других использованных в работе мутагенов, запускающих работу репарационных
систем, значения сравниваемых коэффициентов различаются в 10,0 – 33,3 раза для алкилирующих
мутагенов, а в случае МтС в 56 раз. Полученные данные позволяют заключить, что эта новая система
«RecА-хромотест» является сверхчувствительной и может быть использована не только для
обнаружения мутагенов, но и мутагенного фона объектов окружающей среды с различной степенью
загрязнения [5].
108
В основе другой категории методов тестирования химических веществ на генетическую
активность с помощью индикаторных микроорганизмов лежит экспериментальная проверка их
способности индуцировать генные мутации. Для этого чаще всего используется бактериальная тестсистема Эймса, ставшая уже классической. Метод основан на способности мутагенов вызывать
реверсии к прототрофности у ауксотрофных по гистидину штаммов S.typhimurium. Ревертировавшие
под действием мутагена клетки при высеве на селективную питательную среду образуют колонии.
Если исследуемый агент оказывается мутагеном, то в его присутствии число таких колоний будет
больше, чем в контроле (спонтанный уровень мутаций).
Предложено достаточно большое число различных модификаций теста Эймса. Основная идея
усовершенствований – автоматизация процедуры тестирования и/или повышение чувствительности к
отдельным типам мутагенов. Среди наиболее значимых отметим «градиент»-тест Эймса
и
автоматизированный
«спиральный» тест Эймса [6]. С помощью этих модификаций можно
одномоментно на одной чашке оценивать мутагенные свойства веществ сразу в нескольких
концентрациях.
Вместе с тем тест Эймса, несмотря на несомненную популярность, имеет и недостатки. Метод
достаточно трудоемок, требует большого количества реактивов, оценка результатов может быть
проведена лишь через 48 часов инкубации индикаторных бактерий с испытуемым образцом. Кроме
того, тестирование нерастворимых в воде соединений может быть затруднено или даже вообще
неосуществимо ввиду сложности его диффузии в слой селективного агара на чашке. И, наконец
невозможно оценить мутагенную активность образцов, содержащих токсические компоненты.
Поэтому предлагается новая модификация теста Эймса, основанная на биолюминесцентном методе
индикации АТФ бактериальных клеток, в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и
люциферина, сопровождающееся свечением. Т.е. биолюминесцентные варианты теста
предусматривают использование штаммов, имеющих гены lux [7].
При этом одновременно определяется рост и ауксотрофов и прототрофов, что обеспечивает
возможность параллельного измерения не только мутагенного, но и токсического эффекта. При этом
время анализа значительно сокращается, реакция происходит в жидкой среде, измерение поддается
автоматизации, что исключает субъективный фактор оценки, присутствующей в тесте Эймса. Данная
модификация с успехом испытана на двух стандартных мутагенах – метилметансульфонате и
нитрохинолиноксиде. Высокая чувствительность данного теста позволяет рекомендовать его для
системы экологического контроля.
Существование в клетках E. coli системы генов SOS- ответа, выражение которых происходит
координированно в ответ на действие мутагенов, создает реальную возможность, путем учета
индукции активности любого из известных SOS - генов при действии испытуемого соединения, судить
о его мутагенной активности. Эта принципиальная возможность реализована при создании так
называемых SOS – хромотестов. Путем слежения за синтезом фермента β- галактозидазы,
находящегося под контролем SOS-индуцибельного промотора, полученные системы позволяют
качественно и количественно оценивать генотоксичность тестируемых соединений.
В настоящее время SOS – хромотест существует в двух вариантах – «хромосомном» и
«плазмидном». Достаточно обширный экпериментальный материал по сравнению эффективности SOS
– хромотеста с широко известным тестом Эймса указывает, что по уровню прогностической
способности эти тесты примерно одинаковы. Это касается также и порога чувствительности тестов,
однако по времени, затрачиваемому на одно измерение, а также простоте и возможности
автоматизации SOS – хромотест несомненно превосходит тест Эймса. Следует сказать, что это
сравнение относится к случаю – «хромосомного» варианта SOS – хромотеста [8].
Однако проведенные нами исследования по определению генотоксичности таких загрязнителей,
как фосфорорганические и триазиновые пестициды показали, что SOS – хромотест на базе плазмиды
pJB43 превосходит «хромосомный» аналог Килларде и др. по минимально обнаруживаемой
концентрации (порогу чувствительности), времени, затрачиваемому на одно измерение и
коэффициенту индукции в несколько раз. Достоверный эффект наблюдается в области малых доз – 1 и
10 мкг/мл, для которых активности на штаммах Эймса не обнаружено [9].
Общим достоинством бактериальных тестов является быстрота, экономичность, высокая
чувствительность, возможность автоматизации. Краткосрочные бактериальные тест-системы,
применяемые в генетической токсикологии, могут быть использованы в системе экологического
мониторинга для измерения мутагенного фона объектов окружающей среды.
109
1. Новиков А.В. Экология, окружающая среда и человек // М.: Наука. – 2001. – 306 c.
2. Fahring R.F., Lang R., Madle S. General strategy for the assessment of genotoxicity // Mutat. Res. – 1991. – Vol. 252. – P.
161-163.
3. Тарасов В.А., Абилев С.К., Велибеков Р.М., Асланян М.М. Эффективность батарей тестов при оценке
потенциальной мутагенной опасности химических соединений // Генетика. – 2003. - Т.39. - №10. – С.1406-1417.
4. Yamaguci T. Mutagenic activity of various kinds of cheese on the Ames, rec and umu assay // Mutat. Res.-1989. Vol. – 224.
- №4. -P.493-502.
5. Савицкая И.С., Махмудова Г.С., Кистаубаева А.С., Ахметова Ж.А. Перспективы использования
автоматизированных бактериальных тест-систем для массового скрининга генотоксичных агентов в почве // Сборник
материалов II Международной конференции «Современные проблемы геоэкологии и сохранение биоразнобразия». - Бишкек,
2007 - С. 278-280.
6. Diehl M., Fort F. Spiral Salmonella assay: validation against the standard pour-plate assay // Environ. Mol. Mutagen. – 1996.
– Vol. 27. – P. 227-236.
7. Guadano A., Pena E., Azucena G.C., Jose F.A. Development of new bioluminescent mutagenicity assay based on the Ames
test // Mutagenesis, 1999, Vol.14, № 4. -P.411-415.
8. Quillardet P., Huisman O.,De An R., Hofnung M. SOS-chromotesti, ei direct assay of induction of a SOS function in
Escherichia coli k12 to measure genotoxicity // Proc. Nat. Acad . Sci. (USA). - 1982. - Vol.79. - P.5971-5975.
9. Савицкая И.С., Махмудова Г.С., Кистаубаева А.С., Ахметова Ж.А. Перспективы использования
автоматизированных бактериальных тест-систем для массового скрининга генотоксичных агентов в почве // Сборник
материалов II Международной конференции «Современные проблемы геоэкологии и сохранение биоразнобразия». - Бишкек,
2007 - С. 278-280.
Приводится краткая характеристика основных разновидностей бактериальных тест-систем на мутагенез и репарацию,
применяемых в экотоксикологии. Обсуждаются их достоинства и недостатки. Разработана новая модификация Recхромотеста. Она рекомендуется для использования в генетической токсикологии при скрининговых исследованиях для
определения ДНК-тропной и антигенотоксической активности различных факторов.
***
The short characteristic of the basic versions of bacterial test systems on mutation and a reparation, applied in ecotoxicology is
resulted. Their merits and demerits are discussed. Is developed new updating Rec-hromotests. It is recommended for use in genetic
toxicology at screenings researches for definition of DNA-trops and antigen toxics to activity of various factors.
И.С. Савицкая, А.С. Кистаубаева, К. Нигметова, Н.В. Воронова
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
КЛЕТОК ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА КАРБОНИЗОВАННОМ СОРБЕНТЕ
(Казахский национальный университет им.аль-Фараби)
При пероральном приеме пробиотиков, содержащих живые микроорганизмы или их активные
метаболиты, преодоление естественных барьеров (кислая среда и протеолитические ферменты желудка
или секреты мембран кишечных и слизистых оболочек и ворсинок) сопровождается значительной
потерей исходной активности готовых лекарственных форм. Клинико-экспериментальные
исследования показали, что под действием желудочного сока и желчи пробиотики теряют более 90%
своей активности еще до момента попадания в кишечник [1].
Для сохранения жизнеспособности клеток бактерий-пробиотиков их можно, но и закреплять на
поверхности носителя-сорбента [2].
Среди сорбентов, которые могут быть использованы для иммобилизации пробиотиков особый
интерес представляют активированные угли нового типа, полученные путем высокотемпературной
карбонизации и последующей активации отходов растительного происхождения, таких как скорлупа
грецких и кокосовых орехов, абрикосовые косточки, рисовая шелуха и т.п. Несомненным
достоинством этих сорбентов является то, что производятся они из дешевого, причем ежегодно
возобновляемого растительного сырья. Широкий диапазон размеров пор и большая удельная
поглощающая поверхность карбонизованных материалов обеспечивают наличие у них высоких
прикрепительных и детоксикационных свойств [3].
Это послужило основанием для изучения возможности иммобилизации клеток лактобацилл на
сорбенте из зауглероженной рисовой шелухи (ЗРШ), полученной Институте проблем горения КазНУ
им.аль-Фараби.
Цель работы: Исследовать влияние иммобилизации клеток лактобацилл на зауглероженной
рисовой шелухе на их антагонистическую активность и устойчивость к неблагоприятным факторам.
Материалы и методы исследования
В качестве пробиотического компонента использованы отобранные ранее 3 штамма бактерий
рода Lactobacillus, принадлежащие к трем наиболее типичным видам интестинальной лактофлоры:
L.fermentum АК-2R, L.acidophilus AA-1R и L.plantarum AP-1R.
110
Иммобилизацию клеток лактобацилл проводили в течение 10 часов, затем носитель отмывали от
слабо прикрепившихся клеток изотоническим раствором и использовали в дальнейших экспериментах.
Эффективность сорбции бактерий рассчитывали по разнице концентраций клеток микроорганизмов в
культуральной среде до и после сорбционного процесса [4]. Для определения степени устойчивости
иммобилизованных клеток лактобацилл к биологическим жидкостям использовали желудочный сок
(20-30%), который добавляли в среду, содержащую 109 КОЕ/мл бактериальных клеток. Клетки
лактобацилл экспонировали с желудочным соком в течение 60 мин, после чего производили высев на
твердую среду МРС-1 для определения количества жизнеспособных клеток. Антагонистическую
активность определяли после совместного культивирования комплекса иммобилизованных клеток
лактобацилл (КИКЛ) в жидкой питательной среде MRС-5 в течение 24 часов в отношении трех тесткультур Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Candida albicans.
Результаты и обсуждение
В литературе встречаются разноречивые данные о времени установления сорбционного
равновесия в системе клетка-носитель. Некоторые авторы считают, что сорбция клеток из
концентрированной суспензии микроорганизмов обычно полностью проходит за 5-10 минут,
дальнейшее продление времени контакта, как правило, не увеличивает количества сорбированных
клеток. Однако, для некоторых микроорганизмов сорбционный процесс продолжался в течение более
длительного взаимодействия клеточной суспензии с носителем [4]. В наших экспериментах количество
сорбированных клеток после 10 часового контакта суспензии с носителем намного выше, чем после 12 часового, что может объясняется изменением свойств поверхности клеток в процессе длительной
иммобилизации [5]. Однако, увеличение времени контакта суспензии микроорганизмов с носителем до
24 часов не приводило к возрастанию количества прикрепившихся клеток. На основании этого можно
считать, что 10 часов - оптимальное время для иммобилизации клеток лактобацилл на ЗРШ в
использованных условиях.
Для повышения эффективности иммобилизации иногда предлагается окислительная
модификация сорбентов гипохлоритом натрия, озоном [6] или поверхность сорбционных материалов
обрабатывают двухвалентными катионами или этанолом [7]. Такой способ может менять заряд на
поверхности дисперсионных частиц и часто приводит к усилению взаимодействия с противоположно
заряженными группами на поверхности клетки. В связи с этим, с целью увеличения удельной емкости
сорбент ЗРШ предварительно обрабатывали этанолом. Для этого использовали сетчатый стакан
(стакан Бернрейтера), замачивали 100 г сорбента в 500 мл 80% этанола, смесь перемешивали и
оставляли на 3 часа, затем сорбенты извлекали из цилиндра, после чего промывали дистиллированной
водой и автоклавировали при 1 атм. в течение 1 часа. Данные, иллюстрирующие способность клеток
лактобацилл к иммобилизации на сорбенте ЗРШ, обработанным вышеуказанным способом, приведены
в таблице 1.
Таблица 1 – Эффективность иммобилизации клеток лактобацилл на ЗРШ
Штаммы
Эффективность сорбции, %
ЗРШ
ЗРШ после
обработки
этанолом
44±0,2
65±8,0
Десорбция клеток, %
ЗРШ
ЗРШ после
обработки
этанолом
10±0,4
2±0,1
L.acidophilus AA1
40±0,07
62±4,0
12±0,06
4±0,2
L.plantarum AP-1
54±0,3
78±6,0
8±0,5
3±0,05
L.fermentum АК2R
Установлено, что после обработки сорбента этанолом его клеточная загрузка увеличилась и
достигает – 62-78%. Кроме того, при модифицировании поверхностей этанолом десорбция клеток
также снижается, что свидетельствует о повышении прочности их прикрепления к носителю.
На поверхности носителя – ЗРШ была иммобилизована и смешанная культура лактобацилл,
состоящая из всех трех штаммов. Оказалось, что бактерии хорошо адсорбируются на данном сорбенте,
титр прикрепившихся клеток достигает 109 КОЕ/г. Однако, количество клеток штаммов Lactobacillus
fermentum АК-2R было гораздо больше, чем Lactobacillus acidophilus AА-1 и Lactobacillus plantarum
AР-1. Полученный биосорбент содержит 5,3х108 КОЕ/г клеток штамма АК-2R. Клетки двух остальных
штаммов распределены поровну (2,5х108 КОЕ/г клеток штамма АА-1 и 2,2х108 КОЕ/г – АР-1).
Следовательно, соотношение компонентов каждого вида составляет 2:1:1. Это может быть связано со
111
штаммовыми различиями поверхностных сайтов бактериальных клеток. Клетки на поверхности ЗРШ
расположены в основном в виде микроколоний. Этот факт может иметь существенное значение,
поскольку межбактериальное агрегирование, происходящее в микроколониях - начальный этап
образования биопленок, в которых бактерии значительно лучше защищены от неблагоприятных
воздействий [8-10].
В наших экспериментах таковым является кислая среда желудка, при транзите через который
большая часть микробных клеток погибает. Для изучения чувствительности свободных и
иммобилизованных клеток к такому стрессовому воздействию использовался желудочный сок,
который был пoлучен при гастроскопии. Его добавляли к культуре лактобактерий в среде МРС-1,
содержащей 109 клеток/мл и инкубировали в течение часа, после чего определяли количество
выживших клеток. При воздействии желудочного содержимого на жидкий концентрат лактобактерий
их биотитр (концентрация живых клеток) уменьшается на 4 порядка (рис. 1). Это означает, что при
пероральном применении суспензии лактобактерий следует ожидать, что лишь незначительная часть
их жизнеспособных клеток достигает толстого кишечника. По этой причине его следует рассматривать
скорее как ценный продукт питания, богатый ферментами, витаминами, но не как лекарственный
препарат, предназначенный для активной колонизации кишечника лактобациллами. Использование в
экспериментах с «модельным желудком» не свободных, а иммобилизованных клеток лактобацилл
выявило, что прикрепление микробных клеток на сорбент ЗРШ оказывает защитное действие в
отношении желудочного сока. Количество жизнеспособных клеток в этом случае снижается лишь на
порядок. Скорее всего, это связано с тем, что клетки, входящие в состав образованных на сорбенте
микроколоний, лучше защищены от
бактерицидных факторов и неблагоприятного действия
окружающей среды, поскольку покрыты дополнительной общей мембраной [1]. Поэтому
иммобилизованные пробиотики по устойчивости к воздействию желудочного сока значительно
превосходят жидкий концентрат на основе свободных клеток микроорганизмов и могут
беспрепятственно преодолевать «желудочный» барьер при их пероральном введении.
Кроме того, их метаболитическая активность выше, поскольку в составе микроколоний и
биопленок она контролируется на основе «Quorum sensing». Эта система носит такое название,
поскольку она координирует работу генов, экспрессия которых происходит только при достижении
определенной плотности микробной популяции (не менее 107 клеток/мл). Гены, кодирующие
ферменты, обеспечивающие синтез лактобациллами таких антимикробных факторов как бактериоцины
и микроцины, регулируются этой системой [1; 11].
Рисунок 1 - Влияние искусственной желудочной среды на жизнеспособность свободных и
иммобилизованных клеток лактобацилл
Активность пробиотиков, определяемую в условиях in vitro, принято оценивать по титру
микробных клеток в препарате или уровне их физиологической активности. Поскольку важнейшей
характеристикой эффективности пробиотического действия является антимикробная активность,
представлялось целесообразным изучение влияния
иммобилизации на этот показатель.
Антагонистическую активность определяли после совместного культивирования комплекса
иммобилизованных клеток лактобацилл (КИКЛ) в жидкой питательной среде MRС-5 в течение 24
часов в отношении трех тест-культур Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Candida albicans.
Ингибирующий эффект препарата определяли по количеству выживших клеток тест-штаммов (% к их
уровню при выращивании в питательной среде без пробиотиков). Для этого в систему вносили 1 мл
взвеси лактобацилл в концентрации 108 КОЕ/мл, 1 г КИКЛ или 1 г сорбента без клеток. Их добавляли к
112
10 мл суспензии тест-штаммов (108 клеток/ мл) в среде MРС-5, то есть соотношение культур
составляло 0,1:1,0 (табл.2).
Таблица 2 – Антагонистическая активность комбинированного препарата при совместном
культивировании с тест-организмами
Вариант
Количество жизнеспособных клеток тест-штаммов, % к контролю
Salmonella
Staphylococcus
Candida albicans
typhimurium 50-90
aureus S60
КАА88
КИКЛ
0,8±0,01
0,6±0,03
8,3±0,2
КСК
17,5±2,1
16,5±1,3
29,6±1,6
ЗРШ
67±2,6
70±4,6
72±5,3
Контроль
100
100
100
Примечание: КИКЛ - комплекс иммобилизованных клеток лактобацилл; КСК-комплекс
свободных клеток; ЗРШ – зауглероженная рисовая шелуха.
Видно, что комплекс из свободных клеток лактобацилл оказывает выраженное негативное
действие на все 3 тест-культуры. В то же время и сам сорбент способен связывать до 28-33% клеток
этих микроорганизмов. Поэтому при использовании комплекса иммобилизованных клеток
лактобацилл происходит эффективное подавление роста тест-культур. Согласно стандартным
требованиям, количество живых клеток тест-штаммов бактерий по истечении 24 часового совместного
культивирования с лактобактериями не должно превышать уровень 2 % по сравнению с контролем.
При определении антагонистической активности КИКЛ после его совместного культивирования с
микроорганизмами – мишенями эта цифра многократно превышена, то есть, иммобилизованные
клетки пробиотиков в условиях in vitro практически полностью подавляют рост и жизнеспособность
данных тест-организмов.
Таким образом, при сравнительной оценке устойчивости свободных и иммобилизованных
клеток лактобацилл к желудочному соку были получены результаты, свидетельствующие о достаточно
высокой устойчивости иммобилизованных бактериальных препаратов к бактерицидному действию
биологических жидкостей, вероятно, это связано с протективным действием карбонизированного
носителя. Кроме того, клетки, образующие микроколонии, лучше защищены от бактерицидных
факторов и неблагоприятного действия окружающей среды, что может способствовать преодолению
«желудочного» барьера при их пероральном введении. Иммобилизация клеток лактобацилл повышает
их антагонистическую активность
1 Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико- лабораторный синдром: современное
состояние проблемы. - М., Гэотар-Медиа. - 2007. – С. 304-305.
2 Решетников В.И. Разработка лекарственных форм препаратов с иммунобиологической и сорбционной активностью
//Фармация. – 2002. - №5. – С. 40-44.
3 Емуранов М.М., Шилина Ю.А., Рябикин Ю.А., Зашквара О.В., Шабанова Т.А., Бийсенбаев М.А., Мансурова Р.М.,
Мансуров З.А. Физико-химическое исследование углеродных материалов на основе нетрадиционного растительного сырья //
Материалы 4 международного симпозиума «Физика и химия углеродных материалов. Наноинженерия». – Алматы, 2006. – С.
168-171.
4 Курдиш И.К. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми материалами и его биотехнологическое значение //
Микробиологический журнал. – 1999. - Т. 61, № 1. - С. 60-73.
5 Жубанова А.А., Шигаева М.Х. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Биотехнология. Теория и практика. 1997. - № 2. - С. 3-12.
6 Тихонова Л. С., Белоцерковский М. Ц. Повышение эффективности сорбции микроорганизмов на активированном
угле при поляризации сорбента // Прикладная биохимия и микробиология - 1995. - Т. XXV, №2. - C. 184 - 187.
7 Дигель И.Э., Жубанова А.А. Прикрепительная иммобилизация клеток микроорганизмов // Биотехнология. Теория и
практика. - 1997. - №4. - С. 3-9.
8 Волков М.Ю. Эффективные формы пробиотиков, иммобилизованных на природных адсорбентах // Пищевые
ингридиенты. Сырье и добавки. – 2007. - № 1. – С. 48-51.
9 Dunne W.M.Jr. Bacterial adhesion; seen any good biofilms lately? // Clin. Microbiol. Rev. -2002. – Vol. 15. – P. 155-156.
10 Bhinu V.S. Insight into biofilm-associated microbial life. – J. Mol. Microbiol. – 2005. - Vol. 3. – P. 197-214.
11 Kuchma S.L., O’Toole G.A., Surface-induced and biofilm induced changes in gene expression // Curr. Opin Biotachnol. 2000. – Vol. 11. – P. 429-433.
***
Жоғары температурада көміртектелінген күріш кебегін этанолмен өңдегенде оның сорбциялық қасиеті 8%
жоғарылайды. Иммобилизенген лактобацилла клеткаларының қарын жəне өт сөліне тұрақты антагонистік бейсенділігі
жоғары.
113
***
Etanol cultivation carbonized acid sorbent on the Rice Hush base prefer the sorbtion property in attidude Lactobacillus cells.
Cells immobilization of Lactobacillus is elevate their stability to gastrict juise, and stimulate antagonistic activity.
И.С. Савицкая, А.С. Кистубаева, М. Абдулжанова, Ж. Жумагалиева
ПРИНЦИПЫ ОТБОРА ШТАММОВ ДЛЯ НОВОГО ЛАКТОСОДЕРЖАЩЕГО ПРОБИОТИКА
(Казахский национальный университет им.аль-Фараби)
В последние годы интенсивно развивается биотехнология пробиотиков – препаратов,
используемых для коррекции и профилактики микроэкологических нарушений в желудочно-кишечном
тракте человека и животных [1]. Поскольку, в кишечнике человека доминируют бифидобактерии и
лактобациллы, большинство пробиотиков создается на основе этих бактерий [2]. Эффективность
пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих
в состав препарата [3]. Производственные бактерии должны обладать набором характеристик,
позволяющих им конкурировать с патогенными и условно патогенными микроорганизмами. К ним
относятся: апатогенность, антагонистическая активность, способность к адгезии и колонизации
слизистой кишечника, активность кислотообразования, определенный уровень резистентности к
соляной кислоте и желчи [4].
Повышение эффективности и расширение спектра биологической активности лактосодержащих
пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе
специально
подобранных
бактериальных
композиций,
включающих
совместимые
и
взаимодополняющие штаммы [5].
Цель работы: сконструировать бактериальную композицию с учетом совместимости входящих в
нее штаммов.
Материалы и методы исследования
Для составления бактериальных композиций использовали 10 штаммов лактобацилл,
выделенных из кишечника 20 детей и взрослых обоего пола, не имеющих в анамнезе инфекционных
заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Антагонистическую активность исследовали методом отсроченного антагонизма в отношении
стандартного набора тест-культур [6], а также гомоантагонизма – при совместном культивировании
штаммов лактобацилл на плотной питательной среде [7]. Адгезивную активность определяли по
способности штаммов агглютинировать агглютинировать эритроциты барана, морских свинок,
человека IV(AB) и I(0) [8]. Для определения лектиноподобных структур использовали реакцию
агглютинации с конкавалином А [9].
Результаты и обсуждение
Ключевым критерием при первичном отборе пробиотических штаммов лактобацилл является
уровень и спектр их антагонистической активности, который традиционно определяется методами
штрихового посева, диффузионным, или отсроченного антагонизма. При этом не учитывается природа
продуцируемых отбираемыми штаммами веществ, обладающим антагонистическим действием по
отношению к организмам-мишеням. У различных видов молочнокислых бактерий описаны
бактериоцины с высокой и микроцины – с низкой молекулярной массой, нарушающие проницаемость
бактериальной мембраны,
блокирующие белковый синтез, подавляющие репликацию ДНК,
изменяющие мембранный потенциал клетки или нарушающие процессы деления клетки [10]. С нашей
точки зрения, в качестве критерия отбора штаммов для включения в пробиотическую композицию,
являющуюся микробиологической основой комплексных препаратов, следует проводить селекцию
штаммов лактобацилл, синтезирующих микроцины с широким спектром антагонистической
активности.
Для их определения можно использовать метод агаровых слоёв – разновидность метода
отсроченного антагонизма. Применяя его различные модификации, достаточно просто
дифференцировать продукцию бактериоцинов с высокой молекулярной массой и микроцинов с низкой
молекулярной массой. В первом случае на поверхность плотной среды наносят бляшками
лактобациллы, которые после культивирования убивают парами хлороформа, затем наслаивают тесткультуру. Появление вокруг бляшки зоны отсутствия роста - положительный результат. Для
индикации микроцинов на поверхность плотной среды с нанесенными, высохшими и обработанными в
парах хлороформа бляшками, накладывают стерильный целлофан, а сверху на него наслаивают
полужидкий агар с тест-культурой. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появляются зоны
114
роста индикаторных штаммов [11]. Микроцинпродуцирующая активность выявлена у 10 штаммов
(таблица 1).
В антимикробном действии исследуемых штаммов имеется определенная специфичность,
спектры антагонистической активности у разных штаммов далеко не всегда перекрываются. Так,
штаммы АА-1 R, AI-17, LK-7 и AС-31 R больше ингибируют грамположительные бактерии, но не
дрожжи. Штаммы AK-2R, АК-9, АА-9 и АП-4R максимально эффективны против грамотрицательных
энтеробактерий. Штаммы АР-1, АП-4R, AK-2R и AI-17 оказывают негативное действие на дрожжевые
грибки. Для того, чтобы совместить разные виды антагонистической активности, следовало составить
композицию из нескольких штаммов.
Для первичного скрининга пробиотических бактерий, большое значение имеет способность к
адгезии, ведь именно это качество определяет возможность их приживления в организме хозяина.
Наиболее универсальной моделью для изучения адгезии микроорганизмов являются эритроциты,
поскольку гликофорин их поверхностного слоя идентичен гликокаликсу эпителиальных клеток, на
котором расположены рецепторы для микробных адгезинов [8].
Таблица 1 – Спектр антагонистического действия лактобацилл – продуценов микроцинов
АА-1R
АI-17
АA-9
АР-1R
АП-4R
АC-31R
АС-1
AK-2R
АК-9
LK-7
22±0,70
12±0,14
7±0,27
5,5±0,16
2±0,41
3,5±0,45
17±0,34
13±0,35
18±0,32
19±0,18
12±0,36
18±0,38
21±0,69
11±0,35
19±0,50
15±0,45
8±0,35
22±0,56
20±0,26
6±0,27
Антагонистическ
ая
активность
в
отношении штаммов
Candida albicans
Антагонистическ
ая активность
лактобацилл в
отношении
грамотрицательных
энтеробактерий
Штаммы
Антагонистическ
ая активность в
отношении
грамположительных
аэробных бактерий
Зоны задержки роста тест-микробов, мм (М±m)
3±0,11
5,5±0,21
4,5±0,14
10,5±0,16
7,5±0,17
4,5±0,18
2,5±0,09
7±0,55
3±0,07
3±0,19
Экзогенные лактобациллы способны прикрепляться к эпителиоцитам, создавая барьер,
препятствующий адгезии и транслокации во внутреннюю среду патогенной и условно-патогенной
флоры. Эта адгезия осуществляется за счет наличия у лактобацилл лектиноподобных структур, плотно
связанных с клеточной стенкой [9]. Некоторые штаммы способны синтезировать слущивающиеся с
поверхности клеток адгезиноактивные белки, которые блокируют и дезинтегрируют патогены,
защищая таким образом макроорганизм от способных к транслокации кишечных бактерий [12]. В
связи с этим, полагаем, что наилучшую композицию препарата может дать комбинация штаммовпродуцентов микроцинов, в которой одновременно будут присутствовать наряду со штаммами,
несущими на своей поверхности слущивающийся адгезиноактивный белок, еще и штаммы, адгезивную
активность которых определяют лектиноподобные структуры, плотно связанные с клеточной стенкой.
Для определения последних у исследуемых штаммов использовали реакцию агглютинации с
конкавалином А. Оказалось, что продукция белково-липотейхоевого комплекса присутствует у
штамма AK-2R, принадлежащих к виду L.fermentum, а также у шаммов АР-1R и АП-4R вида
L.plantarum. Выявлено также, что набор адгезинов у разных штаммов и видов лактобацилл,
определяемый по способности культур агглютинировать эритроциты барана, морских свинок, человека
IV(AB) и I(0) P+ вариабилен. Штамм LK-7 вида L.casei имел узкий спектр адгезинов – он умеренно
агглютинировал только эритроциты барана. В то же время штаммы АА-1R и AI-17, относящиеся к
виду L.аcidophilus активно агглютинировали все четыре вида эритроцитов.
Проведенные исследования позволяют заключить, что в состав комплексного пробиотического
препарата можно включать культуры с выраженной экспрессией разных типов адгезинов, но не
115
секретирующие лектинзависимый белок, и другой вариант лактобацилл, секретирующий во внешюю
среду этот субстрат, но при этом проявляющий умеренную адгезивность в тесте с эритроцитами.
Исходя из полученных данных, для дальнейшего отбора оставлено 5 штаммов.
Cовмещение штаммов и композицию и их совместное культивирование может приводить к
проявлению антагонизма не только по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям
(гетероантагонизм или прямой антагонизм), но и к представителям других видов рода Lactobacillus, а
иногда даже к отдельным штаммам в пределах одного вида. Такой вид активности в литературе
принято называть гомоантагонизмом или изоантагонизмом [7]. Поэтому при конструировании
комплексных пробиотических препаратов, следует учитывать биосовместимость штаммов, входящих в
бактериальный консорциум.
Оценку биосовместимости штаммов лактобацилл проводили путем одновременного совместного
культивирования на плотной питательной среде, а также с использованием одного из вариантов метода
отсроченного антагонизма. Результаты этих тестов суммированы в таблице 2.
Таблица 2 – Биосовместимость штаммов лактобацилл при совместном культивировании на
плотной питательной среде
Штамм
ы
АА-1R
АА1R
АI17
АР1R
__
АК2R
LK7
+
+
+
__
__
+
+
+
+
АI-17
__
АР-1R
АК-2R
+
+
__
__
+
LK-7
+
+
+
+
По результатам экспресс-теста на биосовместимость выяснилось, что штамм L.acidophilus АI-17
несовместим со штаммами L.fermentum АК-2R, L. plantarum АР-1R и даже со штаммом того же вида L.
acidophilus АА-1R. Судя по полученным в этом тесте результатам, АI-17 проявляет
гомоантагонистическое действие в отношении всех используемых в эксперименте штаммов, кроме
штамма LK-7. Поэтому для основы бактериальной композиции из двух представителей вида L.
acidophilus был оставлен только штамм АА-1R. Из полученных в этом эксперименте данных видно,
что все использованные в работе штаммы полностью совместимы друг с другом. Зона задержки роста
или полностью отсутствует, или ее размер не превышает 2-3 мм. Исходя из этого, теоретически
возможно составление 4-х разновидностей бактериальных композиций:
№1 - АА-1R+ АР-1R+LK7+АК-2R;
№2 - АА-1R + АР-1R+АК-2R;
№3 - АА-12+ АР-1R+ LK7;
№4 - АА-12+ АК-2R+ LK7.
В микробиоценозе кишечника человека присутствуют представители трех таксономических
групп лактобацилл: термобактерии или облигатные гомоферментативные лактобациллы (ОГОЛ), к
которым относится вид L. acidophilus; стрептобактерии или факультативные гетероферментативные
лактобациллы (ФГЕЛ), в эту группу входит вид L. plantarum и бетабактерии - облигатные
гетероферментативные лактобациллы (ОГЕЛ). Лактобациллы
L. fermentum и L.casei - среди
составляющих эту группу видов. Комплексный препарат должен включать представителей всех
физиологических групп. Примером является Казахстанский пробиотик «Плантафермин». Такой
микроэкологический подход позволяет повысить эффективность пробиотикотерапии при
дисбактериозах. Среди отобранных штаммов к группе ОГОЛ относится L.acidophilus АА-1R, Этот вид,
как указывалось выше, составляет основу многих фармабиотиков. К группе ФГЕЛ относится штамм
L.plantarum АР-1R, этот вид входит в состав широко известного препарата «Лактобактерин». Виды
лактобацилл, такие как L.fermentum и L.casei, входящие в группу ОГЕЛ, в составе пробиотических
препаратов используются значительно реже, хотя по своим метаболическим особенностям они имеют
сходный путь метаболизма с бифидобактериями. Последнее выглядит достаточно привлекательно с
точки зрения возможности замены бифидобактерий в комплексных препаратах на виды, входящие в
группу ОГЕЛ, что может упростить производственный процесс, поскольку лактобациллы можно
выращивать на одной питательной среде. Вместе с тем, используемые в работе штаммы,
116
принадлежащие к группе ОГЕЛ – LK-7 и АК-2R обладают схожими антагонистическими
особенностями, поэтому представляется обоснованным включение в композицию лишь одного из этих
двух штаммов.
Таким образом, для разработки препарата предлагаются два варианта бактериального
консорциума: №2 - АА-1R+АР-1R+АК-2R и №3 – АА-1R+АР-1R+LK7. Из этих двух композиций одну
наиболее перспективную, используя при этом такую технологическию характеристику, как накопление
биомассы.
Уровень накопления биомассы является определяющим технологическим параметром,
характеризующим культуру лактобактерий и влияющим на количество жизнеспособных клеток в дозе
препарата. Для культивирования использовали казеиново-дрожжевую среду (КДС) традиционно
применяемую в производстве лактосодержащих пробиотиков . Высокие ростовые качества казеиноводрожжевой среды объясняются рациональным подбором питательных веществ.
Глубинное культивирование лактобактерий проводили при температуре (37±1)°С в условиях
постоянного перемешивания, продолжительность культивирования составляла 10-12 ч. Доза
вносимого инокулята составляла 10% от объема питательной среды. В процессе культивирования с
помощью 10% раствора аммиака поддерживали рН среды на уровне 5,5-6,0. В качестве углеводной
добавки использовали 40% раствор глюкозы.
Оптическую плотность бактериальных культур в процессе роста определяли с помощью
фотоэлектроколориметра (кювета-1 мм, длина волны – 540 нм), пробу бактериальной взвеси перед
измерением разводили 0,9 % раствором натрия хлорида в соотношении 1:1.
Оказалось, что накопление биомассы у штамма LK-7 значительно ниже, чем у остальных
штаммов. В связи с этим для комплексного препарата была выбрана бактериальная композиция
состоящая из штаммов AА-1R + AР-1R + АК-2R.
При исследовании характера взаимоотношений между отдельными видами лактобацилл,
входящих в состав комбинации для нового пробиотика, было установлено существование симбиоза
между ними, выражавшееся в усилении антагонистической активности. Антагонистические свойства
штаммов, входящих в комбинированный препарат исследовали с применением прямого совместного
культивирования на плотной питательной среде (таблица 3).
Таблица 3 - Антагонистическая активность пробиотической компоции
Штаммы
Зона задержки роста, мм
Salmon Eschercihia
Shigel Proteus
Staphylococcus
ella
coli 157
la sonnei
vulgaris 177 aureus
typhimurium
177б
S60
59-60
АА-1R
15±2,0
12±1,0
16±1,1
13±1,5
10±1,1
АР-1R
10±1,0
8±0,4
7±0,8
11±1,7
8±0,6
AK-2R
8±0,5
6±0,7
10±0,7
8±0,7
15±0,5
комплекс
17±2,2
15±0,9
16±1,2
15±0,9
18±1,6
Can
dida
albicans
KAA-88
0
10±1,3
0
12±1,8
Использование штаммов в композиции увеличивало их антагонистическую активность против
микроорганизмов-мишеней, кроме того, эта активность проявлялась теперь и в отношении как
грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов. Комплекс способен подавлять также
и грибки рода Candida. То есть объединение штаммов лактобацилл в консорциум позволяет расширить
спектр биологической активности будущего препарата.
В естественных средах обитания микроорганизмы находятся в условиях смешанных микробных
популяций, где они вступают различного рода взаимоотношения друг с другом. Появляются данные,
свидетельствующие о возможных изменениях адгезии микроорганизмов в этих условиях. Так, под
влиянием одних микроорганизмов цитадгезия других может снижаться. Такое явление объяснимо либо
формированием микробного барьера на поверхности клеток макроорганизма, либо конкуренцией за
рецепторы для адгезинов. Иногда, наоборот цитадгезия микроорганизмов может усиливаться. Поэтому
при создании бактериальных препаратов необходимо проведение исследований по изучению
адгезивных свойств исследуемой комбинации лактобацилл в условиях смешанных микробных
популяций. В работе использовали культуры стафилококков, сальмонелл, кандид и бифидобактерий.
Исследования проводили параллельно при двух различных соотношениях лактобацилл и тест-культур
0,1:1; 1:1. В качестве контроля использовали суспензии отдельных микроорганизмов в концентрациях,
соответствовавших их концентрации в опытном образце. Результаты по изучению адгезивных свойств
117
Контроль
bifidum 701
1:1
Bifidobacterium
Candida
albicans
Salmonella
aureus
thyphimurium
0,1:1
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Staphilococcus
Средний показатель адгезивности
исследуемой культуры лактобацилл в условиях смешанных микробных популяций представлены на
рисунке 1.
Рисунок 1 – Оценка адгезивных свойств тест-штаммов после культивирования с пробиотической
композицией
В смешанных популяциях лактобациллы существенно снижали цитадгезию стафилококков при
всех изученных соотношениях. Так, например средний показатель адгезии стафилококков в контроле
был равен 4,1 в опытных вариантах при соотношении лактобацилл и стафилококков 0,1:1; 1:1 он был
равен 2,1; 1,0 соответственно. Аналогичные результаты были получены в смешанных популяциях
лактобацилл и кандид. При соотношении изучаемых лактобацилл с кандидами в соотношении 0,1:1;
1:1 средний показатель цитадгезии кандид снижался от 2,7 до 0,9. Контроль, при этом составлял 4,5
единицы. Отметим, что СПА сальмонелл был равен 3, а в условиях смешанных популяций при
соотношении лактобацилл и сальмонеллами 0,1:1; 1:1 этот показатель у данной тест-культуры
снижался и был равен соответственно 2; 0,5. Цитадгезия бифидобактерий в смешанных популяциях
оставалась на уровне контроля во всех изученных вариантах.
Поскольку совместное применение трехкомпонентной пробиотической композиции снижает
цитадгезию таких культур, как S.typhimurium, S.aureus и C.albicans, не изменяя при этом цитадгезии
бифидобактерий, совместное использование штаммов в композиции позволяет существенно снижать
адгезивные свойства патогенных и условно-патогенных бактерий.
Таким образом, полученная пробиотическая композиция обладает биосовместимостью, а
объединение штаммов лактобацилл в композизию позволяет расширить спектр и уровень их
антагонистической активности.
1 Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Микрофлора человека и животных и
ее функции. – Грантъ. - 1998. – Т.1. – 280 с.
2 Михайлова, Т.Л., Калинская Т.Ю., Румянцев В.Г. Биопрепараты и пищевые добавки в коррекции дисбактериоза //
Рос. журн. гастроэнтерол, гепатол, колопроктол. – 1999. - Т.9, №3. - С. 67-70.
3 Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety // Am. J. of Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 465-470.
4 Dunne C., O`Mahony L., Murphy L. et al. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with
in vivo findings // American Journals of Clinic Nutrition. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 386-392.
5 Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы
питания. – 1999. - №2. – С. 32-40.
6 Ганина В.И., Лысенко А.М., Гурьева Ю.В., Калинина Н.Ф. Изучение антагонистической активности и
идентификация бифидобактерий и молочнокислых палочек, рекомендуемых для получения продуктов лечебнопрофилактического назначения и пробиотиков // Биотехнология. – 1999. – № 2. – С. 15-21.
7 Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и
инфекционные болезни. – 2004. - № 6. – С. 37-39.
8 Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов
// Лаб. дело. – 1986. - № 4. – С. 211-212.
9 Гизатулина С.С., Биргер М.О., Кулинич Л.И., Фиш Н.Г., Мазитова О.П., Бирюкова Н.В. Способ оценки состояния
микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных бактерий и типу адгезинов // ЖМЭИ. – 1991. – № 4. – С.
21-23.
10 Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // ЖМЭИ. – 2003. - № 3. – С.
109-113.
11 Parente E., Ricciardi A. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol.
Biotechnol. – 1999. – Vol. 52. – P. 628-638.
118
12 Коваленко Н.К., Подгорский В.С., Касумова С.А. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителию различных
полостей организма человека // Микробиол. журн. – 2004. – Т. 66, №4. – С. 62-68.
***
Биологиялық жəне технологиялық лактобацилла штаммдарының сəйкестілігі анықталады. Үш штаммнан құралатын
композиция L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1 жасалынды. Композицияға үш штамм кірді, олар
антагонисттік бейсенділігімен ерекшеленеді. Пробиотикалық консорциум қабілеттілігін кеңейтеді.
***
In the result of doing work has appointed determinant biological and technological compatibly of 3 lactobacillus strains. Was
composed the composition of 3 lactobacillus strains: composition L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1.
Strains of which differentiated for antagonistic activity was extensions in composition. It extend spectrum of consortium probiotical
effect.
Р.К. Сыдыкбекова1, М.Т. Каргаева2, М.Х. Шигаева1, Т.Д. Мукашева1, Р.Ж. Бержанова1,
Л.В. Игнатова1, Е.В. Бражникова2
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В ЦЕЛИННЫХ ПОЧВАХ
РАВНИННОЙ ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА
(1 КазНУ им. аль-Фараби, факультет биологии и биотехнологии, кафедра биотехнология, 2НИИ
проблем биологии и биотехнологии, г. Алматы.)
В работе изучены распределение грамположительных бактерий в целинных почвах равнинной территории
Казахстана. Видовая структура грамположительных бактерий основных типов почв Казахстана была разнообразна.
Во всех типах почв доминировали представители бактерий рода Bacillus и Rhodococcus. В серобурых пустынных почв
Казахстана доминировали виды Bас. megaterium, Bac mycoides, Rh. roseus. В бурой пустынной, светло и средне
каштановых почвах в большом количестве обнаружены виды Bac. мegaterium и Rh. erythropolis, в
темнокаштановой почве Bас. megaterium и Rh. equi, а в черноземах доминировали Rh. erythropolis, Rh.
aetherevorans, Rh. Baikonurensis, Bас. мegaterium.
Интерес к изучению микробных сообществ почв в значительной степени обусловлен их ролью в
биогеохимических циклах элементов, сохранении питательных ресурсов в пределах экосистемы и
формировании плодородия почв. Для того чтобы понять функционирование почвы как системы,
необходимо знание, как количественной характеристики микробного сообщества, так и качественной,
отражающей биоразнообразия почвенной микробиоты [1,2]. Традиционно, для характеристики состава
микробных сообществ используются микробиологические методы, предполагающие получение чистых
культур микроорганизмов с последующей микробиологической и биохимической характеристикой [3].
Почва — главный резервуар и естественная среда обитания микроорганизмов, в том числе
бактерий. Большое число бактерий, представляющих обособленные группы характеризующихся
различными типами метаболизма, было выделено в течение многих лет из различных почв. Среди
почвенных бактерий наибольшее значение имеют грамположительные бактерии, которые активно
участвуют в деструкции различных веществ и сохранении плодородия почв [4-6].
Исследование бактериального разнообразия разных типов почв, представляет интерес, как для
фундаментальной микробиологии, так и для решения биотехнологических задач. Однако до сих пор
нет целостной картины распределения бактерий в почвах на территории Казахстана. Поэтому целью
нашей исследований явилось оценка распределения грамположительных бактерий в целинных почвах
равнинной территории Казахстана.
Материалы и методы исследование.
Объектом исследования служили бактерий выделенные из разных типов почв Казахстана.
Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств бактерий
проводили общепринятыми методами, предложенными в руководствах [7].
Идентификацию проводили, используя определители для бактерий [8;9].
Результаты и обсуждение
Распределение бактерий в пределах почвенного профиля имеет общий характер, состоящий в
снижении плотности популяций по мере перехода от верхнего к нижним горизонтам. При переходе от
верхнего к нижним горизонтам уменьшается не только численность бактерий, но и их
таксономическое разнообразие. В бактериальном комплексе присутствуют, главным образом,
родококки, бациллы и нокардии. В их распределении по различным типам почв отмечена следующая
особенность: доминирующей группой являются грамположительные бактерии. Они представлены
аэробными кокками и палочками родов Mycobacterium, Rhodococcus, Kocuria (Micrococcus), с
преобладанием всех почвах споровых форм бактерий рода Bacillus.
Биоразнообразие бактерий рода Bacillus, изолированных из различных почв представлено
следующими видами: B. megaterium, Bacillus mycoides и Bacillus lentus (таблица 1, рисунок 1).
119
Bacillus megaterium
Bacillus mycoides
Bacillus lentus
Рисунок 1 - Морфология клеток бактерий рода Bacillus
По совокупности, полученных диагностических признаков на видовом уровне одним из
распространенных видов спорообразующих бактерий рода Bacillus является вид Bас. megaterium,
изолированный из различных почв Казахстана.
Бактерии, относящие к виду Bac. mycoides, были выделены из серобурой пустынной, бурой
пустынной светло-каштановой щебнистой почвы и чернозема южного. Выше названные представители
рода Bacillus являются основными протеолитиками и это свидетельствуют о деструкции органического
вещества белковой природы в почвах. Так же повсеместно, но в небольшом количестве были выделены
бактерии Bac. lentus
Были выделены культуры из различных типов почв, отнесенные к роду Rhodococcus. Бактерии
рода Rhodococcus играют важную роль в процессах почвообразования, в обогащении биоценозов
витаминами и другими физиологически активными соединениями. Учитывая их физиологобиохимические признаки, они отнесены к видам Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh. baikonurensis
(таблица 2, рисунок 3). Наибольшее количество представителей бактерий рода Rhodococcus
встречалось на глубине 10 -20 см, и заметно уменьшалось на глубине 20-30 см.
Среди них во всех почвах преобладали бактерии Rh. erythropolis, Rh. equi и Rh. roseus. К числу
редко встречающихся видов относился Rh. ruber, который был обнаружен только в темнокаштановой, карбонатной почве, Акмолинской области, Ерейментауского района.
Разнообразие бактерий рода Mycobacterium, выделенных из различных почв Казахстана,
представлено следующими видами: Mycobacterium agri и Mycobacterium thermoresistible (рисунок 4,
таблица 2).
Таблица 1 - Распределение бактерий рода Bacillus в почвах различных типов
Типы почв
в % к общему числу родов бактерий
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus lentus
megaterium
mycoides
mesentericus
Серобурая пустынная,
15,2
8,2
2,3
Алматинская область
Серобурая пустынная,
10,1
3,2
Карагандинская область
Серобурая пустынная,
14,2
4,5
Жамбылская область
Бурая пустынная,
11,2
5,6
2,1
Карагандинская область
Светло-каштановая, щебнистая,
1,2
2,3
2,1
Карагандинская область
Среднекаштановая,
2,3
1,8
Карагандинская обл.
Темно-каштановая, карбонатная,
4,2
1,1
Акмолинская область,
Жаркаинский район
Темно-каштановая, карбонатная,
5,6
3,2
120
Акмолинская область,
Ерейментауский район
Чернозем обыкновенный,
Северо-казахстанская область
Чернозем обыкновенный,
Акмолинская область,
Зерендинский район
Чернозем южный Костанайская
область
2,4
-
-
-
5,2
4,5
-
-
3,4
2,3
-
-
Во всех образцах в незначительном количестве обнаружены кокковидные бактерии, морфология
которых не изменялась в зависимости от возраста культуры (рисунок 2). Они отнесены к роду Kocuria
а по совокупности физиолого-биохимических признаков отнесены к видам: Kocuria rosea, Kocuria
sp. и Kocuria sp. (рисунок 2, таблица 2 ).
Kocuria rosea
Kocuria sp.
Kocuria sp.
Рисунок 2 - Морфология клеток бактерий рода Kocuria
Серобурая пустынная,
Алматинская область
Серобурая пустынная,
Карагандинская область
Серобурая пустынная,
Жамбылская область
Бурая пустынная,
Карагандинская область
Светло-каштановая, щебнистая,
Карагандинская обл.
Среднекаштановая,
Карагандинская область
Темно-каштановая,
карбонатная, Акмолинская
область, Жаркаинский район
Темно-каштановая,
Kocuria sp.
Kocuria sp.
Kocuria rosea
Mycobacterium
thermoresistible
Mycobacterium agri
Rh. baikonurensis
Rhodococcus equi
Rh. aetherevorans
Rhodococcus
erythropolis
Таблица 2 - Распределение видов бактерий родов Rhodococcus,Mycobacterium и Kocuria в почвах
различных типов
Типы почв
в % к общему числу родов бактерий
5,6
6,8
2,9
-
2,3
-
1,2
1,5
1,2
3,4
5,3
4,2
-
3,2
2,9
0,5
0,6
0,5
4,6
4,9
3,5
-
-
-
1,5
0,9
1,5
4,6
3,5
2,9
-
-
2,4
0,6
0,6
0,9
3,9
2,9
4,2
-
1,7
-
0,9
0,3
1,1
2,3
1,9
7,2
-
-
-
1,1
1,2
0,9
2,9
1,2
2,9
-
-
-
0,6
0,5
0,9
4,2
3,9
4,6
3,2
2,1
-
0,3
1,5
0,6
121
карбонатная, Акмолинская
область, Ерейментауский район
Чернозем обыкновенный,
Северо-казахстанская область
Чернозем обыкновенный,
Акмолинская область,
Зерендинский район
Чернозем
южный,
Костанайская область
Rhodococcus erythropolis
7,2
4,6
3,9
-
-
2,1
1,2
0,6
0,3
3,2
4,3
3,9
-
-
1,8
1,5
0,9
1,2
6,8
4,9
4,6
-
1,2
1,6
1,2
1,1
0,9
Rh. aetherevorans,
Rh. baikonurensis
Рисунок 3 - Морфология клеток бактерий рода Rhodococcus
Mycobacterium agri
Mycobacterium thermoresistible
Рисунок 4 - Морфология клеток бактерий рода Mycobacterium
Согласно данным литературы, в почвах Казахстана наиболее часто встречаются представители
рода Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Pseudomonas и Azotobacter [6]. Результаты наших
исследований показали что, видовая структура грамположительных бактерий различалось по принципу
доминирования. Во всех почвенных образцах доминировали представители бактерий рода Bacillus и
Rhodococcus. По степени доминирования бактерий в почвенных образцах Казахстана можно выстроить
следующий ряд: Bacillus → Rhodococcus → Kocuria → Mycobacterium.
Таким образом, в серобурой пустынной почве доминировали виды Bас. megaterium, Bac
mycoides, Rh. aetherevorans. В бурой пустынной, светло и средне каштановых почвах в большом
количестве обнаружены виды Bac. megaterium и Rh. erythropolis, в темнокаштановой почве Bас.
megaterium и Rh. baikonurensis, а в черноземах доминировали Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Bас.
мegaterium .
1. Структурно-функциональная роль почв и почвенной биоты в биосфере // Под ред. Г.В.Добровольского. М.: Наука,
2003. С. 364.
2. Полянская Л.М., Свешникова Л.М. Структура микробной биомассы окультуренных почв (на примере почв
Владимирской области) // Перспективы развития почвенной биологии. М.: Изд-во МГУ, 2001. С. 249-265.
3. Гумеров В.М., Марданов А.В., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., раввин Н.В. Молекулярный анализ
биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, Калдера Узон, Камчатка // Микробиология, 2011. Т. 80. - № 2. – С.
258-265.
4. Заварзин Г.А. Изучение микробного разнообразия в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского //
Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 598-612.
5. Bysov B.A., Dobrovolskaja Т.С, Chernjakovskaja T.F., Zenova G.M. Bacterial communities associated with soil diplopods
// Pedobiologia. 40. 1996.I.
122
6. O.A. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / Киев: Наук,
думка, 1985. -336 с.).
7. Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов, Е.А. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 372с.
8. Bergey's manual of Systematic Bacteroilogy. Ist. ed . / Eds. A.Balows et al .- V1-4. Baltimore, 1984, 986 р.
9. Определитель Берджи / под. Ред. Дж.Хоулта, Н. Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. М., Мир. 1997. 1, 2 Т.
***
Жұмыста грам оң бактериялардың Қазақстанның жазық дала аймақтарының тыңайтылған топырақтарында
таралуы зерттелген. Қазақстанның əртүрлі топырақтарында грам оң бактериялардың түрлік құрылымы əртүрлі болды.
Барлық топырақтарда Bacillus жəне Rhodococcus туыстарының өкілдері басым болды. Қазақстанның сұрғылт
топырақтарында Bас. megaterium, Bac mycoides, Rh. Aetherevorans басым болды. Шөлейттің қызыл-қоңыр топырағында, ашық
жəне орташы қызғылт-сары топырақтарында Bac. мegaterium жəне Rh. erythropolis көп мөлшерде табылды, қызғылтқоңыр топырақтарда Bас. megaterium жəне Rh. baikonurensis, қара топырақтарда Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh.
baikonurensis, Bас. мegaterium басым болды.
***
The article was studied the distribution of gram-positive bacteria in the virgin soils of the plains in Kazakhstan. The
specific structure of gram-positive bacteria, the major soil types in Kazakhstan has been varied. In all types of soil bacteria,
dominated by representatives of the genus Bacillus and Rhodococcus . In the gray-brown desert soils dominated by species of
the Kazakhstan Bас. megaterium, Bac mycoides and Rh. aetherevorans. In the desert brown, light brown to medium soils in a large
number of spesies found Bac. мegaterium и Rh. baikonurensis, and the black earth was dominated by Rh. erythropolis, Rh.
aetherevorans, Rh. Baikonurensis, Bас. мegaterium.
УДК 576.154.36
О.Н. Шемшура
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИТИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
У ГРИБОВ АНТАГОНИСТОВ
(Институт микробиологии и вирусологии РГП «ЦБИ» МОН РК)
В данной работе представлены результаты исследования хитинолитической
штаммов микроскопических грибов, обладающих антагонистической активностью.
активности наиболее активных
Хитин, состоящий из остатков N-ацетил-B-D-глюкозамина, соединенный 1,4- B-связями,
является одним из наиболее распространенных полисахаридов на нашей планете. Хитин входит в
состав покровных тканей членистоногих, а также клеточных стенок грибов и бактерий [1].
Микопаразитическая активность грибов-антагонистов может быть обусловлена синтезом
литических ферментов, способных к гидролизу клеточной стенки фитопатогенов и хитиновых
покровов насекомых – вредителей. В связи с этим, наличие хитинолитической активности у
исследуемых штаммов, можно использовать в качестве способов отбора перспективных культур
микроорганизмов для биоконтроля за патогенами. Ранее была установлена антагонистическая
активность для ряда штаммов микроскопических грибов в отношении различных патогенов и
вредителей [3-7], а также ее взаимосвязь с синтезом биологически активных соединений, таких как
алкалоиды [8-9], аминокислоты [10], ферменты [11].
Материалы и методы.
В работе использованы грибы родов Penicillium (штаммы 947, 340, 7N), Aspergillus (штаммы 127,
6М, 140), Trichoderma (штаммы F-1, ANT, TX), Beauveria (штамм ВВ).
Споры грибов смывали с агаровых сред в колбы объемом 100 мл со средой Чапека.
Инкубировали в течение 4 суток, затем грибную массу гомогенизировали и переносили в колбы
объемом 250 мл, содержащих по 150 мл среды Чапека, и культивировали в течение 17 суток.
Мицелий разрушали замораживанием-оттаиванием, с последующим растиранием в ступке с
кварцевым песком. Белки экстрагировали 0,1М фосфатным буфером (pH=7,1) в течение ночи при +40С.
Экстракт отделяли фильтрованием с помощью бумажного и мембранного фильтров, насыщали
сульфатом аммония до 65% и оставляли на ночь при +40С. Осадок (белки) отделяли
центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут, растворяли в дистиллированной воде и
диализировали в течение ночи против 0,1М фосфатного буфера pH=7,1.
Культуральную жидкость каждой пробы (по 120 мл) насыщали сульфатом аммония до 65% и
оставляли на ночь при +40С для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при
10000 об/мин в течение 20 минут, растворяли в дистиллированной воде и диализировали в течение
ночи против 0,1М фосфатного буфера pH=7,1.
В полученных ферментативных препаратах определяли белок по методу Лоури и др. [12] и
хитинолитическую активность (по расщеплению коллоидного хитина и образованию N-ацетил-Dглюкозамина).
123
Также проведено исследование накопления хитиназы в культуральной жидкости, определен
температурный оптимум и термостабильность хитиназы, выделенной из культуральной жидкости.
Результаты и обсуждение.
Из 10 исследуемых штаммов микроскопических грибов наибольшей хитинолитической
активностью обладал штамм F-1, причем активность в культуральной жидкости значительно
превышала таковую в мицелии. Кроме того, хитинолитическая активность выявлена у штаммов 7N и
ANT(эндо- и экзохитиназы). У штаммов 340 и 5M хитиназа была обнаружена лишь в мицелии.
Возможно, что при более длительном культивировании можно будет обнаружить и экзохитиназу. У
остальных штаммов данный фермент не выявлен.
Следует также отметить, что при длительном культивировании на среде Чапека, штаммы теряют
свою способность вырабатывать хитиназу. Возможно, необходимо подобрать более подходящую
среду, при культивировании на которой, грибы не будут терять своего свойства вырабатывать
фермент.
Исследована динамика накопления хитиназы в культуральной жидкости. Для исследования был
взят штамм Trichoderma viride F-1, обладающий наибольшей хитинолитической активностью.
Из литературы известно, что бактериальные клетки максимально синтезируют хитиназу на 4-7
сутки культивирования, а клетки актиномицетов на 1 сутки культивирования [2], наши исследования
показали, что ферментный комплекс гриба Trichoderma viride F-1 накапливается в культуральной
жидкости при длительном культивировании от 14 до 24 суток. При этом было установлено, что
максимальное накопление фермента происходит на 22-е сутки роста гриба (в этот период удельная
активность ферментного раствора составила 0,78 ед/мг, а активность в 1 мл – 0,74 ед), затем, начиная с
25 суток роста уровень фермента в культуральной жидкости значительно снижается (рис.1).
0 ,9
0 ,8
0 ,7
0 ,6
.т
к
а
.
д
Е
0 ,5
Уд. акт.
е д. /м г
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
12
14
16
18
20
22
25
У д .а кт . ед . /м г
26
0,1 7
0 ,2 1
0 ,34
0, 21
0 ,4 5
0 ,7 8
0 ,37
0, 24
Ак т . в 1 м л
0,1 4
0 ,2 7
0 ,25
0, 26
0, 8
0 ,7 4
0 ,51
0, 27
с утки
Рисунок 1. Динамика накопления хитиназы в культуральной жидкости гриба
Trichoderma viride F-1
Определение температурного оптимума хитиназы, выделенной из куьтуральной жидкости
штамма F-1, показало, что он находится в пределах 40-500С. Увеличение температуры инкубации
ведет к снижению активности ферментного раствора.
При исследовании термостабильности хитиназы, выделенной из культуральной жидкости
штамма F-1, исходная активность фермента в 1 мл составила 0,42 ЕД в 1 мл.
Установлено, что хитиназа штамма F-1 относительно термолабильна, она теряет свою
активность при температуре инкубации 700С, 800С за 15 мин и при температуре инкубации 500С, 600С
за 45 мин (рис.3). Для сравнения, бактериальная хитиназа теряла свою активность на 45% при
температуре 600С за 15 мин и полная инактивация фермента происходила за 3 часа [2].
Таким образом, наибольшая хитинолитическая активность отмечена
у штамма гриба
Trichoderma viride F-1, который характеризуется высоким антагонистическим действием на различные
фитопатогены и вредители растений. Следовательно, наряду с другими физилогически активными
124
соединениями, хитиназа обуславливает потенциальные возможности гриба в биоконтроле за
патогенными для сельскохозяйственных культур организмов.
Полученные характеристики препарата хитиназы гриба Trichoderma viride F-1, позволят в
дальнейшем разработать оптимальную схему его получения, очистки и проведения тестирований на
фитопатогенах и вредителях растений.
1. Безбородов А.М., Решетилова Н.А., Тиунова Н.А. в-Глюканазы микроорганизмов// Прикладная биохимия и
микробиология 1982.- Т.18. -В.6.- С.806-815.
2. Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А. Внеклеточная хитиназа Aeromonas liquefaciens // Прикладная биохимия и
микробиология. - 1976.- Т.12. - В.2. -С.238-242.
3. Бекмаханова Н.Е., Успанов А.К. Антибиотические свойства активных штаммов грибов, выделенных из ризосферы
сахарной свеклы //Труды ИМиВ АН КазССР. – Алма-Ата. - 1986. - Т.30. - С. 61-68.
4. Успанов А.К., Тулемисова К.А., Бекмаханова Н.Е. Антагонизм и гиперпаразитизм триходермы к фитопатогенным
грибам //Вестник АН КазССР. -1986. -№2. -С. 47-51.
5. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н. Скрининг высокоактивных штаммов-антагонистов, перспективных против
возбудителей риса. Известия НАН РК, серия биологическая. - 1997. - № 1. - С. 7-10.
6. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н., Разживин А.А. Поиск и изучение перспективных штаммов грибов Триходерма,
обладающих нематоцидными свойствами - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. - № 4. - C. 41-44.
7. Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Мазунина М.Н. Подбор питательных сред для усиления антагонистической
активности микроскопических грибов // Биотехнологии – 2000. Тезисы докл.– Пущино. – 2000. – С.70
8. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н. Токсическое действие алкалоидов гриба Aspergillus niger 8 на паразитические
нематоды. - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. -№ 5-6. - С.34-40.
9. Bekmakhanova N.E., Shemshura O.N. Alcaloids of microscopic fungi for plant protection // thesis of poster declaration at
the International conference “Bioactive Fungal Metabolites” – Impact and Exploitation” Wales Swansea (UK). - 2001. -P.49.
10. Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Джакибаева Г.Т., Мазунина М.Н., Султанкулова К.Т. Синтез аминокислот и его
взаимосвязь с антагонистической активностью микроскопических грибов // Известия МН-АН РК, серия биологическая. 2002. - №1. - С.84-90.
11. Шемшура О.Н., Джакибаева Г.Т., Бекмаханова Н.Е. Сравнительное изучение ферментативной способности
штаммов-антагонистов из рода Trichoderma, Penicillium, Aspergillu. - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. -№ 1.
- С. 73-77.
12. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., et al. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951.V. 193. - №1. - P. 265-275.
***
Берілген жұмыстың зерттеу нəтижесінде хитинологиялық белсенділігі жоғары микроскопиялық саңырауқұлақ ол
антагонистік белсенділік қасиетке ие.
***
This paper presents the results of the study chitinolytic activity of the most active strains of microscopic fungi having
antagonistic activity
УДК 635.21:632.3
О.Н. Шемшура, Н.Е. Бекмаханова, М.Н. Мазунина
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕМАТОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ГРИБА
ASPERGILLUS SP.
(Институт микробиологии и вирусологии РГП «ЦБИ» МОН РК )
Установлена нематостатическая активность белок содержащих компонентов гриба Aspergillus sp,.
проявляющаяся в зимний период культивировании гриба. Определено содержание белка в исследуемых образцах и его
аминокислотный состав.
Мировые потери сельскохозяйственной продукции от нематод составляют в среднем 7-10%. В
нашей стране ощутимый ущерб сельскому хозяйству наносят овсяная, картофельная, свекловичная,
галловые и другие нематоды. В теплицах галловые нематоды могут вызывать до 50% потерь
продукции томатов.
Существующие в настоящее время подходы и методы защиты от нематод либо не обладают
достаточной эффективностью, либо имеют ограничения, связанные с токсичностью применяемых
химических нематоцидов.
В последние годы значительно возрос интерес к фундаментальным исследованиям в области
экспериментальной микологии, а также использованию продуктов синтеза микроскопических грибов в
сельском хозяйстве, медицине, пищевой промышленности и др. отраслях народного хозяйства.
В процессе эволюции растения, в том числе и микроскопические грибы, выработали механизмы,
позволяющие им успешно противостоять неблагоприятным воздействиям, в том числе, различного
125
рода патогенным организмам. Важнейшими компонентами подавляющего большинства таких
механизмов являются вещества белковой природы [1-5].
Целью данной работы явилось исследование нематостатических свойств белок содержащих
компонентов, выделенных из мицелия микроскопического гриба Aspergillus sp.
Материалы и методы
В работе использовали микроскопический гриб Aspergillus sp. Культивирование гриба
осуществляли в течение 5-ти суток на жидкой питательной среде глубинным способом в условиях
качалки при температуре 280С.
Состав питательной среды: (г/л): глюкоза – 50; пептон -10,0; соевая мука – 5,0; KNO3 -2,0;
MgSO4.7H2O –0,5; CaCl2 – 0,1; вода дистиллированная pH –6,2.
Мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через бумажной фильтр.
Для фракционирования белковых компонентов из мицелия использовали 2 метода: Baker F.E. e.a.
(1947) и Boivin A., Mesrobeanu L. (1938) [6-7].
Cодержание белка в белковых пробах определяли методом Bradford, 1976 [8]. Аминокислотный
состав белковых проб
проводили методом газохроматографии (ГХ). Для исследования
нематостатической активности белковых компонентов, выделенных из мицелия гриба Aspergillus sp.
использовали нематоды Ditylenchus destrucnor.
Компоненты, вызывающие гибель менее 50% нематод в течение 3-х суток, или действие их будет
временным (нематоды после переноса в воду восстановят активность) отнесены к компонентам
мягкого (нематистатического) действия.
Результаты и обсуждение
При фракционирование белковых компонентов различными методами получено 43 образца.
Тестирование на нематодах Ditylenchus destrucnor белковых фракций показало, что большинство из
них не оказывают никакого влияния на них.
Нематостатическое действие отмечено у 2-х белковых фракций: М1 и М2, полученных по методу
Буавена-Месробиана. Данные фракции были исследованы в отношении нематод при различных
концентрациях. Результаты исследований представлены в таблице 1. Для белковой фракции М1 потеря
активности нематод наблюдалась через 72 часа после обработки при всех концентрациях и составила
от 12,8% до 56%, однако через 24 часа произошло частичное восстановление активности в варианте с
концентрацией 50 мг/мл и полное восстановление активности при более низких концентрациях.
Оставшиеся 47,6% неактивных нематод в варианте с концентрацией 50 мг/мл, после переноса в воду
полностью восстановили свою активность. Для белковой фракции М2 через 72 часа после обработки
все нематоды были активны. Только через 96 часов после обработки при концентрации 50 мг/мл
отмечена потеря активности у 44,7% нематод. Очень слабое действие на нематоды оказывали
концентрации 25 мг/мл и 10 мг/мл, при которых потеря активности составила 9,1% и 8,3%
соответственно. Концентрации 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 1 мг/мл на активность нематод никакого
влияния не оказывали. При переносе неактивных нематод в воду наблюдалось полное восстановление
их активности. При исследовании белковых образцов была выявлена зависимость нематостатической
активности от культивирования гриба в различные сезоны. Оба белковых образца М1 и М2 проявляют
нематостатическую активность в период культивирования гриба в зимний период. В весенний период
активность присутствовала только у образца М1, которая полностью отсутствовала в летний период, в
то время как образец М2, проявлял незначительную активность. В осенний период нематостатическая
активность образца М1 была минимальной, а у образца М2 она полностью отсутствовала. На рисунке 1
показано сравнительное нематостатическое действие белковых образцов при одинаковой
концентрации 50 мг/мл, полученных из мицелия в различные сроки роста гриба.
На диаграмме видно, что образцы М1 и М2 влияют на активность нематод Ditylenchus destrucnor
в большей степени в зимний период. Нематостатическое действие на Ditylenchus destrucnor полностью
отсутствует у образца М1 в летний период и у образца М2 в весенний и осенний периоды роста гриба.
Было установлено, что исследуемые образцы М1 и М2 представляют собой протеинполисахаридный комплекс, в котором содержание белка составило 12,5 мкг в 1 мг сухого вещества
для М1 и 37,5 мкг в 1 мг сухого вещества для М2. Определён аминокислотный состав белковых
компонентов М1 и М2 (Табл.1).
126
Рисунок 1. Изменение нематостатической активности белковых образцов гриба Aspergillus sp. в
зависимости от сезонного роста гриба
Таблица – 1 Аминокислотный состав белковых компонентов гриба Aspergillus sp.
№
п/п
Наименование
аминокислот
Формулы аминокислот*
1
2
3
1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Триптофан
Лизин
Аргинин
2
Гистидин
Тирозин
Фенилаланин
Цистин
Метионин
Треонин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Аланин
Глицин
С11Н12N2O2
H2N(CH2)4CH(NH2)CO2H
NH=C(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H
3
C3H3N2CH2CH(NH2)CO2H
HOC6H4CH2CH(NH2)CO2H
C6H5CH2CH(NH2)CO2H
HOOCCH(NH2) CH2SSCH2CH(NH2) CO2H
CH3SCH2CH2CH(NH2) CO2H
CH3CH(OH)CH(NH2) CO2H
(CH3)CHCH(NH2) CO2H
CH3CH2CH(CH3)CH(NH2) CO2H
(CH3)2CHCH2CH(NH2) CO2H
С3Н7NО2
(NH2)CH2CO2H
Концентрация
аминокислот, мг/100 г
М1
М2
42
60
74
85
80
76
4
5
64
75
35
44
72
69
12
20
32
62
60
90
55
98
28
58
68
112
следы
0
5
следы
Газохроматографический анализ белковых фракций М1 и М2 показал:
1. Качественный состав фракций М1 и М2 не различается;
2. Наблюдаются незначительные расхождения в количественном содержании лизина,
аргинина, гистидина, тирозина и фенилаланина в составе фракций М1 и М2;
3. В составе фракции М2 присутствуют примерно в 2 раза больше лейцина, валина,
изолейцина, метионина, цистина по сравнению с фракцией М1;
4. В составе фракции М2 присутствуют примерно в 1,5 раза больше треонина и триптофана.
5. Фракция М2 содержит более высокие концентрации аминокислот.
Таким образом, установлено, что нематостатическая активность обоих белок содержащих
компонентов гриба Aspergillus sp. проявляется в зимний период культивировании гриба, при этом по
содержанию белка, фракция М2 более чем в 2 раза превосходит фракцию М2 и содержит более
высокие концентрации аминокислот.
1. Калунянц К.А., Дорохов В.В., Лосякова Л.С. и др. Направленный биосинтез ферментов микроорганизмами //Труды
ВНИИ синтезбелок. М. 1974.- В.2. – С.220.
2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа. – 1980. – С.272.
3. Караваева Н.Н., Садыходжаева Н.Г. Получение высоко устойчивого препарата протеолитического фермента гриба
Torula thermophila при культивировании в ферментере //прикладная биохимия и микробиология. – 1985. – Т.21. -№1. – С.2427.
4. Антипова Л.В., Насонова Л.В. Исследование возможности получения белкового концентрата из
кератинсодержащего сырья методом микробной ферментации //Тез.докл. 2 науч.-практ. Конф. «Разработка и внедрение
безотходных технологий, использование вторичных ресурсов». Киров. -1998. – С.80-81.
127
5. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений// Успехи
биологической химии. – 2002. - Т. 42. - С. 78-90.
6. Baker F.E., Sommer H., Mayer K.F. e.a. Antigenic structure of P. Pestis and the isolation of a crystalline.// Soc. exptl. boil.
and med. – 1947. - T. 64. - № 6. - P. 139-141.
7. Boivin A., Mesrobeanu L. Recherches sur les antigenes soma-tigyes du bacolle typhigue // Compt. rev. soc. Boil. 1938. - T. 12. - № 1. - P. 9 - 11.
8. Bradford A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein during binding//Analytical
Biochemistry. -1976.- Vol. 72. - P. 248-254
***
Немостатикалық ақуыздың белсенді компоненттері бар санырауқұлақ бекітілген. Aspergillus sp. Осы қыс мезгілі
саңырауқұлақ дамуында көрінеді. Зерттеу барысында зерттелетін үлгілерде ақуыз құрамы жəне оның аминқышқыл құрамы
табылған.
****
Nematostatic activity of the protein containing components of the fungus Aspergillus sp. manifested in the winter cultivation
was established. Protein content in the samples and its amino composition was determined.
Г.Н. Чуркина
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЮЖНЫХ ЧЕРНОЗЕМОВ В ПЛОДОСМЕННЫХ
СЕВООБОРОТАХ
(Научно-производственный центр зернового хозяйства им. А.И. Бараева)
В статье приводятся результаты исследований по изучению влияния различных сельскохозяйственных культур на
микробоценоз почвы южных черноземов в плодосменных севооборотах. Моно возделывание пшеницы и пшеницы по
различным предшественникам в плодосменах вызывают высокое содержание азотсодержащих бактерий в почве, что
характеризует в посевах этих культур интенсивность процессов минерализации органического вещества на южных
черноземах.
Наиболее интересными и до настоящего времени малоизученными являются проблемы,
связанные с воздействием высших растений на микроорганизмы почвы. Поскольку растения не
способны перемещаться в пространстве, то они должны обеспечить оптимальные условия для своего
существования на одном месте: должны обладать способностью, защищаться, привлекать
необходимых для их жизнедеятельности организмы, ликвидировать конкурентов, активизировать и
регулировать некоторые процессы метаболизма с помощью других организмов, обитающих в почве.
Микрофлора использует корневые выделения, как источники питания, поэтому их концентрация на
поверхности корней снижается, что изменяет условия корневого питания растений. Метаболиты могут
оказывать влияние на другие организмы, в том числе и на почвенную микрофлору, в виде
ингибирования и токсического действия, в виде селекционирующего действия, в виде агентов,
стимулирующих рост и развитие компонентов ризопланы и ризосферы, в виде индукторов
морфогенеза у грибов и прокариот [1].
Плодосмен, в современном ресурсосберегающем земледелии предлагает не только строгое
чередование зерновых культур, многолетних трав и пропашных культур с различными агрономическими, физиологическими свойствами, но и предусматривает обязательное наличие культур почвоулучшателей, размещение которых по наиболее благоприятным предшественникам способствуют
высокой скорости разложения органических остатков, накоплению и использования питательных
веществ [2,3].
Исходя из этого, целью проведенных исследований было определения влияния сельскохозяйственных культур по различным предшественникам в плодосменных севооборотах при
ресурсосберегающих технологиях возделывания на формирование микробоценоза почвы южного
чернозема и в целом на плодородие почвы. Тренинги и микробиологические анализы проводили в
почвенных пробах, отобранных со стационаров с плодосменами и в посевах пшеницы по разным
предшественникам. Полученные результаты анализов за период 2009-2011гг, показали, что при
сравнении различных плодосменных севооборотов, высокая численность бактерий, ассимилирующих
минеральные и органические формы азота, наблюдается в бессменных посевах пшеницы с
применением удобрений и гербицидов (табл. 1).
Таблица 1- Распространения почвенных микроорганизмов в посевах пшеницы по различным
предшественникам в плодосменных севооборотах, млн./г почвы
Плодосменные
Бактерии, ассимилирующие
Почвенные
Целлюлозоразру
севообороты
различные формы азота
микромицеты шающие
микроорганизмы
органический
минеральный
128
Бессменная пшеница, без
гербицидов и удобрений
Бессменная пшеница с
гербицидами
Бессменная пшеница с
гербицидами и
удобрениями
Пшеница по овсу
Пшеница по кукурузе
2,1
7,8
6,8
86,6
1,8
7,6
7,1
99,0
2,8
13,4
4,3
99,1
2,1
2,4
8,7
12,1
6,0
6,8
108,9
96,8
В плодосменных севооборотах максимальное количество бактерий было в посевах пшеницы по
кукурузе и составило 12,1 млн. при посеве пшеницы по овсу -8,7 млн. клеток в 1г почвы. Высокое
содержание бактерий в почве под посевами этих культур характеризует интенсивность процессов
минерализации органического вещества. В почвенных процессах накопление бацилл усиливает
процессы, связанные с переработкой более трансформированного органического вещества, что в
конечном итоге приводит к накоплению органического вещества (гумуса) в почве. Низкая численность
бактерий отмечена при бессменном возделывании пшеницы без применения гербицидов количество
бактерий здесь находится в диапазоне 7,6 и 7,8 млн. в одном грамме почвы. При бессменном
возделывании пшеницы применение гербицидов и удобрений позволяет держать количество бактерий,
участвующих в превращениях азота на постоянном и стабильном уровне. Их численность варьирует в
пределах 2,8-13,4 млн. клеток в 1г почвы. По мере увеличения продолжительности бессменного
возделывания пшеницы происходит уменьшение доли бактерий рода Pseudomonas, а в севооборотах Mycobacterium. Это свидетельствует о том, что в почве монокультуры разложение органического
вещества находится на начальной стадии. Кроме того, отмечается некоторое уменьшение частоты
встречаемости Bac. mycoides, Bac. idosus, что указывает на снижение темпов минерализации
органических остатков в почве под бессменными посевами. Таким образом, бессменное возделывание
приводит к уменьшению видового разнообразия бактерий в почве. Однако это выражается не в
исчезновении каких-либо видов бактерий, а в уменьшении доли немногочисленных видов и
возрастании удельного веса доминирующих штаммов микроорганизмов данной группы. В
севооборотах с крупяными культурами лучшие условия для развития бактерий ассимилирующих
азотные формы складываются при возделывании гречихи в трехпольном плодосменном севообороте
(табл. 2).
Таблица
2Численность
почвенных
микроорганизмов
в
посевах
различных
сельскохозяйственных культур в плодосменных севооборотах, млн./г почвы
Плодосменные
Бактерии, ассимилирующие различные
Почвенные
Целлюлозора
севообороты
формы азота
микромицет
зрушающие
ы
органический
минеральный
Гречиха-пшеницаячмень
Просо-пшеница-ячмень
Горох-пшеница-ячмень
Ячмень-пшеница
Житняк-люцерна
Подсолнечникпшеница-пшеницаячмень
3,6
12,9
10,7
58,0
3,2
4,8
3,7
3,1
3,5
11,8
9,8
9,5
13,8
8,7
8,5
10,0
8,1
13,0
7,1
62,7
68,4
95,3
67,4
77,9
В посевах многолетних трав, биологические особенности корневой системы житняка и люцерны
в большей степени стимулируют развитие бактерий, чем горох и подсолнечник. По видовому составу
азотсодержащих микроорганизмов (на МПА и КАА) различий в севооборотах с различной ротацией не
наблюдалось. В посевах пшеницы и других сельскохозяйственных культур в плодосменных
севооборотах преобладают бактерии рода Pseudomonas, флюоресцирующие, пигментные и
микобактерии (на КАА). В составе бацилл (на МПА) доминируют группы, ассимилирующие
органические формы азота: Bac. Medaterium, Bac. Mesentericus и другие бактерии. Помимо указанного
состава в биоценоз входят спорообразующие бактерии, большая часть которых преобладает в активной
форме. Микроскопические грибы являются ксерофилами и способны развиваться в тех же условиях,
129
что и бактерии и актиномицеты. В почве развитие плесневых грибов обусловлено не только
влажностью, но и поступлением органического вещества, аэрации и температурой. Поэтому эта группа
микроорганизмов в большей степени, чем другие, сосредотачивается в пахотном слое. Большую роль в
изменении численности микроскопических грибов играют антагонистические взаимоотношения с
другими микробами в борьбе за источник питания. Микроскопические грибы способны разлагать в
почве белковые соединения, разрушают углеродсодержащие вещества, растительные остатки, хотя по
численному составу они занимают всего 0,1% от всего микробного населения. Часто в грибном
комплексе встречаются фитопатогенные виды грибов, вызывающие заболевания сельскохозяйственных культур. Большое количество микроскопических грибов наблюдается в посевах
житняка и люцерны, численность их составила 13,0 тыс. клеток в 1г почвы. При бессменном
возделывании зерновых культур максимум плесневых грибов встречается при выращивании
бессменной пшеницы, а применение удобрений и гербицидов в посевах подавляет развитие
микромицетов.
Выводы:
Исследования, проведенные в течение 2009-2011 гг. в посевах сельскохозяйственных культур по
различным предшественникам в плодосменах, показали, что высокая численность бактерий,
ассимилирующих минеральные и органические формы азота, наблюдается в посевах гречихи и смеси
трав житняка и люцерны в трехпольном зерновом севообороте. Максимальное количество этих
бактерий было отмечено и при бессменном посеве пшеницы с применением удобрений и гербицидов.
Высокое содержание азотсодержащих бактерий в почве под посевами этих культур характеризует
интенсивность процессов минерализации органического вещества.
Большое количество микроскопических грибов наблюдается в двухпольном севообороте при
посеве житняка и люцерны. При бессменном возделывании зерновых культур максимум плесневых
грибов встречается при выращивании бессменной пшеницы, а применение удобрений и гербицидов в
посевах подавляет развитие микромицетов. Микроскопические грибы способны разлагать в почве
белковые соединения, разрушают углеродсодержащие вещества, растительные остатки, но не всегда их
высокое содержание положительный факт, так как в грибном комплексе встречаются фитопатогенные
виды грибов, вызывающие заболевания сельскохозяйственных культур.
Интенсивно в плодосменных севооборотах происходит разрушение целлюлозы растительных
остатков, особенно при возделывании подсолнечника в четырехпольном севообороте.
1. Фрунзе Н.И. Почвенная микробная биомасса как резерв биогенных элементов // Агрохимия. 2005.- №9 - С.20-23.
2. Muir J.P. Dairy Compost, Variety, and Stand Age Effects on Kenaf Forage Yield, Nitrogen and Phosphorus Concentration,
and Uptake// Agron. J. 2001. -N 93. -1169-1173.
3. Сазонов С.Н., Манучарова Н.А., Горленко М.В., Терехов А.В., Умаров М.М. Оценка микробиологического
состояния дерново-подзолистой почвы, выведенной из сельскохозяйственного использования. //Почвоведение. 2004.- №3.С.373-377.
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Г.Қ. Абай, А.К. Ерназарова., Г.К. Кайырманова
ЛАСТАНҒАН АҒЫН СУЛАРДА КЕЗДЕСЕТІН ЦИАНОБАКТЕРИЯЛАРДЫ ЗЕРТТЕУ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті)
Комуналды қалдықтармен ластанған Қаламқас кен орнының ағын суынан Phormidium жəне Oscillatoria туыстарына
жататын 4 цианобактерия дақылдары бөлініп алынды. Осы цианобактериялардың қолайлы ортадағы клетка құрылымдары
туралы мəліметтер көрсетілген.
Ағын суларды тазалау əдістері ластағыштарды белсенді түрде ыдырата алатын микрофлораға
негізделеді. Биологиялық тоғандарда микроорганизмдер колониялары суда еркін таралады. Ыдырау
процестерін жүзеге асыру үшін қажетті оттегі су беті арқылы немесе фотосинтездеуші
микроорганизмдер, балдырлар арқылы еніп, табиғи жолмен суда ериді. Ағын суларды тазалау
тиімділігі фототрофты микроорганизмдері бар қосымша биологиялық тоғандар құру арқылы жүзеге
асады.
Цианобактериялар оксигенді жəне аноксигенді фотосинтез, гетеротрофты фотоассимиляция,
молекулалық азотты бекіту, күкірт қосылыстарын тотықтыру, көптеген органикалық субстратты
деструкциялау қабілеттіліктеріне жəне морфологиялық-биохимиялық, сонымен қатар физиологиялық
130
ерекшеліктеріне байланысты жер бетінде кеңінен таралған организмдер болып саналады. Бұл олардың
эволюциясының бастапқы кезеңдерінде қоршаған ортаның əр түрлі жағдайларына бейімделу
потенциалының жоғарылығын көрсетеді [1].
Қазіргі кезде қоршаған ортаны тазалауда микроорганизмдердің аралас дақылдарын қолдану
кеңінен таралуда. Осындай қауымдастықтардың негізі ретінде цианобактерияларды қолдану
деструкциялық процестерді жылдамдатып қана қоймай, əр түрлі микрофлорамен синтрофты қарымқатынасқа түсуіне байланысты жасанды, белгілі қасиеттерге ие қауымдастықтар құруға мүмкіндік
береді.
Цианобактериялардың əр түрлі ластағыштармен ластанған орталарда кездесуі жайлы көптеген
зерттеушілер жұмыстарында келтірілген. Кейбір зерттеушілердің жүргізген зерттеулері бойынша
ортаның ластану деңгейі көтерілген сайын цианобактериялардың да көбеюі артады [2, 3].
Цианобактериялардың морфологиялық өзгергіштіктерін зерттеу саласындағы көптеген зерттеу
жұмыстары нəтижесінде «жергілікті популяция» термині пайда болған, яғни табиғи субстраттардан
бөлініп алынған жəне дақылданатын табиғи популяция [4]. Себебі, əр ортаның ерекшеліктеріне
байланысты цианобактериялардың түрі мен қасиеттері ерекшеленуі мүмкін. Соған байланысты
жұмыстың мақсаты – ластанған орталардағы цианобактериялардың алуан түрлілігін зерттеу.
Зерттеу əдістері мен материалдар
Зерттеу объектісі ретінде – Қаламқас кен орнының маңындағы ауданның тазалау
құрылғыларының ағын суы пайдаланылды.
Ағын судың негізгі ластаушы көздері тұрмыстық – коммуналды қалдықтар болып келеді.
Цианобактерияларды дақылдау үшін жəне қолайлы қоректік ортаны таңдау үшін Заррука,
Громов №6 жəне BG-11 қоректік орталары қолданылды.
Цианобактериялардың жинақ дақылы жəне альгологиялық таза дақылдарын алу жалпылама
қабылданған əдістер арқылы жүзеге асырылды [5].
Цианобактериялардың идентификациялау үшін келесі анықтағышар қолданылды: Берги
анықтағышы жəне Орта Азияның көк-жасыл балдырларының анықтағышы [6, 7].
Цианобактериялардың морфологиясын зерттеу үшін Leiсa DMLS 2500 қолданылды.
Зерттеу нəтижелері
Қаламқас кен орнының ағын суларының Заррука ортасындағы жинақ дақылынан
цианобактериялардың 4 түрі бөлініп алынды: К1, К2, К3, К4. Осы цианобактериялардың қолайлы
ортадағы клетка құрылымдары зерттелінді (сурет 1).
К1 дақылының клеткасының трихомдарының түсі көк-жасыл, тік, жеке орналасқан, клетка
мөлшері 2,2-3,3– 1,21-2,9 мкм жəне соңғы клеткалары майысып немесе үшкірленбей тік болып келеді.
К2 дақылының морфологиялық ерекшеліктеріне моншақ тəріздес тізбектеліп бір түзудің бойында
орналасқандығы жатады. Клетка мөлшерінің диаметрі 1,21-2,97 мкм. К3 дақылы морфологиясы
бойынша трихомалары тік, клетка мөлшері 2,64-5-61 – 6,49-9,46 мкм, түсі - көк- жасыл, соңғы
клеткалары - үшкірленген жəне ілмек тəрізденіп майысқан. Ал, К4 дақылының трихомдары көк-жасыл,
соңғы клеткалары тік орналасқан, клетка мөлшері 2,3-4,9 - 1,6-2,7 (сурет 1).
Цианобактериялардың бір түрінің табиғи популяциялары таралған ортасына байланысты
құрылымдық-морфологиялық ерекшеліктерге ие болатыны белгілі, яғни экологиялық факторлардың
əсерінен трихомдар құрылымы, колониялық шырыш тығыздығы, вегетативті клеткалар мен трихомдар
пішінің өзгеруі мүмкін [1].
Бөлініп алынған цианобактериялық дақылдардың статикалық жағдайда құрылымын зерттеу
кезінде алгологиялық таза К1 дақылы өсуінің алғашқы тəуліктерінде қатты түйіршік түзе қалыптасады.
Түйіршіктің үлкеюіне байланысты цианобактерия клеткалары сұйықтық бетінде жұқа қабат түзе
дамиды. К2 дақылы құрылымы алғашқында шашыраңқы, экспоненциалды кезеңде мақта тəрізденіп
қалыптасады. К3 дақылының құрылымдық ерекшелігіне шар тəріздес өсінділер түзетіндігі жатады.
Қабырғалық өсу байқалады. Статикалық жағдайда К4 дақылы өскен кезде сұйықтықта дөңгелек өсінді
пайда болып, біркелкі перфорациялары бар жіпшелер түзіледі.
Цианобактерияларды дақылдауда кездесетін қиыншылықтардың біріне белсенді дақылды алу
ұзақтығы жатады. Клетканың барлық заттарын құру үшін цианобактерияларға қарапайым
бейорганикалық қосылыстардың минимумы қажет: көмірқышқыл газы, азоттың ең қарапайым түрлері,
минералды тұздар (фосфор, күкірт, магний, темір жəне микроэлементтер көздері), су. Белсенді
цианобактериялды дақылдарды алуда қоректік ортада биогенді элементтердің оптималді мөлшерінің
болуы негізгі фактор болып табылады. Кейбір зерттеушілердің мəліметтері бойынша
цианобактариялардың көп түрлерін өсіру үшін Заррука ортасы қолайлы болып табылады. Алайда,
131
кейбір зерттеушілердің жұмыстарында Громова №6 жəне BG-11 орталарын қолдану кезінде жақсы
нəтижелер алынған [8].
К1
К3
К2
К4
Сурет 1 - Цианобактериялардың морфологиялық ерекшеліктері
Бөлініп алынған цианобактерияларға қолайлы қоректік орта таңдау мақсатымен дақылдар
Заррука, Громова №6 жəне BG-11 қоректік орталарында өсіріліп, тəуліктік өзгерістері бақыланып,
салыстырма жүргізілді. Зерттеу нəтижелері көрсеткендей, К1 жəне К2 дақылдарының өсуі үшін: BG11 жəне Заррука ортасы қолайлы болса, К3 дақылы үшін Громов ортасы қолайлы болып келеді.
Бөлініп алынған дақылдардың морфологиялық жəне дақылдық қасиеттерін зерттеу негізінде
анықтағыштар бойынша К1, К2 жəне К4 дақылдары Oscillatoria туысына, ал К3 дақылы Phormidium
туысына жатқызылды. Көптеген зерттеушілер техногенді экожүйелерді зерттеу кезінде осы
туыстардың цианобактериялары кеңінен кездесетіндігін атап кеткен [2, 9].
Сонымен, комуналды қалдықтармен ластанған Қаламқас кен орнының ағын суынан Phormidium
жəне Oscillatoria туыстарына жататын 4 цианобактерия дақылдары бөлініп алынды.
1. Баулина О.И. Ультраструктурная пластичность цианобактерий. Автореф. канд.дис.биол.н. - М. 2005. – 20с.
2. Al Hasan R.H., Sorkhoh N.H., Al BaderD., Radwan S.S. Utіlіsatіon of hydrocarbons by cyanobacterіa from mіcrobal mats
on oіly coasts of the Gulf. // Appl. Mіcrobіol. Bіotechnol. - 1994. - № 41. - Р. 615-619.
3. Батаева Ю.В., Дзерджинская И.С. Цианобактерии различных экологических ниш на территории с аридным
климатом // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. – М., 2010. - С.20.
4. Квитко К.В. О влиянии ультрафиолетого излучения на наследственную изменчивость хлореллы: автореф....канд.
биол. наук. – Л.: ЛГУ, 1963. – 17 с.
5. Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования
водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наукова думка, 1975. -247с.
6. Определитель бактерии Берджи / Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльмса.
Девятое издание. В двух томах. Том 1. - М., «Мир». - 2007. 512 с.
7. Музафаров А.М., Эргашев А.Э., Халилова С.Х. Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии. - Ташкент:
Фан, 1987. – Т. 1-3. - С.3-405.
8. Becker E.W. Microalgae: biotechnology and microbiology. - 2008. - P. 293.
9. Сопрунова О.Б. Особенности функционирования альго-бактериальных сообществ техногенных экосистем: автореф.
дисс. д-ра биол. наук. - М, 2005. – 47 с.
132
***
В данной работе приведены результаты выделения и идентифицирования по морфолого-культуральным особенностям
4 видов цианобактерий, выделенных из сточных вод вахтого района Каламкас.
***
Results of isolation and identification by studying the morphological and cultural characteristics of four species of
cyanobaсteria wastwater of the vakhty area Kalamkas are given in this work.
О.А. Авксентьева, В.В. Жмурко
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПУТЕЙ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO ИЗОГЕННЫХ ПО
ГЕНАМ PPD ЛИНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ TRITICUM AESTIVUM L.
(Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина)
Исследованы особенности различных путей морфогенеза in vitro (каллусогенез, прямой и непрямой
морфогенез) изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта Мироновская 808. Определены оптимальные
условия для изучаемых процессов, показана их зависимость от типа выбранного экспланта, состава среды и условий
культивирования. Выявлены различия среди изогенных линий в размерах клеток каллусных тканей, скорости их
формирования, проявлении морфогенетического потенциала. Показана способность генетической системы контроля
фотопериодической чувствительности пшеницы in vivo детерминировать различные пути морфогенеза in vitro.
Культура растительных клеток in vitro является уникальным инструментом для изучения
фундаментальных проблем биологии. Морфогенетический потенциал растительной клетки в системах
in vitro проявляется в более широком диапазоне, чем в природных условиях, благодаря эволюционно
обусловленной у высших растений способности к тотипотентности [5,7,9]. Злаки, являясь важнейшими
сельскохозяйственными культурами, представляют труднейший объект с точки зрения
экспериментальной биотехнологии. Одной из причин, обусловливающих сложность получения
каллусной ткани, как одного из путей морфогенеза in vitro, у злаков по сравнению с двудольными,
является их неспособность к раневой реакции (образование раневого каллуса) [13]. У однодольных не
описано образование каллуса в естественных условиях, что давало основание для заключения о
невозможности получения тотипотентной каллусной ткани злаков на первых этапах развития метода
культуры ткани in vitro [8]. В настоящее время успешно культивируются in vitro каллусы пшеницы,
ячменя, кукурузы, риса и других представителей злаков [3,6,10,19]. Несмотря на большое количество
исследований по морфогенезу злаков in vitro [16,17,19] многие вопросы этого уникального пути
развития растений остаются нерешенными. В частности, малочисленны сведения о влиянии
индивидуальных генов на проявление тотипотентности клеток in vitro на объектах с трудной
регенерацией, к которым относятся злаки [4]. В связи с этим актуальной задачей является выявление
роли конкретных генетических систем на способность растительных эксплантов к реализации
различных морфогенетических программ при культивировании in vitro.
На генетической модели, включающей сорт мягкой озимой пшеницы Мироновская 808 и его
почти изогенные линии (near isogenic lines) по генам PPD (photoperiod), контролирующих степень
фотопериодической чувствительности [11,12,20], ранее была показана детерминация ряда физиологобиохимических процессов: углеводного обмена, ростовой реакция и общей продуктивности [1,2,14,18].
Высказано предположение, что данная генетическая система также участвует в контроле процессов
морфогенеза при культивировании изогенных линий in vitro[1]. Целью данной работы было
исследование особенностей процессов каллусогенеза и морфогенеза in vitro набора почти изогенных по
генам PPD линий и установление зависимости их индукции и динамики формирования от генотипа
изолинии, модификаций состава среды культивирования и типа выбранного экспланта.
Материалом исследований служили четыре генотипа озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum
L.) – почти изогенные моногеннодоминантные линии по системе генов контроля фотопериодической
чувствительности - PPD D1a, PPD В1a, PPD А1a и сорт Мироновская 808, рецессивный по всем трём
генам [15,20]. Почти изогенные линии были получены бекроссированием на основе сорта
Мироновская 808 в Селекционно-генетическом институте УААН [18] и любезно предоставленные нам
для исследований.
Для получения соматического каллуса в качестве эксплантов использовали зрелые зародыши,
апикальные участки асептических корней и листовые экспланты. При использовании в качестве
эксплантов зрелых зародышей семена стерилизовали 3% раствором NaОСl на протяжении 15 минут,
затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой, отставляли на сутки для
проклевывания, после чего вычленяли зародыши и переносили их в чашки Петри на питательную
среду Мурасиге и Скуга (МС) с полным набором макро- и микросолей, содержащую 0,7 % агара, 2,4–
133
Д – 2мг/л, 0,1 мг/л глицина и 10 мг/л AgNO3 [3,8]. Для использования апикальных участков корней и
листовых эксплантов предварительно выращивали 4-5 дневные асептические проростки пшеницы на
безгормональной среде МС в темноте при 25 ºС. Затем в асептических условиях вычленяли
апикальные сегменты корней длиной 1-1,5 см, из колеоптеля вычленяли первичный лист, используя
для культивирования его базальную часть размером 1-1,5 см и переносили их на среду МС для
индукции первичного каллусогенеза. Экспланты культивировали при 26ºС в термостате в течение 14
дней. После образования первичного каллуса чашки Петри переносили в условия культивирования
при освещенности 2 кЛк и 16-часовом фотопериоде. При исследовании процессов прямого
морфогенеза in vitro использовали два типа эксплантов - зрелые зародыши и апикальные меристемы.
Культивирование предварительно простерилизованного растительного материала проводили на
безгормональной среде МС с полным набором макро- и микросолей с течение 5-7 суток при
освещенности 2 Кл и 16-часовом фотопериоде. При изучении процессов непрямого морфогенеза in
vitro соматический эмбриогенный каллус, полученный из зрелых зародышей, переносили на
регенерационную среду, используя две модификации стандартной среды МС: 1) МС + 0,5 мг/л 2,4-Д +
0,5 мг/л кинетина; 2) МС + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л кинетина. Морфогенный каллус культивировали
при 26ºС, освещенности 2 кЛк, 16-часовом фотопериоде в течение 1-1,5 месяца. Эффективность
процессов морфогенеза in vitro: индукции каллусогенеза, прямого и непрямого морфогенеза (в
процентах) определяли как отношение числа эксплантов, образовавших морфогенные структуры к
исходному количеству культивируемых эксплантов. Приведенные результаты получены в 3-5
независимых сериях экспериментов, представленных не менее чем пятью чашками Петри или колбами
(по 5-7 эксплантов в каждой). В таблицах приведены средние значения и их стандартные отклонения.
Изучение эффективности индукции первичного каллусогенеза изогенных по генам контроля
фотопериодической чувствительности линий пшеницы показало, что все исследуемые генотипы
способны формировать каллус при использовании различных эксплантов: зрелых зародышей, апексов
корней и листовых эксплантов (таблица 1).
Таблица 1 - Частота каллусогенеза изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта
Мироновская 808 при использовании разных типов экспланта, %
Частота каллусогенеза, %
Генотип
Зрелые
Апикальные
Листовые
изолинии*
зародыши
корни
экспланты
74,0 ± 24,2
40,8±2,6
45,7±2,5
PPD D1a
98,5 ± 51,2
48,9±3,1
52,6±3,1
PPD B1a
62,9 ± 12,1
44,3±3,2
44,9±3,0
PPD A1a
90,3 ± 31,1
47,7±2,8
50,2±2,7
сорт М-808
П р и м е ч а н и е: * - указаны только доминантные гены
Однако тип выбранного экспланта оказывает влияние на эффективность данного процесса.
Зрелые зародыши являлись более эффективными эксплантами для получения первичного каллуса по
сравнению с апикальными участками корней и листовыми эксплантами. Эффективность индукции
каллусообразования при использовании апексов корней была минимальной и составляла 40,8 – 48,9 %,
при использовании листовых эксплантов – 44,9 – 52,6 % и максимальной при использовании в
качестве эксплантов зрелых зародышей – 62,9 – 98,5 %. Генотип изолинии также оказывал влияние на
эффективность каллусогенеза. Независимо от типа выбранного экспланта самым высоким
потенциалом каллусообразования характеризовалась изолиния PPD B1a и сорт, который полностью
рецессивен по генам ppd, минимальными показателями характеризовались изолинии PPD A1a и PPD
D1a. Изолиния PPD B1a проявляет максимальную степень фотопериодической чувствительности, что
выражается в торможении темпов развития данной линии по сравнению с другими изолиниями [11,12].
Следовательно, тип экспланта определяет максимальные и минимальные показатели эффективности
каллусогенеза и, возможно, оказывает влияние на генотипическую детерминацию данного процесса.
При использовании различных эксплантов, нами установлены различия в типах и скорости
формирования образовавшегося каллуса. Начало каллусогенеза при формировании каллусных тканей
из асептических корней происходило быстрее всего - на 2-5 сутки со дня перенесения на среду
культивирования. При использовании зрелых зародышей – на 7-10 сутки, дольше всех формировался
каллус из листовых эксплантов – на 30-35 сутки. Различия зафиксированы также по степени
134
оводненности, плотности, цвету, наличию элементов дифференцировки и проявлению
морфогенетического потенциала. Из асептических корней формировался сильно оводненный, рыхлый,
почти прозрачный, слегка беловатый каллус. Из зрелых зародышей – плотный, менее оводненный,
желтоватый каллус, характеризующийся наличием элементов дифференциации, что подтвердили
микроскопические исследования. Такого же типа каллусная ткань
- плотная и желтоватая
формировалась при использовании в качестве эксплантов первичных листьев. При микроскопировании
каллусной ткани различных изолиний нами были обнаружены типичные для злаков каллусные клетки
– вытянутые, с закругленными концами, не плотно прилегающие друг к другу. Однако клетки
различных изолиний имели свои морфологические особенности и различия по размерам.
Под морфогенезом понимают образование и дифференциацию тканей и органов
многоклеточными организмами [5]. Выделяют прямой и непрямой пути морфогенеза in vitro. Прямой
соматический морфогенез представляет собой процесс формирования биполярной структуры с осью
корень/стебель с закрытой независимой сосудистой системой из клеток экспланта без предварительной
дедиффиренциации и стадии образования каллуса. Непрямой морфогенез включает обязательный этап
формирования дедиффирицированной каллусной ткани с последующей индукцией образования
соматических зародышей (предзародышей) и их развитием в биполярные структуры с осью
корень/стебель [7,9]. В наших дальнейших исследованиях мы изучали эффективность различных путей
морфогенеза in vitro в зависимости от генотипа исходной изолинии и типа выбранного экспланта.
Изучение прямого морфогенеза in vitro показало, что выбор экспланта существенно влияет на
эффективность процесса (табл.2). При использовании в качестве эксплантов зрелых зародышей
показатели частоты морфогенеза в 3-5 раз выше, чем при использовании апексов стеблей. Однако
влияние генотипа, независимо от абсолютных показателей морфогенеза, проявляется однотипно в
случае использования и апексов, и зрелых зародышей в качестве эксплантов. Максимально
эффективен процесс у изолиний PPD D1а и PPD A1a, минимален – у растений изолинии PPD B1a и
сорта. В дальнейших исследованиях при изучении непрямого пути морфогенеза in vitro после
образования каллусных тканей, сформированных из различных эксплантов и перенесения их на среду
для индукции морфогенеза, нами показаны различия в морфогенетическом потенциале в зависимости
от типов каллуса и генотипа исходной изолинии. Плотный, желтоватый морфогенный каллус,
сформированный из зрелых зародышей, проявлял регенерационную способность. На 10-15 сутки
культивирования на среде для регенерации были отмечены геммогенез – формирование колеоптелей и
ризогенез – формирование корней. Морфогенез прозрачного, гомогенного, рыхлого каллуса,
сформированного из асептических корней, проходил только по пути интенсивного ризогенеза –
формирования корней. Многими исследователями отмечено, что такой тип морфогенеза не является
регенерационно способным, т.е. в дальнейшем при культивировании невозможно формирование
полноценных фертильных растений-регенерантов [3,6,13].
Исследование морфогенетического потенциала проводилось нами с использованием двух
модификаций состава регенерационной среды. Наиболее оптимальной оказалась среда следующего
состава: МС + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л кинетина – показатели эффективности процесса были в среднем
1,5 раза выше, чем на регенерационной среде МС + 0,5 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л кинетина. Влияние
генотипа исследуемых изолиний на непрямой морфогенез проявлялось однотипно также, как и в
случае прямого морфогенеза. Эффективнее всего морфогенез отмечен у изолиний PPD A1a,
минимален – у растений изолинии PPD B1a.
Таблица 2 - Эффективность морфогенеза изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта
Мироновская 808 при использовании разных типов экспланта и модификаций регенерационной
среды культивирования, %
Морфогенез, %
Генотип
прямой
непрямой
изолинии *
апексы
зародыши
МС + ИУК
МС + 2,4 D
32,5 ± 2,3
77,78 ± 1,1
35,9 ± 0,7
22,0 ± 0,9
PPD D1a
12,5 ± 1,1
70,83 ± 1,5
26,2 ± 0,4
18,3 ± 0,5
PPD B1a
25,6 ± 1,9
75,00 ± 1,8
48,5 ± 0,9
30,0 ± 0,7
PPD A1a
18,75 ± 1,3
72,22 ± 1,3
33,1 ± 1,1
21,6 ± 0,8
сорт М-808
Примечание: * - указаны только доминантные гены
Таким образом, независимо от пути морфогенеза (прямой или непрямой), независимо от типа
выбранного экспланта, состава регенерационной среды влияние генотипа исследуемых изолиний
135
проявляется сходным образом. Следует отметить, что генотипическая детерминация процессов
каллусогенеза и морфогенеза проявляется противоположно: максимальное стимулирования
каллусогенеза у изолинии PPD B1a сопровождается минимальными показателями морфогенеза и
наоборот. Исследуемые изолинии генетической системы PPD - контроля фотопериодической
чувствительности пшеницы, определяющей разные темпы развития опытных растений в условиях in
vivo, различаются по эффективности различных путей морфогенеза в условиях in vitro. Показано, что
изолиния PPD B1a, характеризующаяся медленным развитием in vivo, в условиях in vitro проявляет
максимальную способность к каллусогенезу. Изолинии PPD D1a и PPD A1a, которые обладают
минимальной чувствительностью к фотопериоду и максимально быстрыми темпами развития in vivo,
максимально эффективно проявляют морфогенетический потенциал и наиболее интенсивно
развиваются и в условиях in vitro. Т.е. генетическая
система контроля фотопериодической
чувствительности пшеницы способна детерминировать различные пути морфогенеза опытных
растений in vitro.
Работа выполнена при поддержке Фонда фундаментальных, прикладных и поисковых
исследований Харьковского национального университета имени В.Н Каразина: грант № 6-07, 8-09.
1. Авксентьева О.А., Жмурко В.В., Петренко В.А., Тищенко А.А. Эффекты генов VRN и PPD на процессы
каллюсогенеза и морфогенеза в культуре in vitro // Геном рослин: Збірник наукових статей Y Міжнародної конференції, 13-16
жовтня 2008 р. (Україна). – Одеса, 2008. – С.39-42.
2. Авксентьєва О.А., Зубрич А.И., Жмурко В.В. Єффекты генов PPD на рост, развитие и обмен углеводов у изогенных
линий пшеницы в условиях разной длины дня // Там же. – Одеса, 2008. – С.42-45.
3. Бавол А.В., Дубровная О.В., Лялько И.И. Регенерация растений из различных типов эксплантов мягкой пшеницы //
Физиология и биохимия культ. растений. – 2008. – Т.40, №2. – С.150-156.
4. Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В. Биохимическая оценка морфогенетического потенциала каллусных
клеток пшеницы in vitro // Физиология растений. – 2007. – Т.54, №2. – С.306-311.
5. Журавлев Ю.Н., Омелько А.М. Морфогенез у растений in vitro // Физиология растений. – 2008. – Т.55, №5. – С.643664.
6. Круглова Н.Н., Зайнутдинова Э.М. Андроклинный каллус пшеницы в динамике развития: цитологогистологический анализ // Вестник Башкирского университета. – 2001. - №2 (1). – С.137-141.
7. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. – К.: Логос, 2005. – 730 с.
8. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – К.:
Наукова думка, 1980. – 488 с.
9. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. – 228 с.
10. Сидор Л.С., Орлов П.А. Регенерационный потенциал различных видов пшеницы, ржи и ячменя в культуре
листовых эксплантов // Цитология и генетика. – 2005. – Т.40, №5. – С.28-34.
11. Стельмах А.Ф., Файт В.И., Мартынюк В.Р. Генетические системы типа и контроля скорости развития пшеницы //
Там же. – 2000. – Т.34, №2. – С.39-45.
12. Файт В.И.. Стельмах А.Ф., Федорова В.Р. Начало включения и продолжительность экспрессии генов
фотопериодической реакции у озимой пшеницы // Там же. – 2006. –Т.40, №2. – С.12-19.
13. Чеченева Т.Н. Изменчивость злаков в культуре in vitro и в процессе регенерации растений // Физиология и
биохимия культ. растений. – 2006. – Т.38, №2. – С.163-175.
14. Avksentyeva O.A., Petrenko V.A., Tichenko A.A. and Zhmurko V.V. Callus initiation and morphogenesis in in vitro
culture of isogenetic on gene type and zate of development in winter wheat lines // Annual Wheat Newsletter. –August 2008. – Vol.54.
– P.150-152.
15. Mashashhiko T., Kenji K., Yasuki T. etc Genetic analysis of photoperiod response in wheat and its relation with the
earliness of heading in southwestern part of Japan // Breading Science. – 2005, 55. – P.327-334.
16. Machii H., Mizuno H., Hirabayashi T., Li H., Hagio T. Screening wheat genotypes for high callus induction and
regeneration capability from anther and immature embryo cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1998. – V.53, №1.- P.6774.
17. Tyankova N.D., Zagorska N.A. Genetic control in vitro response in wheat (Triticum aestivum L.) // In Vitro Cell. Dev.
Biol., Plant.–2001.–37, № 5 –P.524-530.
18. Stelmakh А.F. Genetic systems regulating flowering in wheat // Wheat: Prospects for Global Improvement. – 1998. Kluwer
Academic Publishers. Printed in the Netherlands. – P.491-501.
19. Wang C., Wei Z. Embriogenesis and regeneration of green plantlets from wheat (Triticum aestivum L.) leafbase // Plant
Cell, Tissue and Organ Culture. - 2004. – V.77, №2. - P.149-153.
20. White W., Herndil M., Hunt L., Payne T. and Hoogenboom G. Simulation-Based analysis of effects of Vrn and Ppd loci on
flowering in wheat // Crop Science. - 2008. – Vol.48. - P.678-687.
***
The
features
of the
different
ways of
morphogenesis in
vitro
(callus
formation, direct
and
indirect morphogenesis) isogenic lines for genes PPD winter wheat varieties Mironovskaya 808. The optimal conditionsfor the studied
processes, showing
their dependence on
the
type
ofexplant, media composition and
cultivation
conditions. The
differencesamong isogenic lines in the size of the cells of callus tissue, the rate of their formation, the manifestation
of morphogenetic potential. It is shown that the ability of the genetic control of photoperiodic sensitivityof wheat in vivo determine the
various ways of morphogenesis in vitr
136
Ж.С. Алмаганбетов, С.А. Джокебаева, Р.У. Бейсембаева, С.Б.Оразова
КӨК-ЖАСЫЛ МИКРОБАЛДЫРЛАРДЫҢ МУТУАЛИСТІК ТИПТІ ДИКУЛЬТУРАЛАРЫН
АЙҚЫНДАУ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті)
Көк-жасыл балдырлардың дикультуралары (A. laxa + T1 Anabaenopsis и Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii)
жоғары өсу жылдамдығымен жəне монокультурамен салыстырғанда, биомассаны жоғары мөлшерде жинақтауымен
сипатталады. Бұл микробалдыр түрлерінің арасындағы мутуалистік қарым-қатынастың пайда болуынан деп болжам
жасалды.
Метаболизмі ерекше альгофлора өкілдерінің адамға маңызды қосылыстарды түзуіне байланысты
микробалдырлар биотехнологияның маңызды объектілеріне айналды. Микробалдырларды биологиялық белсенді қосылыстардың көзі ретінде зерттеу, олардың антимикробтық, антисаңырауқұлақтық,
антивирустық, антибактерияльды, антигельминттік, цитотоксикалық, антиоксиданттық, фитореттеушілік жəне өсуді белсендендірушілік қасиеттерін анықтау үшін зерттелінеді [1].
Микробалдырлардың биологиялық белсенді метаболиттеріне каротиноидтар, пигменттер,
аминқышқылдары, фитогормондар, экзополисахаридтер, май қышқылдары, витаминдер, стеролдар,
аллелохимиялық қосылыстар жатады [2]. Микробалдырлардың клеткалары аталған қосылыстарға
сапалық жəне сандық жағынан бай болып келеді [3].
Соңғы уақытта микробалдырларды пайдаланудың тағы бір аспектісі қызығушылық тудыруда.
Бұл аллелохимиялық қосылыстар. Микробалдырлар мен балдырлар қатысатын аллелопатиялық
қатынастар биологияда маңызды болып табылады. Осы организмдер арқылы түзілетін химиялық
заттар олардың белгілі табиғи ортада бəсекелестік түрде таралуын қамтамасыз етеді /4/. Сондықтан да
осы уақытқа дейін биоценоздағы серіктестер арасындағы түраралық байланыстарға мəн берілмеді.
Дегенмен де түрлер арасындағы байланыстарды зерттеу жаңа жоғары белсенді табиғи қосылыстарды
дайындаудың теориялық негіздерін жасауға мүмкіндік береді. Балдырлардың культивирленетін аралас
(ассоциацияланған) популяцияларын түзу өсу реттегіштері мен өсімдіктерді қорғайтын заттарды алуда
фототрофты культураларда биосинтетикалық
процесстерді бағытты реттеудің эффективті
құралдарының бірі болып табылады [5].
Ауылшаруашылық дақылдардың абиотикалық (төмен жəне жоғары температура, ылғалдылық
жетіспеушілігі), сонымен қатар биотикалық факторларға (саңырауқұлақтық, вирустық, бактерияльды
аурулар, арамшөптер) төзімділігін арттыру қазіргі заманғы өсімдік шаруашылығының басым
мəселелерінің бірі болып табылады. Əртүрлі стресс факторларға ауылшаруашылық өсімдіктердің
төзімділігін арттыру мен егіс түсімін арттыратын өсу стимуляторларының қолжетімді жəне болашағы
мол көзі – балдырлар болып саналады [6].
Зерттеу əдістері мен материалдар
Зерттеу объектісі ретінде биотехнология кафедрасының альгологиялық коллекциясындағы
культуралардың ішінен көк жасыл балдырлардың 10 түрі алынды: Anabaena laxa, Anabaenopsis sp. (Т1
штамы), Anabaenopsis Arnoldii, Anabaena sp. (К штамы), Anabaena constricta, Nostoc sp. (К штамы),
Stratonostoc gelatinosum, Sphaeronostoc Zetterstedtii, Sphaeronostoc coeruleum, Amorphonostoc paludosum.
Түрлердің биосəйкестілігі Егоровтың модификацияланған əдісі арқылы анықталынды /7/.
Агарлы ортаға микробалдыр түрлерін нүктелік əдіс бойынша отырғызылды. Бір апта өткеннен кейін
микробалдырлардың колонияларының өсу белсенділігі бақыланды. Колониялардың өсуі бинокуляр
арқылы бақыланды.
Микробалдырлардың моно- жəне аралас дақылдарын өсіру үшін 5 мл Фитцджеральд ортасы бар
20 мл пробиркаларда 16 түрлі моно- жəне аралас дақылдарды өсірдік. Фитцджеральд ортасының
құрамы (г/л): NaNO3 -0,496; K2HPO4 – 0,039; MgSO4*7H2O – 0,075; CaCl2 – 0,036; Na2CO3 – 0,020;
Na2SiO3*9H2O – 0,058; Fe цитраты – 0,006; лимон қышқылы – 0,006; трилон Б – 0,001;
микроэлементтер ерітіндісі – 0,008 мл.
Зерттеуге алынған 7 монокультура: Anabaena laxa, Sphaeronostoc Zetterstettdi, Anabaenopsis sp.
(T1), Anabaena sp. (K), Anabaena constricta, Anabaenopsis Arnoldii жəне Sphaeronostoc coeruleum.
9 түрлі дикультурадағы комбинациялар: A.laxa + Sph. Zetterstettdi, Sph.Zetterstettdi + Anabaenopsis
sp. (T1), Anabaenopsis sp. (T1) + Anabaena sp. (K), Sph. Zetterstettdi + A.constricta, Sph. coereleum + A.
constricta, A. laxa+ A. constricta, A.laxa + Anabaenopsis sp. (T1), Anabaenopsis Arnoldii + A. laxa жəне
Anabaenopsis Arnoldii + Anabaena sp. (K).
16 түрлі жағдайдан 3 монокультура жəне 2 түрлі аралас комбинациялар алынды. Ең алдымен,
дақылдарды культураға енгізбестен бұрын екі дақылдың алдын-ала бірдей тығыздықта инокуляттарын
137
дайындап алдық. Осы дақылдарды ламинар бокста моно- жəне аралас жағдайларына сəйкес
культураларға енгізділді. Аралас культураларға əр түрдің инокуляттары 0,5:0,5 көлем қатынасында
енгізілді жəне қиғаш жағдайда, 250С температурада люминостатта 10 тəулік бойы культивирленді. 3, 6
жəне 10 тəулік өткеннен кейін биомассаың өсу динамикасы анықталынды. Салыстыру үшін
монокультураларды да жоғарыда аталған жағдайларда өсірдік.
Өсу процесінің белсенділігі өсу коэффициенті (ӨК) бойынша анықталынды. 3, 6 жəне 10 тəулік
өткен сайын микробалдырлардың биомассасы бар 6 мл культуралық сұйықтық алдын-ала салмағы
тұрақтандырылған бюкстерде 1050С температурада құрғақ салмағы тұрақты мəнге жеткенше
кептірілді. Екінші бюксте 1 мл инокулят аталған жағдайда кептірілді.
Өсу көрсеткіші төмендегідей формула бойынша есептелінді /8/:
Өсу коэффициенті = ,
мұндағы, М1-биомассаның соңғы құрғақ салмағы, М2-инокуляттың соңғы құрғақ массасы.
Барлық тəжірибелер үш реттік биологиялық жəне аналитикалық қайталаныммен жасалды.
Нəтижелер статистикалық түрде талданды.
Зерттеу нəтижелері
Микробалдырлар метаболизмі барысында көптеген биологиялық белсенді заттарды түзеді.
Микробалдырлардың аралас культураларында биологиялық белсенді қосылыстар жоғары деңгейде
түзіледі деп болжам жасалады. Бұл мəселені шешу үшін микробалдырлардың биосəйкестілігін анықтау
керек. Жұмыс барысында 10 көк-жасыл микробалдырлардың биосəйкестілігі Егоровтың аралас
культурадағы түрлердің биосəйкестілік биотестін қолданып зерттелінді.
10 түрдің биосəйкестілігін зерттеу нəтижесі 1-суретте көрсетілген. A.laxa жəне Sph.Zetterstedtii
микробалдырлар комбинациясынан алынған нəтиже бинокуляр арқылы қаралды (сурет 2).
Микробалдырлардың арасында трихомаларының өсуі жүзеге асқан, трихомалары бір-біріне
бағытталып өскен жəне тығыз байланыста болды. Зерттеу барысында A.laxa + Sph.Zetterstedtii, A. laxa
+ T1 Anabaenopsis жəне Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii комбинацияларының арасында
колониялар арасындағы өсу белсенді түрде байқалды.
Зерттеу жұмысының екінші сатысында түрлер мен олардың дикультураларының ӨК анықтау
үшін тəжірибе қойылды. Биосəйкестілік тəжірибесінің нəтижелері бойынша алынған 9 аралас
микробалдырлар комбинацияларының ішінде A. laxa + T1 Anabaenopsis жəне Anabaenopsis sp. (Т1) +
Sph.Zetterstedtii дикультуралар жоғары биосəйкестілігін көрсетті. Өсу көрсеткіші бойынша тəжірибеге
комбинациялардың моно- жəне аралас дақылдары алынды.
Сурет 1 - Микробалдыр түрлерінің
биосəйкестілігін анықтауға арналған биотест
Сурет 2 - Агарлы ортадағы микробалдырлардың
бірігіп өсуі (х10
Аралас дикультураны 10 тəулік бойы өсіріп, 0, 3, 6 жəне 10 тəуліктен кейін биомассаның өсу
көрсеткіші анықталды. Бақылау ретінде екі монокультураның өсу көрсеткіштері де анықталды (3сурет). A.laxa 3 күндік культурасының өсу коэффициенті 2,35±0,1 тең болды, Anabaenopsis sp.
(Т1)1,83±0,02 тең. Қос дақылдағы көрсеткіштер біршама жоғары 2,78±0,26 болды.
Монокультуралардың өсу көрсеткішін аралас дақылдармен салыстырсақ, A.laxa 18%-ға жəне
Anabaenopsis sp. (Т1) 50%-ға дейін аралас дақылдан кем.
Дақылдарды 6 тəулік культивирлеу барысында A.laxa-ның өсу коэффициенті 2,49±0,2–ке жетті,
бұл көрсеткіш 3 тəулік көрсеткіштен 5%-ға артты. Anabaenopsis sp. (Т1) дақылының өсу көрсеткіші
A.laxa дақылымен салыстырғанда анағұрлым төменірек, 6 тəуліктен кейін 1,90±0,2-ге тең болды. Қос
138
дақылдың көрсеткіші монокультураларға қарағанда, едəуір жоғары, 3,02±0,21–ге тең болды. Бұл қос
дақыл көрсеткшінің A.lax-дан 21%-ға жəне Anabaenopsis sp. (Т1)-дан 58%-ға артқандығын көрсетеді.
Өсу динамикасының көрсеткіштері 10 тəуліктік культураларда 3 жəне 6 тəулік
культивирленгенге қарағанда жоғары болды. Монокультуралардың көрсеткіштері сəйкесінше
Anabaena laxa-да 2,75±0,3 жəне Anabaenopsis sp. (Т1)-да 2,58±0,04, ал дикультураның өсу
коэффициенті артты (3,88±0,5).
Сурет 3 - A.laxa жəне Anabaenopsis sp. (Т1) дақылдардың өсу динамикасының көрсеткіштері
Anabaenopsis sp. (Т1) жəне Sph.Zetterstedtii микробалдырларының жəне
дикультураларының 10 тəулік өсу динамикасын зерттеу нəтижелері берілген (сурет 4).
олардың
Сурет 4 - Anabaenopsis sp. (T1) жəне Sph.Zetterstettdi дақылдарының өсу динамикасының көрсеткіштері
Anabaenopsis sp. (Т1) микробалдырының өсу көрсеткіші 3, 6 жəне 10 тəулікте сəйкесінше
1,83±0,02, 1,90±0,21 жəне 2,58±0,04-ге тең болды. Культивирлеудің 6 тəулігінде құрғақ биомасса 3%ға, ал 10 күннен соң 40%-ға дейін артты.
Sph.Zetterstedtii-нің өсу коэффициенті 3 тəуліктен соң 2,01±0,02. 6 тəулік культурада 2,74±0,16ға жетті. 10 тəуліктен кейін 2,84±0,06 болды, жалпы биомассаның құрғақ салмағы 41%-ға жоғарылады.
Алынған түрлердің, яғни Anabaenopsis sp. (Т1) жəне Sph.Zetterstedtii бірігіп өсуінің
көрсеткіштері барлық күндерде де монокультуралармен салыстырғанда жоғары екендігі анықталынды.
Дикультуралардың өсу коэффициенттері 3, 6 жəне 10 тəулік аралықтарында 2,78±0,26, 3,02±0,21 жəне
3,88±0,5 болды. Дикультураны монокультураларымен салыстырсақ, дикультураның биомассасының
құрғақ салмағы Anabaenopsis sp. (Т1)–дан 58%-ға жəне Sph.Zetterstedtii-дан 36%-ға жоғарылады.
Сонымен, зерттеуге алынған микробалдырлардың өсу көрсеткіштері дикультураларда
монокультураларымен салыстырғанда анағұрлым жоғары болды. Микробалдырлар аралас жағдайда
биологиялық белсенді заттарды синтездеп, бір-біріне қолайлы жағдай туғыза отырып, бір-бірінің өсуін
белсендендіруі мүмкін.
1. Kumar K., Lakshmanan A. and Kannaiyan S. Bioregulatory and therapeutic effects of blue green algae // Indian J.
Microbiol. -2005. -vol. 43. -no. 1. -p. 9–16.
2. Краснянская Н.Б., Урунбаева Д., Чепенко Л.И. и др. Рост-стимулирующие метаболиты Nostoc muscorum // Биол. и
биотехн. микроорганизмов. –Ташкент. -1989. –с.51-59.
139
3. Горюнова С. В. Синезеленые водоросли (биохимия, физиология, роль в практике). М.: Наука, 1969. – 300 с.
4. Nagle D.G. and Inderjit. Chemical Ecology of Plants: Allelopathy in Aquatic and Terrestrial Ecosytems. Switzerland:
Verlag, 2002.
5. О.В. Бухарин, Е.С. Лобанова, Н.В. Немцева и др. Ассоциативный симбиоз. УрО РАН, Екатеринбург, 2007. –264с.
6. R. Prasannaa, A. Soodb, P. Jaiswala, S. Nayaka, V. Guptaa, V. Chaudhary, M. Joshia and C. Natarajan // Rediscovering
Cyanobacteria as Valuable Sources of Bioactive Compounds. -Applied Biochemistry and Microbiology. – 2010. -Vol. 46. -No. 2. p.119–134.
7. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: МГУ-Наука,2004.- 525 с.
8. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике, Киев: Наукова
думка, - 1975. –с.328.
***
Установлено, что дикультуры синезеленых водорослей (A. laxa + T1 Anabaenopsis и Anabaenopsis sp. (Т1) +
Sph.Zetterstedtii) характеризуются повышенной скооростью роста и накоплением биомассы по сравнению с монокультурами.
Предпологается, что это связано с возникновением мутуалистических взаимоотношений между видами микроводорослей.
***
It is found that blue-green algae dicultures (A.laxa + Anabaenopsis sp. T1 strain and Anabaenopsis sp. T1 strain +
Sph.Zetterstedtii) are characterized by high growth and accumulation of biomass compared to monocultures. It is supposed that this is
connected with the occurrence of mutualistic relationships between species of microalgae.
Z. Alikulov, M. Myrzabaeva, T. Utupov, O. Babenko
XENOBIOTIC TRANSFORMING ACTIVITY OF ANIMAL MOLYBDOENZYMES
(The L.N.Gumiliev Eurasian National University, Astana)
Most the attention to date in metabolism of drugs and foreign compounds has been focused on the
microsomal monooxygenase system. This system plays an important role in the oxidation of aromatic
carbocyclic compounds. However, the presence of the one ore more nitrogen atoms in the aromatic ring makes
heterocyclic compounds also susceptible to oxidation via a second group of enzymes known as the
“molybdenum hydroxylases”. These cytosolic enzymes, which include xanthine oxidase (XO, EC 1.2.3.2) and
aldehyde oxidase (AO, EC 1.2.3.1), form a closely related group with similar molecular properties but differ
some what in substrate specificity. Both enzymes are also involved in some physiological processes and also
the metabolism of some endogenous compounds which may indicate their important roles in in vivo conditions
[2].
These enzymes are metalloflavoproteins that catalyze both oxidation and reduction of a broad range of
drugs and other xenobiotics indicating the importance of these enzymes in drug oxidation, detoxification and
activation. Xanthine oxidoreductase (XOR) appears in two interconvertible forms xanthine dehydrogenase
(XDH), and xanthine oxidase (XO). Xanthine oxidoreductase catalyzes the hydroxylation of hypoxanthine to
xanthine and of xanthine to urate. Oxidative hydroxylation occurs at the molybdenum center. With XDH
NAD+ is reduced; with XO molecular oxygen is reduced at the flavin center. Molybdenum-containing
hydroxylases catalyze the hydroxylation of carbon centers using oxygen derived ultimately from water, rather
than O2, as the source of the oxygen atom incorporated into the product, and do not require an external source
of reducing equivalents.
The relative importance of these two groups of oxidative enzymes is illustrated by comparing the in
vitro oxidation of several bicyclic ring system. Naphtalene is oxidized via the microsomal monooxygenase
system to an unstable epoxide intermediate which ultimately gives rise to a mixture of 1-naphtol and 2naphtol. However, naphthalene is not a substrate for the molybdenum hydroxylases. Quinoline, 1azanaphtalene, reacts not only with the microsomal enzyme system but also with aldehyde oxidase to give a
number of mono- and dihydroquinolines with rabbit or rat liver fractions. As the number of N atoms in the
molecule increases, the molybdenum hydroxylases play a more dominant role in the oxidative
biotransformation of these compounds. Thus, quinazoline, 1,3-diazanaphtalene, is rapidly oxidized by both
aldehyde oxidase and xanthine oxidase to quinazolin-4-one, whereas only small amounts of phenolic
microsomal products can be detected. Furthermore, quinazolin-4-one is subsequently converted to quinazolin2, 4-dione by the molybdenum hydroxylases. Finally pteridine, 1,3,5,8-tetraazanaphtalene, is oxidized in vitro
via the molybdenum hydroxylases only; xanthine oxidase converts it sequentially to pteridin-2,4,7-trione,
whereas it is converted to pteridin-2,4-dione by aldehyde oxidase.
The reason for the change in emphasis from microsomal oxidation of naphthalene to the molybdenum
hydroxylase catalyzed attack of pteridine is due to the additive activating effect of each nitrogen atom toward
nucleophilic attack of the ring system. The molybdenum hydroxylases catalyze a reaction which involves
attack by a nucleophile. Therefore, oxidation normally occurs at the carbon atom adjacent to a ring nitrogen,
140
which is generally the most electropositive carbon. The oxygen atom incorporated into the substrate is
ultimately derived from water. In contrast, the microsomal monooxygenase system catalyzes electrophilic
attack involving molecular oxygen, and the carbons in the heterocyclic rings are deactivated toward
electrophilic reagents. The two reactions can be presented thus [2]:
RH + OH-  aldehyde oxidase, xanthine oxidase  ROH + 2e- + H+
RH + O2 + NADPH + H+  monooxygenases  ROH + H2O + NADP+
The molybdenum hydroxylases function by being alternately reduced by the substrate (RH) and
reoxidized by molecular oxygen (or NAD+) under physiological conditions. In addition to the two atoms of
molybdenum, these enzymes also contain two molecules of FAD per mole of enzyme. Both superoxide anion
and hydrogen peroxide are produced via either one-electron or two-electron transfer. These pathways can be
illustrated by the following equation:
FADH2 + 2O2  FAD + 2H+ + 2O2FADH2 + O2  FAD + H2O2
Reactions catalyzed by molybdoenzymes. AO and XO oxidize the oxidation of a wide range of
heterocyclic compounds. Although the enzymes have similar molecular properties, their substrate specificities
are quite different, with regard to both rate of oxidation and the position of attack. However, the role of these
enzymes in the oxidation of drug-derived aldehydes has not been established. The investigation described the
interaction of eleven structurally related benzaldehydes with guinea pig liver aldehyde oxidase and bovine
milk xanthine oxidase, since they have similar substrate specificity to human molybdenum hydroxylases. The
compounds under test included mono-hydroxy and mono-methoxy benzaldehydes as well as 3,4-dihydroxy-,
3-hydroxy-4-methoxy-,4-hydroxy-3-methoxy-, and 3,4-dimethoxy-benzaldehydes. In addition, various amines
and catechols were tested with the molybdenum hydroxylases as inhibitors of benzaldehyde oxidation. The
kinetic constants have shown that hydroxy-, and methoxy-benzaldehydes are excellent substrates for aldehyde
oxidase with lower affinities for xanthine oxidase. Therefore, aldehyde oxidase activity may be a significant
factor in the oxidation of the aromatic aldehydes generated from amines and alkyl benzenes during drug
metabolism. In addition, amines acted as weak inhibitors, whereas catechols had a more pronounced inhibitory
effect on the aldehyde oxidase activity. It is therefore possible that aldehyde oxidase may be critical in the
oxidation of the analogous phenyl acetaldehydes derived from dopamine and noradrenaline.
There are very few monocyclic substrates of these enzymes; pyridine and its diaza analogues,
pyrimidine, pyrazine and pyridazine, do not react with the molybdoenzymes in vitro. However, some
substituted pyridines and pyrimidines are metabolized, and these examples emphasize the difference in
substrate specificity between the AO and XO.
XO catalyses nitrite reduction to nitric oxide under anaerobic conditions [1]. The XO reducing
substrate xanthine, NADH, triggered nitrite reduction to NO, and the molybdenum-binding XO inhibitor
oxypurinol inhibited this NO formation, indicating that nitrite reduction occurs at the molybdenum site. Nitrite
and reducing substrate concentrations were important regulators of XO-catalyzed NO generation. It is well
known that in mammals including humans, NO is an important cellular signaling molecule involved in many
physiological and pathological processes. XO-catalyzed nitrite reduction can be an important source of NO
generation under ischemic conditions [5].
It was suggested that XO is an inducible enzyme and that treatment of mice with xanthine results in
elevation of enzyme levels. Similarly, when phtalazine, a substrate of both molybdoenzymes, is administrated
to rabbits an increase in the activity of each enzyme is observed. The “induced” AO differs from the control
enzyme in some physico-chemical properties. It was also shown that that hydralazine, a substituted phtalazine,
is an inhibitor of rabbit AO activity both in vivo and in vitro. XO activity is not altered by hydralazine.
Interesting results are obtained when the carcinogen 2-acetylaminofluorene is administered to rats. XO activity
increases, as does one isozyme of AO, however, the second isozyme is absent from induced liver.
The molybdenum hydroxylases are widely distributed throughout the animal the plant and animal
kingdoms. Two detailed studies comparing the occurrence of aldehyde oxidase and xanthine oxidase in more
than 100 species have shown that these enzymes are present, either separately or together, in species as diverse
as the sea anemone and man. Species differences in the levels of aldehyde oxidase are more pronounced than
those of xanthine oxidase, with herbivores containing the highest levels of former enzyme. Aldehyde oxidase
levels appear to be comparatively low in humans.
Levels of both enzymes are high in mammalian liver although xanthine oxidase is present in similar
concentrations in lactating mammary tissue and small intestine, and concentrated 1000-fold in bovine milk
lipid globules.
141
Sulfite oxidase, (EC 1.8.3.1) third molybdoenzyme is an enzyme in the mitochondria of all eukaryotes.
It oxidizes sulfite to sulfate and, via cytochrome c, transfers the electrons produced to the electron transport
chain, allowing generation of ATP in oxidative phosphorylation.
The recently discovered mammalian fourth molybdenum containing protein mARC1 is capable of
reducing N-hydroxylated compounds. It was named mARC because the N-reduction of amidoxime structures
was initially studied using this isolated mitochondrial enzyme. Upon reconstitution with cytochrome b(5) and
b5 reductase, benzamidoxime, pentamidine, and diminazene amidoximes, N-hydroxymelagatran,
guanoxabenz, and N-hydroxydebrisoquine are efficiently reduced. These substances are amidoxime/Nhydroxyguanidine prodrugs, leading to improved bioavailability compared to the active amidines/guanidines.
Thus, the recombinant enzyme allows prediction about in vivo reduction of N-hydroxylated prodrugs.
Furthermore, the prodrug principle is not dependent on cytochrome P450 enzymes [3].
All hitherto analyzed mammalian genomes harbor two mARC genes: molybdenum cofactor (Moco)
sulfurase C-terminal domain MOSC1 and MOSC2. Proteins encoded by these genes represent the simplest
eukaryotic molybdenum enzymes, in that they bind only the Moco. It is also suggested that they are members
of a new family of molybdenum enzymes. mARC and its N-reductive enzyme system plays a major role in
drug metabolism, especially in the activation of so-called "amidoxime-prodrugs" and in the detoxification of
N-hydroxylated xenobiotics, though its physiological relevance is largely unknown [4].
Thus, molybdenum is an essential trace element for virtually all life forms. It functions as a cofactor
for a number of enzymes that catalyze important chemical transformations in the global carbon, nitrogen, and
sulfur cycles. At least 50 molybdenum-containing enzymes are now known in bacteria, plants and animals.
Thus, molybdenum-dependent enzymes are not only required for the health of the Earth's people, but for the
health of its ecosystems as well. Humans require very small amounts. Plants are common sources of
molybdenum for animals and human. However, the amount of molybdenum in plants varies with how much is
in the soil.
Linxian is a small region in northern China where the incidence of cancer of the esophagus and
stomach is very high (10 times higher than the average in China and 100 times higher than the average in the
U.S. The soil in this region is low in molybdenum and other mineral elements, so dietary molybdenum is also
low. Increased intake of nitrosamines, which are known carcinogens, may be one of a number of dietary and
environmental factors that contributes to the development of gastroesophageal cancer in this population. Plants
require molybdenum to synthesize nitrate reductase, a molybdoenzyme necessary for converting nitrates from
the soil to amino acids. When soil molybdenum content is low, plant conversion of nitrates to nitrosamines
increases, resulting in increased nitrosamine exposure for those who consume the plants. Adding molybdenum
to the soil in the form of ammonium molybdenate may help decrease the risk of gastroesophageal cancer by
limiting nitrosamine exposure.
1. Alikulov, Z. A.; L'Vov N, P.; Kretovich, V. L. 1980. Nitrate and nitrite reductase activity of milk xanthine oxidase.
Biokhimiia. 45:1714-1718. (1980).
2. Beedham C. 1985. Molybdenum hydroxylases as a drug-metabolizing enzymes. Drug Metabolism Review. 16 (1-2): 119156.
3. Grünewald, S., Wahl, B., Bittner, F., Hungeling, H., Kanzow, S., Kotthaus, J., Schwering, U., Mendel. R.R., and B. Clement.
2009. The fourth molybdenum containing human enzyme mARC: cloning and reduction of N-dydroxylated structures. J. Med. Chem.
51, 8173 – 8177.
4. Havemeyer A., Lang J., Clement B. 2009. The fourth mammalian molybdenum enzyme mARC: current state of research.
Drug Metabolism Reviews. Publisher Taylor & Francis. 123-134.
5. Li, H.T., Samouilov, A., Liu, X. P., and Zweier, J. L., Characterization of the magnitude and kinetics of xanthine oxidasecatalyzed nitrite reduction - Evaluation of its role in nitric oxide generation in anoxic tissues, Journal of Biological Chemistry, 2001,
276, 24482-24489.
Р.А. Алыбаева, Г.Ж. Билялова, А.Н. Кожахметова
ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ К СВИНЦУ И ЦИНКУ ДЛЯ
СОЗДАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЕЕ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ
(Казахский национальный университет им. аль-Фараби)
В настоящей работе представлена оценка устойчивости к свинцу и цинку различных генотипов озимой пшеницы
в лабораторных условиях. Проведенный скрининг позволил выявить устойчивые и чувствительные формы.
Наиболее острая проблема, решение которой имеет практическое значение, является загрязнение
тяжелыми металлами агроценозов вблизи крупных промышленных центров. Отдельные сорта
различных видов продовольственных культур проявляют существенные различия по устойчивости к
142
действию почвенных загрязнителей[1,2]. Эти их свойства можно использовать в экологически чистом
производстве, подбирая наиболее устойчивые формы, мало накапливающие тяжелые металлы,
получать экологически безопасную продукцию. Металлоустойчивые формы также могут служить
донорами при создании толерантных к загрязнителям сортов растений [2]. Восточно-Казахстанский
регион характеризуется наличием большого числа техногенных загрязнителей,
среди которых
лидирующая роль принадлежит тяжелым металлам[3]. В связи с этим были исследованы различные
генотипы озимой пшеницы, важной сельскохозяйственной культуры, для выявления
металлоустойчивых видов с целью их дальнейшего использования в экологически чистом
производстве и селекционном процессе. Предыдущие исследования были проведены на различных
генотипах из мировой коллекции, в представленном исследовании были взяты генотипы из коллекции
Восточно-Казахстанского НИИ сельского хозяйства (ВКНИИСХ). Эти генотипы представляют
большой интерес, так как они районированы в регионе Восточного Казахстана.
Таким образом, объектами исследования стали различные генотипы озимой пшеницы,
районированные в регионе Восточного Казахстана: Сибинка, Булава, Мироновская 808, Минг-2,
116/271. Эксперименты были выполнены на 7-суточных проростках, выращенных на питательной
смеси, содержащей 0,1мМ СаSO4, ионы Pb в концентрации 200 и 400 мг/л (в виде соли Pb (NO3)2) или
ионы Zn в концентрации 200 и 400 мг/л (в виде соли ZnSO4). Измерение ростовых показателей
проводилось общепринятыми методами. Индекс толерантности или коэффициент Уилкинса вычисляли
по формуле: It=Ime/Ic, где Ime– прирост корней на растворе с исследуемым металлом, Iс- прирост корней
на растворе без металла[4].
Исследование генотипов из коллекции ВКНИИСХ показало, что исследуемые генотипы по росту
надземных органов при высокой концентрации свинца можно расположить следующим образом:
Сибинка>Мироновская 808 > Булава >Минг-2 >Комсомольская 56 (рисунок 1). Hаиболее устойчивыми
к действию свинца среди исследуемых генотипов можно считать проростки сортов озимой пшеницы
Мироновская –808 и Сибинка, наиболее чувствительными - сорт Комсомольская 56.
Коэффициент Уилкинса или индекс толерантности наибольший при низкой концентрации
свинца у сортов Мироновской 808 и Сибинка, средние у сортов Комсомольская 56 и Булава,
наименьший у сорта озимой пшеницы Минг-2. При высокой концентрации свинца наибольшие
коэффициенты Уилкинса у сорта Мироновская 808 и Сибинка, средние у генотипов Комсомольская 56
и Булава и наименьший у Минг-2. По результатам исследования роста корней при различных
концентрациях свинца в среде выращивания и индекса толерантности можно выделить сорта
Мироновская 808 и Сибинка как генотипы
с наиболее устойчивой корневой системой к
неблагоприятному действию свинца.
Длина корней уменьшалась в следующем порядке: Мироновская 808 >Сибинка> Булава > Минг2 > Комсомольская 56.
Таким образом, судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к действию свинца
среди исследуемых генотипов можно считать сорта озимой пшеницы Мироновская –808 и Сибинка,
наиболее чувствительным - сорт Комсомольская 56.
см
Проростки
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Мир-я 808
Минг- 2
Сибинка
Ком-я 56
контроль
Pb 200мг/л
Pb 400мг/л
Булава
Генотипы:1-Мирон-я 808, 2-Минг-2, 3-Сибинка, 4-Комсом-я 56, 5Булава
Рисунок 1 - Влияние свинца на формирование высоты проростков у различных генотипов пшеницы
из коллекции ВКНИИСХ
143
Исследование генотипов из коллекции ВКНИИСХ показало, что по росту надземных органов
при высокой концентрации цинка генотипы можно расположить следующим образом: Мироновская
808 >Сибинка> Булава > Комсомольская 56 > Минг-2 (рисунок 2).
Рисунок 2 - Влияние цинка на формирование высоты проростков у различных генотипов пшеницы
коллекции ВКНИИСХ
Длина корней при этой концентрации цинка уменьшалась в следующем порядке: Булава
>Мироновская 808 > Комсомольская 56 > Минг-2 >Сибинка.
Судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к цинку среди исследуемых видов
можно считать сорта Мироновская 808 и Сибинка. Следует отметить, что корни растений сорта
озимой пшеницы Булава были наиболее устойчивыми к действию цинка, наиболее чувствительными –
сорта Сибинка.
По результатам исследований можно сделать вывод, что по показателям роста надземных
органов, наиболее устойчивыми к действию свинца среди исследуемых генотипов являются сорта
озимой пшеницы Мироновская –808 и Сибинка, наиболее чувствительным - сорт Комсомольская 56. В
отношении цинка, наиболее устойчивыми среди исследуемых генотипов также являются сорта
Мироновская 808 и Сибинка. Наиболее чувствительными оказались проростки сортаМинг-2 и корни
сорта Сибинка.
Таким образом, судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к действию обоих
исследуемых металлов (свинцу и цинку) среди исследуемых генотипов можно считать проростки
сортов озимой пшеницы Мироновская 808 и Сибинка. Наибольший интерес для нас представляет рост
надземных органов,так как устойчивость надземных органов свидетельствует о том, что в надземные
органы поступает малотяжелых металлов или успешно работают защитные механизмы связывания
или другой их инактивации. Малое количество подвижных форм тяжелых металлов в надземных
органах говорит о том, что в зерно, которое является товарной частью пшеницы, также поступление
будет минимальным.
1. Ильин В.Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение. – Новосибирск: Наука, 1991.-150 С.
2. Молчан И.М. Селекционно-генетические аспекты снижения содержания экотоксикантов в растениеводческой
продукции // Сельскохозяйственная биология. -1996, № 1. - С.55-66.
3. Алыбаева Р.А. Оценка экологического состояния почв города Усть-Каменогорска // Вестник КазНУ, серия
экологическая. -2007. -2 (21). - С.40-44.
4. Wilkins D.S. The measurement of tolerance to edaphic factors by means of root growth // New Phytol. 1978. V. 80. №3. Р.
623-633.
***
Жұмыста зертханалық сабақта қыстық бидайдың əртүрлі генотиптерінің мырыш пен қалайыға төзімділігіне
бағалау көрсетілген. Жүргізілген зерттеулер нəтижесінде төзімді жəне сезімтал түрлер алынды.
***
In the present rabotepredstavlena sustainability assessment to lead and zinc with different genotypes of winter wheat in the
laboratory. Screening revealed a stable and sensitive forms of.
144
Р.С. Аимбетов 1,2, А.К. Бисенбаев 1, Д.Д. Сарбасов 2
GLY-934 ОБЕСПЕЧИВАЕТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИКТОРА С SIN1.
(1 Лаборатория молекулярной генетики НИИ проблем биологии и биотехнологии КазНУ им. альФараби, 2 The department of molecular and cellular oncology, The University of Texas MD Anderson Cancer
Center, Houston, TX)
mTOR (mammalian target of rapamycin) - важная киназа, находящаяся на пересечении сигнальных путей
ростовых факторов и питательных веществ. Существуя в составе двух мультипротеиновых комплексов - mTORC1 и
mTORC2 (mTOR complex 1/2) – данная киназа регулирует процессы клеточного роста и пролиферации. Нами
установлено, что остаток Gly-934 одного из компонентов mTORC2 - риктора – играет ключевую роль в обеспечении
его взаимодействия с белком Sin1.
mTOR - это центральная киназа консервированного у всех эукариот сигнального пути. В клетках
mTOR обнаруживается в виде двух комплексов - mTORС1 и mTORС2 [1, 2]. mTOR комплекс 1
(mTORC1), состоящий из mTOR, раптора и mLST8 передает сигналы, полученные от ростовых
факторов и питательных веществ, на модуляторы белкового синтеза S6K и 4EBP1.
Второй комплекс (mTORС2), помимо mTOR и mLST8, включает белки Sin1 и риктор. Комплекс
mTORC2 предпочтительно фосфорилирует протеин киназы семейства AGC по сайтам гидрофобных
мотивов, расположенных на С-конце [3]. Указанные особенности свойственны всем субстратам
mTORC2, таким как Akt и PKC, а также SGK.
Известно, что комплекс mTORС2 образуется путем независимого объединения гетеродимеров
риктор/Sin1 и mTOR/mLST8. Формирование тетрамера риктор/Sin1/mTOR/ mLST8 является
необходимым минимальным «ядром», определяющим киназные свойства mTORС2 [4].
Две работы, вышедшие в 2009 году, сообщают об идентичных фенотипах нематод C. elegans с
мутированным риктором [5, 6]. В генетических скринингах, нацеленных на идентификацию мутантов с
измененным запасом липидов, обе группы обнаружили ряд мутаций в единственном у C. elegans
гомологе гена риктора rict-1, приводящих к увеличению жировой массы, уменьшению размеров тела и
укорачиванию продолжительности жизни.
В скрине, выполненном Soukas et al. [6], аллельные формы mg450 и mg451 гена rict-1 содержали
нонсенс мутации. Мутанты, изолированные Jones et al. [5], содержали ранний преждевременный стоп
кодона в аллеле ft7 и замену одной аминокислоты в аллеле mg360. Наблюдаемые фенотипы были
реверсируемы трансгенной оверэкспрессией rict-1 дикого типа и фенокопировались РНКинтерференцией rict-1 и lst-8.
Эти данные указывают на то, что перечисленные фенотипические отклонения с большей
вероятностью относятся к нарушению работы mTORС2, чем к mTOR-независимым функциям риктора.
Необходимо отметить, что нарушение функции mTORС2 в результате замены единственной
аминокислоты в аллеле mg360 является любопытным фактом и требует дальнейшего исследования. На
данный момент известно, что мутация, приводящая к фенотипическим отклонениям у C. elegans,
связана с заменой Gly-1120 на глутаминовую кислоту [5]. Отдельный интерес представляет выявление
консервативных аминокислот риктора в участке мутации, связанной с фенотипическими отклонениями
у нематод.
Материалы и методы
Сайт-направленный мутагенез риктора. Все нуклеотидные замены проводились на фрагменте
400-1400 риктора посредством ПЦР с использованием соответствующих праймеров.
По завершении амплификации наличие продуктов ПЦР требуемой длины проверялось методом
агарозного гель-электрофореза. Наличие и отсутствие мутаций подтверждали секвенированием всей
вставки. Все мутированные фрагменты субклонировали в полноразмерный риктор по сайтам
рестрикции PacI/AgeI.
Культура клеток млекопитающих. Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM с 10%
ФБС, пенициллин/стрептомицином и 20 мМ L-глутамином в 37°С с 5% содержанием СО2 в атмосфере.
Плотность клеток позволяла свободное деление на протяжении всего эксперимента.
Трансфекция HEK293T. Для трансфекции 1×106 клеток HEK293T высаживали на 6 см чашки в
3 мл среды DMEM с 10% ФБС за день до трансфекции. Трансфекцию клеток осуществляли методом
кальциево-фосфатной преципитации: смешивали 1 мкг pRK5-myc-риктор и 400 нг pRK5-Sin1-V5 в
dH2О до конечного объема 175 мкл; к этому объему добавляли 200 мкл 2хHBSS (280 мМ NaCl, 10 мМ
KCl, 1.5 мМ Na2HPO4, 12 мМ декстрозы, 50 мМ HEPES, pH 7.1) и тщательно перемешивали. К
полученной смеси медленно, по каплям, добавляли 25 мкл 2М CaCl2, перемешивая содержимое
145
пробирки носиком после каждой капли. Далее инкубировали смесь 30 мин при комнатной температуре
для формирования преципитатов фосфата кальция и ДНК. После добавления полученного раствора
ДНК и солей к HEK293T полученные преципитаты осаждались на монослой и поглощались клетками
путем эндоцитоза. Питательную смесь меняли на следующий день. Лизис клеток проводили через 48
часов после трансфекции.
Лизис клеток и иммунопреципитация. Все чашки помещали на лед, удаляли среду, промывали
клетки холодным PBS и добавляли холодный буфер для лизиса (40 мМ HEPES (pH 7.5), 120 мМ NaCl,
1 мМ EDTA, 10 мМ Na-пирофосфата, 10 мМ Na-глицерофосфата, 50 мМ NaF, 1% Triton X-100),
содержащий набор ингибиторов протеаз (Roche). Объем буфера зависел от плотности клеточного слоя
и диаметра чашки.
Клетки соскабливали с поверхности чашки продольными движениями пластмассового шпателя,
ресуспендировали клетки пипетированием и переносили суспензию в пробирки. Для повышения
эффективности лизиса собранный лизат инкубировали 20 мин при 4°С на ротаторе. Растворимые
фракции клеточных лизатов изолировали центрифугированием при 16,000 × g в течение 15 мин при
4°С.
Для иммунопреципитации в очищенные лизаты, содержащие 1 мг тотального белка, вносили 4
мкг анти-myc антител с последующей инкубацией с ротацией в течение 90 мин при 4°С.
Иммуноосаждение осуществляли 45 мкл 25% протеин G-агарозы (Pierce) (50% смолу смешивали с
охлажденным PBS из расчета 1:1) в течение 1 ч при 4°С. По завершении инкубации осаждали смолу
центрифугированием и удаляли супернатант. Смолу промывали четыре раза лизисным буфером.
Остаточный объем буфера удаляли вакуумным отсосом через 25G иглу. К смоле добавляли 20 мкл 2Х
буфера Лэммли для образцов и кипятили 5 мин при 95°С. Полученные образцы белков разделялись
SDS-PAAGE, переносились на PVDF мембраны и анализировались методом Вестерн блоттинга.
Сборка димера риктор/Sin1. 1×106 клеток HEK293T высаживали на 6 см чашки. На следующий
день клетки 50-60% конфлюентности трансфецировали 1 мкг плазмиды pRK5-myc-rictor и 400 нг
pRK5-Sin1-V5 методом осаждения ДНК фосфатом кальция. Через 24 ч инкубации меняли среду на
свежую. Лизис клеток и иммунопреципитацию димеров осуществляли на второй день.
Результаты и обсуждение
Для выявления консервативных участков в аминокислотных последовательностях риктора нами
было проведено множественное выравнивание полипептидов риктора человека, мышей, дрожжей и
нематод. На рисунке 1 представлен участок полипептидной цепи риктора с высокой степенью
эволюционной гомологии, окружающий сайт замены G1120E. Как видно из рисунка, мутированный у
C. elegans глицин в положении 1120 (Gly-1120), является эволюционно консервированным остатком,
соответствующим глицину в положении 934 (Gly-934) у человека и мышей.
Рисунок 1 - Выравнивание ортологов риктора. Остаток Gly-1120 (Gly-934 у мышей и человека)
консервирован среди эукариот (обведен красным пунктиром). I. C. elegans (F29C12.3), II. H. sapiens
(AAS79796.1), III. M. musculus (NP_084444.3), IV. S. cerevisiae (DAA07754.1).
Роль мутации G934E в составе риктора в функционировании сигнальной системы mTORС2 до
настоящего момента не изучена. Не анализировано влияние мутации G934E на сборку, а также
киназную активность mTORC2.
В связи с этим для изучения роли мутации G934E в функционировании mTORС2 указанная
аминокислотная замена была интродуцирована в кДНК риктора человека методом сайт-направленного
мутагенеза. Также с целью изучения влияния типа аминокислот в положении 934 на работу комплекса
mTORC2 была произведена замена Gly-934 на ряд других аминокислот (аспарагиновую кислоту,
лизин, лейцин, глутамин), отличающихся своими электростатическими свойствами.
146
Как описано выше, для определения способности G934E-мутанта риктора связываться с Sin1
были созданы рекомбинантные конструкции с генами риктора и Sin1, клонированными в плазмидный
вектор pRK5 в рамку считывания эпитопов myc и V5 соответственно (pRK5-myc-rictor и pRK5-Sin1V5). Для изучения взаимодействия мутантного риктора с белком Sin1 указанные рекомбинантные
конструкции ко-трансфецировались в клетки HEK293T.
Ко-трансфецированные рекомбинантыми конструктами pRK5-myc-rictor и pRK5-Sin1-V5 клетки
HEK293T инкубировали в среде DMEM с 10% ФБС течение 48 часов. По истечении срока инкубации
клетки лизировались и уровень экспрессии генов риктора и Sin1 определялся с помощью
иммуноблоттинга белковых экстрактов с применением моноклональных антител к эпитопам myc и V5.
В качестве отрицательного контроля использовали лизаты нетрансфецированных клеток. Результаты
этих экспериментов показаны на рисунке 2. Из рисунка видно, что при использовании для
трансфекции равного количества кДНК (1х) риктора дикого и мутантного типов наблюдался низкий
уровень экспрессии мутантной формы по сравнению с диким типом. В связи с этим в целях
оптимизации экспрессии мутантного риктора количество его кДНК, использованной для трансфекции,
было увеличено в два (2х), четыре (4х) и пять раз (5х). По мере увеличения количества кДНК
мутантной формы риктора наблюдается усиление ее экспрессии. Эквивалентная дикому типу
экспрессия G934E-риктора в HEK293T наблюдалось при использовании пятикратного (5х) количества
кДНК.
Известно, что связанные риктор и Sin1 обуславливают взаимную стабильность [7]. Из рисунка 2
видно, что при низком уровне экспрессии мутантного риктора наблюдается одновременное понижение
сигнала от Sin1. В связи с этим для приведения содержания Sin1 в клетках, трансфецированных
мутантной формой риктора, к уровню Sin1 в клетках, трансфецированных риктором дикого типа, в
отношении кДНК Sin1 были предприняты соответствующие оптимизационные меры.
Рисунок 2 - Влияние мутации G934E на взаимодействие риктора с Sin1. 1х-5х – количество кДНК
риктора и Sin1, использованное для трансфекции.
Количество кДНК Sin1 для трансфекции было увеличено в два (2х), четыре (4х), пять (5х) раз.
Уже при 2х увеличении был достигнут уровень экспрессии положительного контроля, а при 4х
наступало насыщение, то есть при дальнейшем увеличении количества кДНК Sin1 существенного
повышения экспресии не происходило.
Таким образом, с помощью увеличения количества кДНК мутантного риктора и Sin1,
использованного для ко-трансфекции HEK293T, нами была оптимизирована их экспрессия до уровня
положительного контроля.
Далее мы приступили непосредственно к изучению влияния глутаминовой кислоты в положении
934 в составе риктора человека на димеризацию последнего с белком Sin1.
Для исследования роли Gly-934 во взаимодействии риктора и Sin1 мы проводили
иммунопреципитацию G934E-формы риктора из лизатов HEK293T, ко-экспрессирующих мутантный
риктор и Sin1, при помощи моноклональных антител к эпитопу тэга myc. Как видно из рисунка
мутантная форма риктора ко-осаждается со значительно меньшим количеством Sin1 по сравнению с
контролем.
Полученные результаты указывают на то, что замена глицинового остатка в позиции 934 на
глутаминовую кислоту в рикторе человека негативно влияет на способность последнего связыватся с
Sin1.
В результате множественного выравнивания кроме участка Gly-934 было обнаружено несколько
других эволюционно консервированных аминокислот, в частности Leu-923 и Leu-943, для изучения
147
влияния на mTORC2 которых мы внедрили замены L923E и L934E в кДНК риктора человека (рисунок
1).
Какова роль этих остатков в формиривании димера между риктором и Sin1? Для поиска ответа
на данный вопрос консервированные остатки Leu-923 и Leu-943, отстоящие примерно на 10
аминокислот от Gly-934 в сторону N- и C-конца соответственно (см. рисунок 1), были заменены на
отрицательно заряженные глутаминовые кислоты. Полученные мутантные формы кДНК-гена риктора
были экспрессированы совместно с кДНК Sin1 в культуре HEK293T.
Иммуноблоттинг тотальных белковых экстрактов из клеток, трансфецированными кДНК
мутантного риктора показал, что оба мутанта, равно как и мутант G934E, проявили низкий уровень
экспрессии в HEK293T. Для выравнивания уровней экспрессии всех компонентов была произведена
оптимизация экспрессии мутантов путем увеличения количества ДНК, используемого для
трансфекции, в пять раз, что отражено на рисунке 3.
Результаты иммунопреципитации L923E- и L943E-форм риктора показали, что они, в отличие от
мутанта G934E, оказались способны образовывать комплекс с Sin1. Было обнаружено лишь небольшое
понижение качества формирования гетеродимера по сравнению с риктором дикого типа.
Рисунок 3 - Влияние замен L923E и L943E на взаимодействие риктора с Sin1. 5х – количество кДНК
риктора и Sin1, использованное для трансфекции.
Три изученных до настоящего момента мутанта риктора (G934E, L923E, L943E) проявляли
низкий уровень экспрессии. Известно, что точечные аминокислотные замены могут нарушать
правильный фолдинг белков, дестабилизируя их и направляя по пути протеосомальной и/или
лизосомальной деградации. Например, в случае мутантных рецепторов ЛПНП было показано, что
замена единственной аминокислоты Cys-358 на тирозин приводит к нарушению пост-трансляционного
созревания полипептидной цепи, усиливает лизосомальную деградацию рецептора и, в итоге,
интерферирует с функциями поглощения ЛПНП клетками, приводя к гиперхолестеринемии. [8].
Результаты иммунопреципитации L923E- и L943E-форм риктора показали, что они, в отличие от
мутанта G934E, оказались способны образовывать комплекс с Sin1. Было обнаружено лишь небольшое
понижение качества формирования гетеродимера по сравнению с риктором дикого типа.
Таким образом, три нами изученных мутанта риктора (G934E, L923E, L943E) проявляли низкий
уровень экспрессии. Показано, что замена незаряженного остатка Gly-934 на отрицательно
заряженную глутаминовую кислоту препятствует связыванию риктора с Sin1, тогда как такая же
замена в случае Leu-923 и Leu-943 не влияет на взаимодействие этих белков. Данные результаты
указывают на то, что аминокислотный остаток Gly-934 играет исключительно важную роль в
формировании комплекса риктор-Sin1.
Для дальнейшего исследования того, как мутация Gly-934 влияет на связывание риктора с Sin1,
данный остаток был заменен на заряженные, полярные незаряженные (гидрофильные) и неполярные
(гидрофобные) аминокислоты. В данном случае нас интересовало влияние аминокислот,
отличающихся своими электростатическими свойствами, на формирование димера риктор/Sin1.
В качестве отрицательно заряженной аминокислоты нами была выбрана аспарагиновая кислота.
В качестве положительно заряженной - лизин. Для полярной незаряженной - глутамин. Для
неполярной - лейцин.
Электростатически мутация G934D представляет собой то же, что и G934E. Поэтому
гипотетически данная замена будет обладать таким же эффектом на сборку риктор/Sin1. Лейцин,
будучи неполярным, как и глицин, в положении 934 скорее всего будет повторять фенотип дикого
148
типа. Наибольший интерес представляют собой аминокислоты лизин и глутамин, влияние которых на
димеризацию риктора с Sin1 с учетом имеющихся данных непредсказуемо.
При анализе иммуноблотов тотальных экстрактов клеток, трансфецированных кДНК риктора
дикого типа и его мутантными формами, было обнаружено, что замена Gly-934 на кислотную
аспарагиновую кислоту или основной лизин фенокопирует мутацию G934E в том плане, что уровень
их экспрессии снижен, а для ее оптимизации мы в пять (5х) раз увеличили количество кДНК G934D- и
G934K-мутантов риктора и Sin1 (рис. 4).
Иммунопреципитаты G934D- и G934K-мутантов риктора показали, что их взаимодействие с Sin1
ослаблено по сравнению с положительным контролем. Подобный эффект мутантов G934D и G934K
говорит о том, что замена Gly-934 на заряженные аминокислоты препятствует связыванию риктора с
Sin1. Следует отметить, что положительность и отрицательность заряда не играет в данном случае
принципиального значения.
Замена Gly-934 на неполярный лейцин, как и было предположено выше, не влияла ни на
экспрессию риктора, ни на формирование им гетеродимера с Sin1.
Рисунок 4 - Влияние типов аминокислот на взаимодействие риктор-Sin1. 1х, 5х – количество кДНК
риктора и Sin1, использованное для трансфекции.
В случае же полярного незаряженного глутамина было показано, что мутация G934Q
проявляется как фенотип дикого типа. Иммуноблоттинг экстрактов из G934Q-трансфецированных
клеток показал экспрессию, эквивалентную положительному контролю. Иммунопреципитаты данной
мутантной формы риктора со-осадили такое же количество Sin1, что и дикий тип.
Таким образом, приведенные данные показывают, что замена остатка Gly-934 на положительно
или отрицательно заряженные, но не на незаряженные аминокислоты обладает значительным
влиянием на риктор, нарушая его способность связываться с Sin1.
1. Loewith R., Jacinto E., Wullschleger S., Lorberg A., Crespo J.L., Bonenfant D., Oppliger W., Jenoe P., Hall M.N. Two TOR
complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control // Mol Cell. - 2002. - Vol.10. - P.457–
468.
2. Chen C.-H., Shaikenov T., Aimbetov R., Peterson T.R., Bissenbaev A.K., Lee S.-W., Wu J., Lin H.-K., Sarbassov D.D. ER
stress inhibits mTORC2 and Akt signaling through GSK-3β-mediated phosphorylation of rictor // Science Signaling. - 2011. Vol.4(161). - P.ra10.
3. Kannan N., Haste N., Taylor S.S., Neuwald A.F. The hallmark of AGC kinase functional divergence is its C-terminal tail, a
cis-acting regulatory module // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - Vol.104(4). - P.1272-7.
4. Sarbassov D.D., Guertin D.A., Ali S.M., Sabatini D.M. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR
complex // Science. - 2005. - Vol.307. - P.1098–1101.
5. Jones K.T., Greer E.R., Pearce D., Ashrafi K. Rictor/TORC2 regulates Caenorhabditis elegans fat storage, body size, and
development through sgk-1 // PLoS Biol. - 2009. - Vol.7. - P.0604-0615.
6. Soukas A.A., Kane E.A., Carr C.E., Melo J.A., Ruvkun G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life
span in Caenorhabditis elegans // Genes Dev. - 2009. - Vol.23. - P.496-511.
7. Sarbassov D.D., Ali S.M., Kim D.H., Guertin D.A., Latek R.R., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. Rictor, a
novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton //
Curr Biol. - 2004. - Vol.14. - P.1296–1302.
8. Martín de Llano J.J., Fuertes G., Andreu E.J., Puig O., Chaves F.J., Soutar A.K., Armengod M.E., Knecht E. A single point
mutation in the low-density lipoprotein receptor switches the degradation of its mature protein from theproteasome to the lysosome //
Int J Biochem Cell Biol. - 2006. - Vol.38(8). - P.1340-51.
149
***
mTOR (mammalian target of rapamycin) is an important hub kinase of growth factor and nutrient signaling. Functioning as a
part of two distinct multiprotein complexes - mTORC1 and mTORC2 (mTOR complexes 1 and 2) – it regulates cell growth and
proliferation. We have established that Gly-934 residue of mTORC2’s rictor plays a key role in maintaining rictor-Sin1 interaction.
***
mTOR өсу факторлары мен қоректік заттардың сигналдык жуйесінің тоғысында орналаскан жəне mTORC1 жəне
mTORC2 мультипротеиндік кешендерінін құрамына кіретін негізгі киназа болып табылады. Осы жұмыста mTORC2
кешеніндегі риктордың Gly-934 қалдығы риктор-Sin1 əсерлесуінде басты рөл ойнайтындығын көрсеттік.
С.Ш. Асрандина, С.С.Кенжебаева, С.Д. Атабаева
ҚҰРАМЫНДА КҮКІРТІ БАР ӨСУДІ РЕТТЕГІШ СИНТЕТИКАЛЫҚ РЕГУЛЯТОРЛАРДЫҢ
БИДАЙДЫҢ ТҰЗДЫ ОРТАҒА ТӨЗІМДІЛІК ҚАСИЕТІНЕ ТИГІЗЕТІН ƏСЕРІ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті)
Мақалада жаздық бидай «Жеңіс» сортының тұзды ортаға төзімділік қасиетіне құрамында күкірті бар өсуді
реттегіш синтетикалық регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") тигізетін əсері көрсетілген.
Агроөндірістік кешеннің дамуы еліміздегі азық-түлік қауіпсіздікті қамтамасыз етіп, экспорттық
потенциалды дамытады.
Осыған орай, республикамыздың аграрлық саласының бетпердесін
анықтайтын бидай өндірісінің маңызы ерекше. Соңғы жылдары Қазақстанда төменгі сапалы астық
мөлшерінің жоғарылауы байқалады. Оның басты себептеріне дəнді дақылдардың өсіру
технологияларын дұрыс сақтамауы, ауыспалы егістіктің бұзылуы, қараусыз қалған егістік жерлерде
қауіпті зиянкестердің көбеюі жəне карантинді арам шөптердің таралуы болып табылады. Сондай-ақ,
республикамыздың бүгінгі таңдағы экологиялық, яғни
қолайсыз климаттық жағдайларының
(қуаңшылық, құрқақшылық, нөсер жауын, жел, боран т.б.) күннен күнге өршуі де астық сапасына теріс
əсерін тигізуде. Осыған байланысты ғалымдар мен мамандардың алдында ауылшаруашылық
дақылдардың қолайсыз факторларға толерантты түрлерін іздестіру; биологиялық төзімді түрлерінің
физиологиялық, генетикалық жəне эпигенетикалық қасиеттерін терең зерттеу; молекулярлық жəне
гендік инженерия жетістіктерін қолданып, белгілі бір факторға төзімді бидайдың жаңа сорттарын алу
міндеттері қойылған.
Бүгінгі таңда ауылшаруашылық практикасында өсімдіктердің өсіп дамуына əсер ететін
физиологиялық ырықты заттардың, яғни өсу регуляторлардың маңызды роль атқаратындығы
айқындалған. Бұл өсу регуляторлардың өсімдіктердің өсіп-даму процестеріне қолайлы əсер
ететіндігімен түсіндіріледі. Кəзіргі таңдағы ауылшаруашылық ғылым саласында табиғаты
фитогормондарға жатпайтын өсу регуляторлардың жаппай ашылуы орын алуда. Оның айғағы ретінде
соңғы жылдары үлкен масштабта жүргізілген зерттеу жұмыстарының нəтижесінде химиялық жолмен
синтезделіп алынған, өсімдікке көп жақты əсер ететін, табиғаты əр түрлі биологиялық ырықты өсу
регуляторлары (эпин, крезацин, кавказ, эмистим т.б.) синтезделіп алынды. Бірқатар ТМД жəне шетел
ғалымдары мен мамандардың жүргізіп отырған ізденістері нəтижесінде өсімдік шаруашылығында əр
түрлі культуралардың өнімділігін жоғарылату жəне сыртқы ортаның қолайсыз (абиотикалық,
биотикалық) факторларына төзімділігін арттыру мақсатында өсу регуляторларды қолдану мүмкіндігі
мен олардың тиімділігі жан-жақты көрсетілген [1-5]. Əйтсе де, бүгінгі таңда өсу регуляторлардың
өсімдікке тигізетін физиологиялық əсерлердің механизімдері мен заңдылықтары толық зерттелмеген
əрі бұл проблема төңірегінде əлі де болса терең зерттеулерді талап етеді.
Біздің зерттеу жұмысымыздың мақсаты бидай «Жеңіс» сортының тұзды ортаға төзімділік
қасиетіне құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10")
тигізетін əсерін зерттеу болып табылды.
Зерттеу əдістері мен материалдар
Зерттеу нысаны ретінде жаздық бидай «Жеңіс» сорты алынды. Бидайдың өну белсенділігін
анықтау үшін тұқымдар Петри табақшаларында, температурасы 20-220С қараңғы термостатта 3-5 күн
бойы өсірілді. Өскіндер арнайы кюветаларға көшіріліп, температурасы 23-250С жарық бөлмеде
өсірілді.
Зерттеу жұмысында бақылау варианты ретінде 0,1 µM CaSO4 ерітіндісі алынды. Бидайдың тұзға
төзімділігіне синтетикалық өсу регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") тигізетін əсерін анықтау
мақсатында олардың төмендегідей концентрациялары алынды: 0,001%; 0,0001%; 0,00001%. Тұзды
ортаны тудыру үшін NaCl 0,6%; 1,0% жəне 1,2 % ерітінділері қолданылды. Бидайдың өсу
белсенділігін анықтау үшін 12 күндік өскіндер алынды.
Зерттеу нəтижелері.
Зерттеу нəтижесінде бидайдың өну қарқыны құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық
регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") табиғаты мен концентрацияларынан тəуелді болды. Бақылау
вариантына қарағанда 0,0001% Т-10 жəне 0,00001% Т-10" өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлар
бидайдың өну қарқынын біршама (6,6 -13,3%) арттыратыны айқындалды. Өсуді реттегіш синтетикалық
150
регуляторларды өзара салыстырғанда 0,0001% Т-10 -ға қарағанда 0,00001% Т-10" қосылған ортада
бидайдың өну белсенділігі едəуір жоғарғы (100 %) болатыны анықталды.
Алайда Т-10" жоғарғы (0,001%; 0,0001%) концентрациялары бидайдың өну белсенділігін
арттырмады. Бұл көрсеткіштер бақылау вариантынан біршама төмен болды. Т-10 барлық
концентарциялары бидайдың өну қарқынын арттырмайтыны анықталды. Əсіресе Т-10 жоғарғы (0,001
%) концентрациясы бидайдың өнуін тежеп, ингибитр тəрізді əсер ететіні байқалды.
Өсу регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10")
кейбір түрлері жəне олардың белгілі бір
концентрациялары бидайдың тұзды ортаға (0,6 - 1,0 % NaCl) төзімділігін арттырып, оның өну
белсенділігін жоғарылататыны байқалды. Мəселен, 0,6 % NaCl ерітіндісінде бидайдың өну белсенділігі
0,00001% Т-10 əсерінен 20 % артатыны, ал 1,0 % NaCl ерітіндісінде 0,0001% Т-10 əсерінен 10 %
артатыны анықталды. Т-10" орташа концентрациясы (0,0001%) бидайдың тұзға (1% NaCl) төзімділігін
арттырып, оның өну қарқынын 7 % жоғарыласа, ал Т-10' барлық концентрациялары бидайдың тұзға
төзімділігін арттырмайтыны байқалды.
Бидайдың өсу белсенділігі 12-ші тəулікте есепке алынды. Өскіндердің өсу параметрлері жəне
биомассалары өлшенді. Зерттеу нəтижесінде бақылау вариантына қарағанда ортада NaCl мөлшері
жоғарлаған сайын бидайдың өсу қарқыны соғұрлым тежелетіні байқалды. Барлық варианттарда
(бақылау,тəжірибе) өскіндердің тамыр жүйелерінің даму қарқыны едəуір тежелетіні байқалды.
Өскіндердің құрғақ биомассасының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес болды.
Бидайдың өсу белсенділігін құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлар (Т10, Т-10', Т-10") арттырмайтыны анықталды. Яғни, бақылау вариантымен салыстырғанда барлық
тəжірибелік варианттарда бидайдың өсу қарқыны төмен болды. Əйтсе де тəжірибелік варианттарда
өскен өскіндердің дұрыс өсіп-дамуы бақылау вариантында өскен өскіндерден қалыспады.
Тəжірибелік варианттарды өзара салыстырғанда бидайдың өсу қарқынын Т-10 мен Т-10" төменгі
(0,00001%), ал Т-10' ортаңғы (0,0001%) жəне төменгі (0,00001%) концентарциялары анағұрлым
жоғарылататыны анықталды. Барлық тəжірибелік варианттарда өскіндердің тамыры мен жер үсті
мүшелерінің құрғақ биомассаларының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес болды. Т-10' жоғарғы
концентрациясы бидайдың өсуін тежеп, ингибитрлік қасиетін танытты.
Бидайдың тұзға төзімділігі ортадағы синтетикалық регуляторлардың табиғатынан жəне
олардың концентрацияларынан тəуелді болды. Т-10 төменгі (0,00001%) концентрациясы ортаның
тұздылығын (0,6-1,2% NaCl) тежеп, өскіндердің өсу қарқынын едəуір жоғарылататыны айқындалды
(Сурет 1).
T-10 0,00001%+1,2% NaCI
T-10 0,00001%+1% NaCI
T-10 0,00001%+0,6% NaCI
T-10 0,0001%+1,2% NaCI
T-10 0,0001%+1% NaCI
T-10 0,0001%+0,6% NaCI
T-10 0,001%+1,2% NaCI
T-10 0,001%+1% NaCI
T-10 0,001%+0,6% NaCI
1,2% NaCI
1% NaCI
0,6% NaCI
0
тамыр
5
10
15
20
25
см / өсімдік мүшесі
жер үсті мүшелері
Сурет 1 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10 тигізетін əсері
Əсіресе 0,6 % NaCl əсерін тежеп, бақылау вариантымен салыстырғанда бидай өскіндерінің
тамыры мен жер үсті мүшелерінің екі есе ұзарып өсуіне оптималды жағдай тудыратыны анықталды.
Бидай өскіндерінің ылғал жəне құрғақ биомассаларының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес
болды. Яғни, Т-10 барлық төменгі концентрациялары бидайдың құрғақшылыққа төзімділігін
арттырып, бидай өскіндерінің биомассаларының бақылау вариантына қарағанда жоғары мөлшерде
жинақталуына қолайлы жағдай тудыратыны анықталды.
151
T-10′ 0,00001%+1,2% NaCI
T-10′ 0,00001%+1% NaCI
T-10′ 0,00001%+0,6% NaCI
T-10′ 0,0001%+1,2% NaCI
T-10′ 0,0001%+1% NaCI
T-10′ 0,0001%+0,6% NaCI
T-10′ 0,001%+1,2% NaCI
T-10′ 0,001%+1% NaCI
T-10′ 0,001%+0,6% NaCI
1,2% NaCI
1% NaCI
0,6% NaCI
0
тамыр
5
жер үсті мүшесі
10
15
20
см / өсімдік мүшесі
Сурет 2 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10' тигізетін əсері
Т-10' ортаңғы (0,0001%) концентрациясы бидай өскіндерінің 0,6 % NaCl тигізетін əсеріне
төзімділігін арттырып, бидайдың өсу қарқынын едəуір арттыратыны байқалды. Сонымен қатар, Т-10'
концентрациясы неғұрлым төмендеген сайын, соғұрлым бидай өскіндердің тамырларының қарқынды
өсуі орын алатыны байқалды (сурет 2).
T-10" 0,00001%+1,2% NaCI
T-10" 0,00001%+1% NaCI
T-10" 0,00001%+0,6% NaCI
T-10" 0,0001%+1,2% NaCI
T-10" 0,0001%+1% NaCI
T-10" 0,0001%+0,6% NaCI
T-10" 0,001%+1,2% NaCI
T-10" 0,001%+1% NaCI
T-10" 0,001%+0,6% NaCI
1,2% NaCI
1% NaCI
0,6% NaCI
0
тамыр
5
10
15
20
см/өсімдік мүшесі
жер үсті мүшесі
Сурет 3 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10" тигізетін əсері
0,6 % NaCl ортасында өскіндердің ылғал жəне құрғақ биомассаларының қарқынды
жианқталуына Т-10' ортаңғы (0,0001%) концентрациясы қолайлы жағдай туғызды. Сондай-ақ, тұзды
орталарда бидай тамырларының қарқынды өсуі мен ылғал жəне құрғақ биомассаларының қарқынды
жинақталуына Т-10' төменгі (0,00001%) мөлшері оптималды болатыны анықталды. Т-10' жоғарғы
мөлшері тұздылығы əр түрлі орталарда тамырлардың өсу қарқынын бірдей деңгейде тежейтіні
байқалды.
Бидайдың өсу қарқынына Т-10" оңтайлы əсері онша байқалмады. Əйтсе де, тұздылығы əр түрлі
орталарда Т-10" жоғарғы концентарциясы бидай өскіндердің тамырларының ұзарып өсуіне едəуір
ықпал ететіні байқалды.
Ал Т-10" төменгі концентарциясы бидайдың 0,6-1,0 % NaCl əсеріне төзімділігін арттыратыны,
ал Т-10" ортаңғы концентарциясы ортадағы тұздың мөлшері жоғарылаған сайын бидайдың төзімділігін
тежейтіні анықталды (Сурет 3). Бидай өскіндерінің ылғал жəне құрғақ билмассаларының жинақталуы
осы заңдылыққа сəйкес болады.
152
Қорыта айтқанда, бидай «Жеңіс» сортының өніп-өсу белсенділігі ортадағы NaCl мөлшерінен
тəуелді болды. NaCl концентрациялары неғұрлым жоғарылаған сайын, бидайдың өніп-өсу қарқыны
төмендейтіні анықталды. Құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың Т10 ортаңғы (0,0001%) жəне Т-10" төменгі (0,00001%) концентрациялары бидайдың өну белсенділігін
анағұрлым арттыратыны айқындалды. Ал бидайдың өсу қарқынын арттырмайтыны анықталды. Əйтсе
де тəжірибелік варианттарда бидайдың өсіп-дамуы бақылау вариантында өскен өскіндерден
қалыспады. Тəжірибелік варианттарды өзара салыстырғанда бидайдың өсу қарқынын Т-10 мен Т-10"
төменгі (0,00001%), ал Т-10' ортаңғы (0,0001%) жəне төменгі (0,00001%) концентарциялары анағұрлым
жоғарылататыны анықталды. Тұзды ортада Т-10 орташа жəне төменгі, ал Т10" төменгі
концентрациялары бидайдың өну белсенділігін арттыратыны анықталды. Ал бидайдың өсу қарқынына
Т-10 мен Т-10" төменгі, ал Т-10' ортаңғы жəне төменгі концентарциялары оптималды жағдай
тудыратыны анықталды.
1. Громов, А.А. Эффективность регуляторов роста и биопрепаратов на озимой пшенице и просе / А.А. Громов, В.Б.
Щукин, В.Н. Варавва // Земледелие.- 2005.- № 6.- С. 34-35.
2. Щукин, В.Б. Эффективность обработки семян озимой пшеницы физиологически активными веществами и
биопрепаратами / В.Б. Щукин, А.А. Громов, Н.В.Щукина // Земледелие.- 2007.- № 6. – С. 32.
3. Шаповал О.А. Формирование урожая озимой пшеницы при обработке регуляторами роста // Плодородие. 2004
.№3(18). с. 16.
4. Тарасенко С.А., Дорошкевич Е.И., Тарасенко B.C. Влияние стимуляторов роста растений на урожай и качество
сельскохозяйственных культур. Тез. док. VI Междунар, конференц. «Регуляторы роста и развития растений». -М.: Изд-во
МСХА, 2001. с. 280.
5. Немченко В.В. Применение регуляторов роста для повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям
произрастания. Тез. док. VI Междунр. конференц. «Регуляторы роста и развития растений». М.: Изд-во МСХА, 2001.-с. 263.
***
В работе изучено влияние серосодержащих синтетических регуляторов роста (Т-10, Т-10', Т-10") на солеустойчивость
яровой пшеницы сорта «Женис». Выявлены влияние регуляторов роста на прорастание, рост и развитие пшеницы в условиях
засоления.
***
In work influence synthetic regulators of growth (Т-10, Т-10 ', Т-10 ") on salt-endurance of spring wheat of a grade of "Zhenis"is
studied. Influence of regulators of growth on germination, growth and and development of wheat in the conditions of salinization.
С.Д. Атабаева, С.С. Кенжебаева.
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ДЛЯ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ
(Казахский национальный университет им.аль-Фараби)
В настоящей работе проведен обзор литературных данных последних лет о возможностях
применения трансгенных растений для фитореммедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами.
Приведены данные литературы о возможности получения ряда растений-трансформантов, обладающих
повышенной способностью аккумулировать во внутриклеточных структурах (преимущественно в
вакуолях) и в межклеточном пространстве конъюгаты эндогенных соединений с токсикантами. Генноинженерные работы, направленные на повышение эффективности фиторемедиационных свойств
раcтений, особенно интенсивно ведутся в течение последних лет. Манипуляция экспрессией
фермента γ-глутамил-Цис-синтетазы, включающегося в синтез глутатиона и фитохелатинов, может
быть отличным подходом для повышения устойчивости растений, так как фермент фитохелатинсинтаза не может являться
лимитирующим фактором для
синтеза фитохелатинов из-за
конститутивной экспрессии в растениях и активированием присутствием металлов. Регуляция синтеза
глутатиона способствует аккумуляции тяжелых металлов и увеличению устойчивости трансгенных
растений. Приведены данные литературы о возможности использования гена фермента глутатион-Sтрансфераза для создания трансгенных растений.
Фиторемедиация за последнее десятилетие из концептуального методологического подхода
превратилась в экологически важную, конкурентоспособную коммерческую технологию для очистки
окружающей среды от органических и неорганических токсичных соединений. Для разных
фиторемедиационных приемов, используемых на практике, таких как фитоэкстракция, ризодеградация
(совместное действие микроорганизмов и растений), фитодеградация, фитостабилизация,
ризофильтрация и др., которые уже используются в практических целях, крайне важный фактор для
успешной реализации этих технологий - наличие подходящих растений, активно усваивающих
токсиканты. Эффективность процессов фиторемедиации в значительной степени определяется
способностью самого растения усваивать и накапливать в клеточных структурах токсиканты.
Прогресс, связанный с фиторемедиацией окружающей среды, загрязненной органическими
токсикантами, по своей масштабности значительно превосходит аналогичные процессы, связанные с
усвоением неорганических токсикантов и радионуклидов. Это объясняется долговременной селекцией
подходящих для этого процесса растений, приспособленностью к конкретной почвенно-климатической
153
зоне, урожайностью, способностью накапливать большую биомассу, наличием соответствующих
физиологических (способность к транспирации) и морфологических (развитая корневая система)
характеристик, адаптацией к полевым условиям, наличием соответствующих ферментных систем и др.
Указанные выше качества и, возможно, некоторые другие обусловливают усвоение и глубокую
деградацию
органических
токсикантов
растениями,
т.е.
именно
ими
определяется
фиторемедиационный потенциал растений. В этом направлении достигнут вполне определенный
прогресс клонированием генов. Уже получен ряд растений-трансформантов, обладающих
повышенной способностью аккумулировать во внутриклеточных структурах (преимущественно в
вакуолях) и в межклеточном пространстве конъюгаты эндогенных соединений с токсикантами. В этом
направлении исследования интенсивно развиваются во многих странах мира [1].
Около двух десятков лет широко обсуждается возможность использования растений для очистки
почв, грунтовых вод и водоемов от неорганических токсикантов. Судя по достигнутым результатам,
несомненно, что фитоэкстракция тяжелых металлов в условиях in situ является наиболее дешевой, не
затрагивающей структуры почвы технологией, которая все больше привлекает внимание как ученых,
так и практиков-аграриев, а также экологов.
В
литературе
описаны
растения-трансформанты,
характеризующиеся
повышенной
фитоэкстракционной способностью. Генно-инженерные работы, направленные на повышение
эффективности фиторемедиационных свойств раcтений, особенно интенсивно ведутся в течение
последних лет. Первые широкомасштабные полевые исследования были проведены в начале 2000 г. в
США. Наиболее значимые работы по получению рекомбинантных растений, а их уже накопилось
свыше 100, осуществлялись в разных направлениях.
Предполагают, что фиторемедиация коммерциализировалась бы очень быстро, если
поглощающая способность растений гипераккумуляторов, как T. caerulescens, трансформировалась к
высокопродуктивной культуре, как Indian mustard (Brassica juncea) или кукуруза (Zea mays).
Биотехнология была успешно применена для манипуляции процессами поглощения металлов и
свойствами устойчивости у нескольких видов. Например, у табака (Nicotiana tabacum) увеличивалась
устойчивость к металлу при экспрессии генов синтеза металлотионеинов и других металлсвязывающих белков.
Для определения лимитирующих факторов для аккумуляции тяжелых металлов и устойчивости
и для получения устойчивых трансгенных растений с повышенной способностью аккумулировать
металлы, ген Escherichia coli gshii, кодирующий ГС, был активирован в цитозоле индийской
горчицы [2]. Трансгенные растения накапливали значительно больше металла, чем дикий вид:
концентрация Сd в надземных органах была выше на 25%. Тем не менее, эти растения показали
повышенную устойчивость к Сd на стадии проростков и в стадии зрелости. Аккумуляция Сd и
устойчивость коррелировала с уровнем экспрессии гена gshi. Обработанные кадмием растения
содержали большее количество глутатиона, фитохелатины, тиолов, S и Са по сравнению с диким
типом. Авторы пришли к выводу, что в присутствии Сd фермент (ГС) является лимитирующим
фактором для биосинтеза глутатиона и фитохелатины. Сверхэкспрессия ГС является перспективной
стратегией для производства растений с супер-способностями, необходимыми для фиторемедиации.
Восстановленный глутатион GSH играет важную роль в защите растений от различных стрессов.
Глутатион является не только субстратом для глутатион-S-трансферазы, нейтрализующей потенциально
токсичные ксенобиотики [3], но также является восстановителем дегидроаскорбата [4]. Более того, GSH
является предшественником фитохелатинов. Фитохелатины содержат высокий процент Цис-сульфгидрильных остатков, которые связывают и изолируют ионы в стабильных комплексах и индуцируются
такими металлами, как Сd, во всех испытанных растениях [2, 5]. Глутатион синтезируется из составляющих его АК в 2 последовательностях, АТФ-зависимая реакция катализировалась γ-глутамил-Циссинтетазой (ГЦС) и γ-глутатион-синтетазой (ГС), соответственно. Фитохелатин-синтаза последовательно
катализирует элонгацию (γ-Глу-Цис) n переносом γ -Глу-Цис-группы на глутатион или фитохелатины [6].
Манипуляция экспрессией ферментов, включающихся в синтез глутатиона и фитохелатинов,
может быть отличным подходом для повышения устойчивости растений. Фермент фитохелатинсинтаза не может являться
лимитирующим фактором для синтеза фитохелатинов из-за
конститутивной экспрессии в растениях [7] и активированием присутствием металлов (рисунок).
Гены, кодирующие ферменты, включающиеся в синтез глутатиона, являются более перспективными в
этом отношении. Лимитирующей стадией для синтеза глутатиона в отсутствие металлов является
реакция, катализируемая γ-глутамил-Цис-синтетазой, потому что активность этого фермента
регулируется глутатионом путем обратной связи и зависит от доступности Цис. Сверхэкспрессия у
E.coli гена gshi, кодирующего γ-глутамил –Цис-синтетазу повышал уровень глутатиона у тополя [4].
Более того, экспрессия у томата γ-глутамил –Цис-синтетазы может восстанавливать устойчивость
глутатион-дефицитного мутанта арабидопсиса cad2. Тем не менее, сверхэкспрессия этого гена не
повышала устойчивость к Cd дикого типа арабидопсиса.
154
В норме ГС не является лимитирующим фактором, так как содержание глутатиона не
изменяется сильно вследствие невысокой концентрации фитохелатинов. Сверхэкспрессия гена E.coli
gshii, кодирующего ГС, не увеличивала уровень глутатиона у тополя [8]. Тем не менее, в присутствии
тяжелых металлов регуляция биосинтеза глутатиона подвергается значительным изменениям. Тяжелые
металлы активируют фитохелатин-синтазу и таким образом индуцируют биосинтез фитохелатинов, в
результате чего снижается уровень глутатиона [9]. Последовательно, путем обратной связи снимается
ингибирование γ-глутамил-Цис-синтетазы глутатионом. Более того, экспрессия γ-глутамил-Циссинтетазы может повышаться тяжелыми металлами. Было продемонстрировано, что Cd увеличивает
транскрипцию гена γ-глутамил-Цис-синтетаза и дезактивирует ГС. Происходит снижение глутатиона и
аккумуляция его ингибируется γ-глутамил-Цис за счет снижения активности ГС [10]. Экспозиция
корней кукурузы в присутствии Cd вызывала снижение содержания глутатиона и накопление γглутамил-Цистеина за счет снижения активности ГС. Поэтому ГС может стать лимитирующим
фактором для биосинтеза глутатиона и фитохелатинов [11]. Сверхэкспрессия гена gshii может
увеличить содержание глутатиона и синтез фитохелатинов (рисунок 1).
В результате сверхэкспрессии гена E.coli gshii у индийской горчицы происходило увеличение
содержания глутатиона и фитохелатинов, а также увеличивалась аккумуляция Cd и устойчивость
растений. В корнях Cd-обработанных растений дикого типа содержание глутатиона было в 3 раза
ниже, чем у контрольных растений за счет увеличения синтеза фитохелатинов. трансгенных растений
по сравнению с диким типом.
В тканях трансгенных растений содержание глутатиона было одинаковым у обработанных и
необработанных растений, хотя уровень фитохелатинов в корнях и надземных органах трансгенных
растений было в 2 раза больше, чем у дикого типа.
Так как корни являются главным местом синтеза фитохелатинов, наблюдалось снижение
глутатиона у дикого типа в корнях, но не в надземных органах. Кадмий увеличивал содержание
тиоловых групп в корнях трансгенных растений в 10 раз и только в 3 раза в надземных органах, что
является лучшим объяснением устойчивости трансгенных растений как результат увеличения синтеза
фитохелатинов.
Тяжелые металлы
активирование
Фитохелатин-синтаза
активирование
Биосинтез фитохелатинов
Снижение содержания глутатиона
Синтез глутатиона
γ-глутамил-Циссинтетаза (ГЦС)
γ-глутатион-синтетаза (ГС)
Экспрессия гена gshi
(ген γ-глутамил-Цис-синтетазы)
Экспрессия гена gshii
(ген γ-глутатион-синтетазы)
Рисунок 1 – Схема регуляции синтеза фитохелатинов в растениях
155
Высокий уровень глутатиона в корнях у трансгенных растений обусловливал большую
устойчивость к кадмию. Cd-ФХ комплексируется в вакуолях с сульфидными группами. Предполагают,
что устойчивость к металлам может лимитироваться доступностью серы для Цис и синтезом
сульфидов [12]. Уровень общей серы был в надземных органах выше у Кадмий значительно снижал
концентрацию Са у диких и трансгенных растений, но сверхэкспрессия гена ГС уменьшала уровень
снижения Са в надземных органах. В корнях содержание Са не сильно различалось у трансгенных
растений и у дикого типа. Cd является блокиратором кальциевых каналов, мешает связыванию Са с
кальмодулином, белком, который регулирует активность многих ферментов и клеточных процессов
[13]. Увеличение уровня Cd-связанного пептида у трансгенных растений может снижать
эффективность кадмия на взаимодействие с кальцием.
Трансгенные растения накапливали больше Cd в надземных органах. Транслокация Cd из корней
в надземные органы по ксилеме обеспечивалась транспирационным током [14]. Чем больше Cd
связывается с фитохелатинами и запасается в вакуолях у трансгенных растений, тем меньше
подвергаются разрушению жизненно важные биохимические и физиологические процессы. Это ведет
к увеличению поверхности листьев, следовательно, большей аккумуляции Cd (как результат
увеличения транспирации).Трансгенные растения поглощают больше кадмия из-за меньшего
повреждения поверхности корней. Поглощение воды является первичным механизмом
увеличивающим движение Cd по растению [12]. Высокий уровень фитохелатинов в корнях у
трансгенных растений снижает негативный эффект Cd на поглощение воды.
Итак, манипуляция экспрессией генов синтеза глутатиона может стать одним из подходов к
увеличению фитоэкстракции тяжелых металлов и повышению устойчивости растений.
Таким образом, регуляция синтеза глутатиона способствует аккумуляции тяжелых металлов и
увеличению устойчивости трансгенных растений. Трансгенные растения позволяют увеличивать
эффективность фитоэкстракции тяжелых металлов из загрязненных сред. Манипуляция экспрессией
генов синтеза глутатиона может стать одним из подходов к увеличению фитоэкстракции тяжелых
металлов и повышению устойчивости растений.
Эффективным применением биотехнологии для восстановления окружающей среды является
биоинженерия растений, способных улетучивать ртуть из почв, загрязненных метил–ртутью. Метилртуть, сильный неотоксикант, синтезируется на ртуть-загрязненных почвах. Для детоксикации этого
токсина используют трансгенные растения арабидопсиса или табака. В них были экспрессированы
гены merB и merA. В этих модифицированных растениях merB катализировал протонолиз углеродртути, связанный с генерацией Hg2+ в менее мобильный ртуть. Последовательно, merA превращает Hg
(II) в Hg0 - летучий элемент, который выделяется в атмосферу. Хотя на западе регулирующие законы
ограничивают использование модифицированных растений merB и merA, это исследование
иллюстрирует огромный потенциал биотехнологии для восстановления окружающей среды.
Относительно законов, ограничивающих использование улетучивания ртути Bizil с сотр. (1977)
[цит. по 1] продемонстрировал, что растения с экспрессированными MerBpe (органомеркуриал-лиаза под
контролем промотора растений) может быть использована для деградации метил-ртути и последовательно
извлекать ионную форму ртути через экстракцию. Несмотря на преимущества биотехнологии, мало
известно о генетике растений гипераккумуляторов. В частности, наследуемость подобных механизмов, как
металл-транспорт и аккумуляция и устойчивость к металлам должны быть лучше поняты.
R.Chaney предлагает использовать традиционные селекционные подходы для улучшения
процессов фиторемедиации и возможно объединенных полевых тестов на металлустойчивость и
поглощение тяжелых металлов в высоко продуктивность биомассы растений. Например, Е.Р.Brewer с
сотр. (1997) генерировал соматические гибриды между T.caerulescens (Zn-гипераккумулятор) и
Brassica napus (канола), полученный гибридной селекцией для Zn-устойчивости. Были получены
гибриды с большой биомассой со сверхустойчивостью к цинку. Авторы прилагают усилия для сбора
и коллекции гермоплазмы растений-аккумуляторов [цит. по 1].
Среди большого разнообразия растений, перспективных для фиторемедиации особое внимание
заслуживает тополь (Рорulus), в силу мощной корневой системы, обладающий большой поглощающей
способностью. Многообразные генно-инженерные модификации этого растения убеждают в
целесообразности практического использования ряда полученных траисформантов. Одна из таких
работ посвящена обогащению генома тополя бактериальным геном, кодирующим синтез γглутамицистеин синтетазы (ГЦС) (К.Ф. 6.З.2.2), которая служит ключевым ферментом в процессе
биосинтеза глутатиона.
Глутатион-S-трансфераза — широко распространенный в растениях фермент, который
принимает участие как в нормальных метаболических процессах растительной клетки, так и в защите
156
растений от стрессовых ситуаций. Часто при создании трансгенных растений для фиторемедиации
мишенью является ген именно этого фермента [цит. по 1].
Если попытаться представить, каким должно быть идеальное, с экологической точки зрения,
растение, то, очевидно, картина выглядела бы следующим образом: такое растение, обладая длинной,
хорошо развитой корневой системой и сильным транспирационным током, должно интенсивно
образовывать биомассу, а эта растительная биомасса должна характеризоваться толерантностью по
отношению к органическим и неорганическим токсичным соединениям. Кроме того, такое растение в
обязательном порядке должно быстро образовывать конъюгаты и располагать соответствующим
потенциалом (емкостью) для их складирования в клеточных структурах и апопласте [цит. по 1].
Краткий обзор генно-инженерных работ, проводимых в этой области, указывает на то, что в ряде
случаев в трансгенных растениях отмечается существенное повышение детоксикационной
способности. Об этом свидетельствует тот факт, что некоторые трансгенные растения отличаются
повышенной способностью ассимиляции органических токсичных соединений и способностью
поглощения тяжелых металлов. Очевидно, эти работы будут продолжены и в ближайшем будущем и,
несомненно, результаты будут более существенными, с точки зрения их практической реализации.
1. Квеситадзе Г.И., Хатисашвили Г.А., Садунишвили Т.А., Евстигнеева З.Г. Метаболизм антропогенных токсикантов
в высших растениях. – М.: Наука. 2005. – 197 с.
2. Zhu Y.L., Pilon-Smits E.A.H., Jouanin L., Terry N. Overexpression of glutatione cynthetase in Indian mustard enhances
cadmium accumulation and tolerance // Plant Physiol. – 1999. – Vol. 119. – P. 73-80.
3. Foyer C.H., Haliwell B. The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic
acid metabolism // Planta. - 1976. – Vol. 133. – P. 21-25.
4. Marrs K. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. –
1996. – Vol. 47. – P.127-158.
5. Zenk M.H. Heavy metal detoxification in higher plants: a review // Gene. – 1996. – Vol. 179. – P. 21-30.
6. Chen J., Zhou J., Goldsbrough P.B. Characterization of phytochelatin synthase from tomato // Physiol Plant. – 1997. –
Vol. 101. – P. 165-172.
7. Steffens J.C. The heavy metal-binding peptides of plants // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1990. – V. 41. –
Pp. 553-575.
8. Foyer C.H., Souriau N., Perret S., Lelandais M., Kunert K.J., Pruvost C., Jouanin L. Over-expression of glutathione
reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees //
Plant Physiol. – 1995. – Vol. 109. – P. 1047-1057.
9. Schneider S., Bergmann L. Regulation of glutathione synthesis in suspension cultures of parsley and tobacco // Bot Acta. –
1995. – Vol. 108. – P. 34-40.
10. Rauser W.E., Schupp R., Rennenberg H. Cysteine, γ-glutamylcysteine and glutathione levels in maize seedlings.
Distribution and translocation in normal and cadmium-exposed plants // Plant Physiol. – 1991. – Vol. 97. – P. 128-138.
11. Goldbrough P.B. Metal tolerance in plants: the role of phytochelatins and metallothioneins // Phytoremediation of Trace
elements (Eds N.Terry, G.S.Banuelos). – Ann. Arbor. Press., Ann. Arbor, MI, 1998 – 386 p.
12. Cheung W.Y. Calmodulin: its potential role in cell proliferation and heavy metal toxicity // Fed. Proc. - 1984. – Vol. 43. –
P. 2995-2999.
13. Marchiol L., Leita L., Martin M., Peressotti A., Zerbi G. Physiological responses of two soybean cultivars to cadmium // J.
Environ. Qual. – 1996. – Vol. 25. – P. 562-566.
14. Petit C.M., van de Geijn S.C. In vivo measurements of cadmium (115 mM Cd) transport and accumulation in steams of
intact tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill). I. Long distance transport and local accumulation // Planta. – 1978. – Vol. 138. –
P. 137-143.
***
It was reviewed the literature in recent years about the potential use of transgenic plants to phytoremmediation soils
contaminated by heavy metals. The possibility of obtaining a number of plant transformants with increased ability to accumulate in
intracellular structures (mainly in the vacuoles) and in the intercellular space of conjugates of endogenous compounds with toxicants
was shown. Genetic engineering research works to improve the metal accumulation ability of plants are conducting intensively ,
especially in recent years. Manipulation of the expression of enzymes like as γ-glytamyl -Cys-synthetase involved in the synthesis of
glutathione and phytochelatins can be an excellent approach for improving plant resistance, as phytochelatins synthase enzyme may not
be a limiting factor for the synthesis of phytochelatins by constitutive expression in plants. Regulation of glutathione synthesis
promotes the accumulation of heavy metals and increase the tolerance of the transgenic plants. The possibility of using gene of the
enzyme glutathione-S-transferase to create transgenic plants it was shown.
***
Осы жұмыста
соңғы жылдардың əдебиеттерін қолданып, трансгендік өсімдіктерді фиторемедиацияда қолдану
мүмкіндіктері көрсетілген. Металл жинақтайтын қабілеті жоғары, металдарды клетканың ішіндегі органеллаларда
/вакуольде/ жəне клетка аралық кеңістігінде токсиканттардың жəне эндогендік қосындылардың конъюгаттары түрінде
жинақтайтын өсімдіктердің трасформанттарын алу мүмкіндіктері сипатталған. Соңғы жылдарда генді-инженерлік жұмыстар
қарқынды жүріп жатыр. Глутатион мен фитохелатиндердің синтезіне қатысатын ферменттің γ-глутамил-Цис-синтетазаның
гендерінің манипуляциясы өсімдіктердің ауыр металдарға тұрақтылығын жəне олардың металл жинақтайтын қабілетін
жоғалатуға жол береді. Фитохелатинсинтазаның синтезінің гені шектейтін факторға жатпайды, себебі ол конститутивті
болып келеді. Глутатион синтезінің реттелуі ауыр металдардың жинақталуына жəне тұрақтылығына əсер етеді. Трансгендік
өсімдік алу үшін глутатион-S-трансфераза ферментін қолдану мүмкіндігі туралы əдебиеттер келтірілген.
157
Ж.М. Басыгараев, С.А. Ибрагимова, Ə.Е. Ережепов, Ж.Б. Тулегенова, Е.Т. Абылайханов
ЦИТОКИНИН МЕДИАТОРЫНЫҢ ФИЗИОЛОГИЯЛЫҚ БЕЛСЕНДІЛІГІН БИОТЕСТ
КӨМЕГІМЕН ЗЕРТТЕУ
(Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті)
Мақалада келтірілген мəліметтер бойынша қандай да болмасын биореттегішке ең алдымен биотест арқылы
зерттеу жүргізу керек. Осы биотест арқылы биореттегішті реттегіштердің ішіндегі қай типті гормонға
жататындығын анықтауға болады. Сол себептен біз цитокинин медиаторының өсімдіктерге əсерін бірнеше биотест
арқылы зерттедік.
Биотесттің көмегімен өсімдіктердің - апикальды доминанттылық əсерін жою. Барлық
фитогормондардың ішінде тек қана цитокининнің əсерінен осы биотест орындалады. Апикальды
доминаттылық - сабақтың ең ұшындағы бүршіктің болуымен сипатталады [1,2].
Бұл бүршік өсіп тұрған жағдайда ешқандай қосымша жапырақтар мен қосымша сабақтар негізгі
сабақтан өсе алмайды. Егер жоғары ұшындағы бүршікті алып тастасақ фитогормондардың ішінде, тек
қана цитокининнің əсерімен қосымша жапырақтар мен сабақтар пайда бола алады [3,4]. Осы биотестті
жүргізу үшін біз 50 нг/мл цитокинин медиаторы бар ерітіндісімен паралонды ылғалдандырып,
паралон кесегімен ұшындағы бүршігі алынған тірі өгейбұта өсімдігінің сабағын əр күн сайын, бір рет 1
апта мерзіміндеде сүртіп отырдық.
Алынған нəтижелер 1-суретте көрсетілген. Суреттен
көргендеріңіздей 2 апта ішінде ж